Introduction
この論文の主要な焦点は、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質を用いたin vitroでの膜電位の変化の光学イメージングを実証することです。膜電位のイメージングの変化は、神経回路の活動を研究のエキサイティングな可能性を提供しています。蛍光強度の変化、膜電位の結果の変化は、カメラの各画素は、神経活動の非侵入測定を可能にする代理電極になったとき。 40年以上にわたり、有機電位感受性色素は、1-4膜電位の変化を観察するために有用でした。しかし、これらの染料は、細胞特異性を欠きます。また、いくつかの細胞型は染色が困難です。遺伝的にコードされた電圧インジケータ（GEVIs）蛍光電位感受性プローブを発現特に検討される細胞を有することにより、これらの制限を克服します。
GEVIsの3つのクラスがあります。 GEVIの最初のクラスは、VOを使用しています単一の蛍光タンパク質（FP）5-9または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ペア10-12のいずれかの電圧センシングホスファターゼからltage感知ドメイン。センサの第二のクラスは、蛍光指示薬直接13-15として、またはエレクトロクロミックFRET 16,17を介して微生物のロドプシンを使用しています。第三のクラスは、2つのコンポーネント、膜アンカーFPおよび膜結合消光染料18-20である第2の成分である遺伝的要素を利用しています。第二および第三のクラスは 、in vitroおよびスライス実験19,20 内のために有用であるが、センサーの唯一の最初のクラスは現在、in vivoでの 6を分析するのに有用です。
この報告では 、in vitroでGEVIsの最初のクラス（ 図1）を使用して、膜電位のイメージングを実証します。電圧センサのこの最初のクラスは、in vivoイメージングに移行するのが最も簡単です。 GEVIs U以来FPに融合された電圧センシングドメインは約センサのロドプシンクラスより明るい50倍されるtilizing、それらはむしろ非常に強力なレーザを必要とするよりも、アーク灯照明を用いて撮像することができます。明るさの格差の別の結果は、GEVIsの最初のクラスを簡単に脳の自家蛍光を超えることができるということです。ロドプシンベースのプローブはできません。センサの第三のクラスは、ファーストクラスと同じくらい明るいですが、in vivoで投与することが困難である化学消光剤の添加を必要とします。
我々は、したがって、単一のFP（Bongwoori）8とFRETペア（ナビ2）12からなるプローブとプローブの取得のデモンストレーションを行います。ナビ2.242とナビ2.244という名前の緑色蛍光ドナー、クローバーから成る11、および赤色蛍光アクセプター、mRuby2、 - VSFP-CR（クローバー-mRuby2電位感受性蛍光タンパク質）の蝶のバージョンでは、FRETがこのレポートで構築されています
図1.この報告書 （A） で撮像された遺伝的にコードされた電圧インジケータ（GEVIs）膜貫通電圧センシングドメインおよび蛍光タンパク質を持つGEVIベースのモノFPの二種類 。 （B）の膜貫通電圧センシングドメインで構成されるFRETベースGEVI、FRETドナーとアクセプター。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
倫理文：動物実験プロトコルは、KIST動物プロトコル2014から001に施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
1.機器のセットアップ
- イメージングセットアップ
- 防振テーブル上に倒立蛍光顕微鏡を配置します。高倍率（1.35開口数の60倍の油浸レンズ）対物レンズと電圧イメージングのために使用される蛍光タンパク質に適したダイクロイックミラーとフィルターを備えたフィルターキューブを使用してください。
注：この設定は、より高いNAの対物レンズを採用するために、倒立顕微鏡を使用していますが、直立顕微鏡を使用することもできます。実際に、倒立顕微鏡は、プローブの開発のために、より高い開口数（NA）ので、対物レンズにより雑音比（SNRに信号を改善低NAを有するものよりも多くの光を収集され、で割ったピーク光信号として説明することができますベースラインの標準偏差記録の蛍光）。非開発者のために、私たちはそのようなスライスとして、またはin vivoでの録音でのアプリケーションのための正立顕微鏡をお勧めします。 - 効率的な落射蛍光広視野イメージングのためのメカニカルシャッタを備えた光源、 例えば 、キセノンアークランプ、準備。マウントライトガイドを介して顕微鏡に光を向けます。光は、励起フィルターを通過し、フィルタキューブの第1ダイクロイックミラーによって反射されます。ビュー21の分野にわたって最大化光強度で均一に試料を照明する光の位置を合わせます。
注：より高いワット数の電球が大きくなく、明るい照明のフィールドを作成するため、伝統的に、75ワットのアークランプを使用しました。レーザーを使用することができるが、単一の波長に制限されています。 LEDが明るくなってきており、実際に選択された光源は、複数の波長を提供し、機械的なシャッターを必要としないことができます。 - fluorescに2台のCCDカメラをマウントします図2Dに示すようにレンス顕微鏡。
注：最初のCCDカメラは、高い空間分解能を有し、試験される細胞膜にGEVIを発現する細胞を同定するために使用されます。膜電位のイメージングの変更については、第2のCCDカメラは、毎秒千フレーム（FPS）などの高フレームレートを持っていることを確認してください。 2台のCCDカメラとの間に撮像経路を切り替えるためにデュアルポートカメラアダプター（ 図2D-（3））を使用してください。このセットアップでは、demagnifierは、第2のCCDカメラにおけるCCDチップ上に対物レンズからの画像を適合させるために使用されます。 - FRETベースのGEVIのイメージングのために最初の（遅い）と第二（高速）CCDカメラ間の画像スプリッタをインストールします。画像スプリッタにダイクロイックミラー（560 nm）を有するフィルタキューブと2つの発光フィルター（520nmの/ 40＆645 nmの/ 75）を挿入します。これは、2つの視野、アクセプタ蛍光を表すドナー蛍光およびその他のための1つになります。これはよ削除単一のFPでGEVIを画像化econdフィルタキューブ。
注：この方法でテストした単一のFPベースGEVIはFP、超黄道pHluorin A227D（SE A227D）を使用していますBongwooriです。励起フィルター（472ナノメートル/ 30）、発光フィルタ（497ナノメートル/ロングパス）と、ダイクロイックミラー（495ナノメートル）は、その励起および発光スペクトル5に基づいて選択しました。一般的に、励起および発光フィルタは、ダイクロイックミラーブロックの任意の励起光は発光フィルターを透過しつつ、明るい画像を取得する蛍光体の各スペクトルとの最大の重なりを持っている必要があります。 FRET 対 11ベースGEVI記録用フィルタおよびダイクロイックミラーの選択は、ドナーおよびアクセプター蛍光の同時観察用画像スプリッタで第二のフィルタキューブを必要とすることを除いて同じ原理に従います。顕微鏡フィルターボックス内に配置された第1のフィルタキューブは、クローバーの励起フィルター（475 nmの/ 23）を有する必要があります。そして、放出されたF両方のFPからluorescenceは、第1ダイクロイックミラー（495 nm）を介して第2のフィルタキューブに送信されます。第二のフィルタキューブは、ダイクロイックミラー（560 nm）をそれぞれFPは、このように二つの異なるのFPからの蛍光を分離するための2つの発光フィルタ（クローバーのための520 nmの/ 40およびmRuby2のための645 nmの/ 75）を有しています。
- 防振テーブル上に倒立蛍光顕微鏡を配置します。高倍率（1.35開口数の60倍の油浸レンズ）対物レンズと電圧イメージングのために使用される蛍光タンパク質に適したダイクロイックミラーとフィルターを備えたフィルターキューブを使用してください。
| シングルFPベースGEVI （Bongwoori） | FRETペアGEVIをベース （ナビ2.42＆ナビ2.44） | ||
| 顕微鏡に配置された第一のフィルターキューブ | 励起フィルター | 472 nmの/ 30 | 475nmの/ 23 |
| ダイクロイックミラー | 495 nmの | 495 nmの | |
| 発光フィルター | 497 nmの/ロングパス | - | |
| ビームスプリッタに配置された第2のフィルタキューブ | ダイクロイックミラー | - | |
| 発光フィルター1 | - | 520nmの/ 40 | |
| 発光フィルター2 | - | 645 nmの/ 75 |
シングルFPベースのGEVIとFRETベースGEVIレコーディングに使用し、表1つの異なるフィルターセット
- 振動絶縁
- 防振テーブル上のコンポーネントを移動すると、任意の機器をマウントしないでください。非絶縁機器に接続されたケーブルは、試料の振動を避けるために緩んでいることを確認してください。
- パッチクランプ室
- 対物レンズの作動距離が比較的小さいので、薄い＃0のカバーガラスをパッチクランプ室の底部を密封します。これは、倒立顕微鏡のセットアップの欠点です。
注：高NA対物レンズを有することのトレードオフとしては、作動距離が減少します。 SPECIMを配置するために非常に短い作動距離内のアンは、カバーガラスとカバーガラス（ステップ2）は、可能な限り薄くする必要があります。
- 対物レンズの作動距離が比較的小さいので、薄い＃0のカバーガラスをパッチクランプ室の底部を密封します。これは、倒立顕微鏡のセットアップの欠点です。
- 温度制御
- 浴溶液は33°Cの実験を通して周りのパッチを適用し、細胞を維持するために温度制御装置を通って流れることを確認してください。
- 機器の接続
- パッチクランプアンプと高速のCCDカメラのバヨネットニール・Concelman（BNC）コマンドボックスに光源のメカニカルシャッターを接続します。これは、アンプ、カメラ、および同時に光源を制御するために、イメージングソフトウェアを使用可能にします。
注：電気的およびイメージング構成要素は、電気的活動の同時電気的および光学的記録を提供するために同期される必要があります。
- パッチクランプアンプと高速のCCDカメラのバヨネットニール・Concelman（BNC）コマンドボックスに光源のメカニカルシャッターを接続します。これは、アンプ、カメラ、および同時に光源を制御するために、イメージングソフトウェアを使用可能にします。
図2.装備光路次GEVIsと電圧イメージング用メント設定ワークフロー、（A）75Wキセノンアークランプ、（B）アークランプからの励起光は、励起フィルターにより濾過し、次いでそれが到達する前に、第1のダイクロイックミラーで反射され試料ステージ、右上の挿入図は、低速のCCDカメラは、細胞パッチクランプの両方の選択を助けるために使用される全セル構成、（C）、（D）画像取得部を示す図です。 （1）高速CCDカメラ、（2）の両方のために画像スプリッターがペアとモノFP GEVIs、（3）高速CCDカメラ内のCCDチップ上に画像に合わせてdemagnifierを、（4）デュアルポートFRETイメージング経路を切り替えるためのカメラアダプターとパッチへの細胞の同定のための高空間分解能を持つ（5）低速CCDカメラ、（E＆F）のシングルFPベースGEVI（E）とFRETベースのGEVIと画像取得（F）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
GEVIsの2式
- ヒト胚腎臓293細胞における
- 培養ヒト胚性腎臓293（HEK 293）CO 2インキュベーター（5％CO 2）で37°Cの 、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で細胞。 100ミリメートルの直径と20ミリメートルの高さを持つ組織培養皿を使用してください。 2×10 3で培養を開始- 6×10 3細胞/ cm 2と、彼らはその後のトランスフェクションのための80〜90％の集密度に達するまでインキュベートします。
- トランスフェクションの日に、細胞培地を吸引し、穏やかにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で一回洗浄します。 、1-2分間、0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いてHEK293細胞を分散させた溶液を吸引し、静かにCを分離するために皿の側面をタップells。新鮮なDMEM（10％FBS）を加え、ピペッティングにより凝集した細胞を解離します。血球計数器を用いて、細胞濃度を決定します。
- 0.08置き - 厚さ0.13ミリメートル、直径10mmを、24ウェル組織培養プレート中のポリ-L-リジンで予め被覆したカバースリップ。 1×10 5細胞/ cm 2の細胞密度でカバースリップ上のHEK293細胞をシード。
注：HEK 293細胞は、互いにギャップ結合を形成することができるので、シード番号は、単離された細胞を生成する必要があります。 - 一過製造者の指示に従ってリポフェクション試薬を使用してGEVIをコードする適切な遺伝子構築物で細胞をトランスフェクトします。
注：バックボーンベクターとして、この手順を利用するpcDNA3.1（Bongwoori）とpUB2.1（ナビ2.242）に使用される遺伝子構築物を。 DNAの量は、各カバースリップのために100ngた使用しました。しかしながら、トランスフェクション条件は、各GEVIを試験するために実験的に決定する必要があります。
- 解離したマウスのヒップpocampal一次ニューロン
- 胎生17日目C57BL6 / Nマウスから海馬を解剖し、以前に22,23を説明したように、次に海馬神経細胞を解離します。
- プレートの厚さのポリ-D-リジンコート0.08〜0.13ミリメートル、1×10 5細胞 / mlの細胞密度で直径10mmのカバースリップ上に解離したニューロン。 CO 2インキュベーターを37 O Cで細胞をインキュベートする（5％CO 2）。
- 以前24に記載されているように 、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬を使用してGEVIをコードする遺伝子構築物を用いてインビトロ（DIV） で 7日- 6で一過性解離ニューロンをトランスフェクトします。
注：バックボーンベクターとして、この手順を利用するpcDNA3.1（Bongwoori）とpUB2.1（ナビ2.244）に使用される遺伝子構築物を。使用されたDNAの量は、各カバースリップのために1μgのでした。再び、トランスフェクション条件は、試験した各GEVIために経験的に決定する必要があります。
- IMAを電圧に先立って発現レベルを確認してくださいエージング
- CO 2インキュベーターから組織培養プレートを取り、落射蛍光顕微鏡下でトランスフェクションした細胞からの蛍光を観察します。
- 膜からの蛍光を確認した後、セクション3の電圧イメージングのためのパッチ適用チャンバにカバースリップを転送します。
注：電圧イメージングは16で行われる - 24時間後、トランスフェクションを。異なる蛍光タンパク質は異なる成熟時間を持っているようしかし、いくつかのGEVIsは、トランスフェクション後でより多くの時間を必要としています。例えば、このプロトコルでmRuby2を含むFRETペアはmRuby2の成熟がクローバー11よりも大幅に時間がかかりますので、表現するために時間がかかることがあります。ドナーとアクセプターの両方の蛍光をチェックする必要があります。
3.電圧イメージングプロトコル
- 良好な膜発現で健康な細胞を選択してください
- 顕微鏡を使用して、それは強く示して健康な細胞（ 図4B）を見つけます内部蛍光に比べ、膜局在する蛍光。丸みを帯びた細胞にパッチを適用しないようにしてください。円形細胞はいずれかの除または瀕死とパッチに困難です。その後のパッチクランプ実験を助けるために、期間中に振幅と5.0ミリ秒で5.0 mVでの試験パルスを適用します。
- 電圧イメージングのための細胞を調製します
- パッチへのセルを選択した後、セルの上のパッチクランプピペットを配置します。それは静かに細胞膜に接触するまでピペットを停止します。パッチクランプソフト 25上の膜抵抗の2MΩ上昇-このステップでは、1MΩを観察します。
注：時々、良いギガオームシールは、細胞膜に触れるだけで簡単に発生する可能性があります。限りギガオームシールが安定しているとして、それがOKであるべきです。 - 静かにピペットを介して負圧を適用することにより、ギガオームシールを確立します。希望の保持電位でのピペット電位を設定します。
- ギガオームシール、番目の画像を維持しながら、Eの高速CCDカメラを用いた細胞及び膜領域に焦点を当てます。
- 全細胞構成26を作るために穏やかに口またはシリンジによる吸引のパルスを印加することによって、細胞膜を破裂。
- 画像パッチは、イメージングソフトウェアを使用して実験計画に従って全細胞クランプコンフィギュレーションの下で細胞をクランプ
- イメージングソフトウェアを起動します。 「CCD ACQUIRE」ページを開くために[SciMeasureカメラ]メニュー - [ACQUIRE]をクリックしてください。
- 画像を保存するための新しいデータファイルを作成します。
- [アナログ出力]をクリックし、イメージングを行うために、パルス・プロトコル・ファイルを開くために[ASCIIを読みます]。データを平均化する必要がある場合は、 '内部の繰り返しの平均」をクリックします。そして、「アナログ出力」のページを閉じます。
注：このパルスプロトコルは設計されており、この工程の前に、各実験の目的に応じて.txtが 'ファイルとして保存する必要があります。 - 特定のアキを設定します「CCD ACQUIRE」ページからitionパラメータ。入力」取得のためのフレームの数」と「試行回数」のための具体的な値。
注：フレーム数取得の速度及びパルスプロトコルのタイミングによって決定されます。例えば、画像化は、1kHzで1000フレームは、記録時間の1秒に等しい場合。 - 録音を開始するボタン[（光学+ BNC）データを取得]をクリックします。電圧画像化が行われている間、記録の全体にわたって安定した全細胞構成を保証するために、パッチクランプソフトウェアオシロスコープ画面を見ます。
注：GEVIの応答電圧範囲をテストするには、ΔF/ F値または生理的な電圧範囲にわたって時間分解能での信号の大きさ、-170 mVのから130 mVの範囲の階段状の電圧パルスを有するパルスプロトコルで全細胞電圧クランプ実験を行います。培養プリマから誘発活動電位の解決にGEVIの性能を決定するために、RYニューロン、画像全体セル電流クランプ構成の下のセル。
- パッチへのセルを選択した後、セルの上のパッチクランプピペットを配置します。それは静かに細胞膜に接触するまでピペットを停止します。パッチクランプソフト 25上の膜抵抗の2MΩ上昇-このステップでは、1MΩを観察します。
4.データ集録
- ΔF/ Fの計算
- イメージングソフトウェアを起動します。分析すべきデータファイルを開くには、[データの読み取りファイル] - [ファイル]をクリックしてください。右側にその静止光強度（RLI）で細胞画像を観察
注：記録のRLIを決定するためのソフトウェア平均値最初の5フレームを。 - 画面に測定された電流値と電圧値をもたらすために「ショーのBNC」をクリックします。
- 応答光信号を有するピクセルを識別するために、フレーム減算機能を利用するには、「フレーム減算 'に' RLIフレーム」からページモードを変更します。すべてのピクセルは、蛍光の潜在的な変化を調べることができるので、これはイメージングの真の力です。
- 減算のための2つの時点（F 0とF 1）を選択します。あるセルのどの領域識別膜電位の変化に応じた信号を示します。
注：フレーム差分画像のSNRは、時間的に信号を平均化するために各時点で複数のフレームを選択することによって改善することができます。ソフトウェアは、選択したフレームから取られた平均光強度を減算し、F 1 -F 0値（ΔF）を算出します。通常、1つは、刺激期間中に採取保持電位と他の時点で取得された時点を選択します。 - コンピュータマウスを用いて、各ピクセルをドラッグするか、クリックすることによって分析する必要がある画素を指定します。ソフトウェアウィンドウの左側に選択されたピクセルからの平均蛍光強度のグラフ表示を守ってください。4（b）＆（b）は、フレーム間差分解析から、代表的な画像を示しています。
- RLI（F 0）を差し引いたピクセルを分割します。 ΔF/ F値を取得するために[別RLI除算]をクリックしてください
- イメージングソフトウェアを起動します。分析すべきデータファイルを開くには、[データの読み取りファイル] - [ファイル]をクリックしてください。右側にその静止光強度（RLI）で細胞画像を観察
- データを出力
- 「ショーのBNC」メニューをunclickingによって電流と電圧のグラフを削除してください。 [OUTPUT]に移動します - [（ASCII）表示されているようにトレースを保存]の標準的なグラフ作成ソフトウェアでカーブフィッティング解析のためのASCIIファイル形式で蛍光トレースをエクスポートします。
5.データ解析
- GEVIの電圧センシングプロパティ
- データ解析プログラムに電圧対ΔF/ F値をプロットすることにより、電圧グラフ（FV）に対する蛍光変化を描画します。 [フィッティング] - - [シグモイドフィット] - [開く]ダイアログ]、その後、ボルツマン関数を選択し、[分析]をクリックすることで、光信号の電圧範囲を決定するために、ボルツマン関数（ 表2）に曲線をフィット。
注意：関数にフィッティングことがpossiblになります異なる電圧プローブの電圧検出特性を特徴づけるために、または異なる細胞におけるそれらの性能を比較するために、E。これらのプローブからのFV曲線はS字状のパターンを示すため、ボルツマン関数は、この論文で試験されたプローブのために使用することができます。 - 機能により算出された初期値と最終値（1および2）を用いて各ΔF/ F値を正規化します。
注：ボルツマン方程式では、最小値は1、最大値は2です。正規化のために、1のようにゼロとして1と2を定義することにより、ΔF/ F値を調整するためにスプレッドシートアプリケーションソフトウェアを使用しています。正規化されたΔF/ F値を平均し、統計分析のための標準誤差を計算します。 - 以前のセクション5.1.1で説明したように）電圧対正規化されたΔF/ F値を再プロット。
- データ解析プログラムに電圧対ΔF/ F値をプロットすることにより、電圧グラフ（FV）に対する蛍光変化を描画します。 [フィッティング] - - [シグモイドフィット] - [開く]ダイアログ]、その後、ボルツマン関数を選択し、[分析]をクリックすることで、光信号の電圧範囲を決定するために、ボルツマン関数（ 表2）に曲線をフィット。
- 光学応答速度
- データ分析とステップ4.2.2から取得したASCIIファイル）を開きますプログラムと時間に対するΔF/ Fトレースをプロットします。
- データ解析ソフトの「データ選択」をクリックして、階段状の電圧パルスの開始と光信号が定常状態に到達した第2時点に対応する時点を選択します。クリックすることで、単一および二重指数減衰関数の両方にこの範囲を合わせる[分析] - [フィッティング] - [指数フィット] - [開く]ダイアログ]、および指数関数的減衰機能を選択します。より良いフィット感を報告します。
注：単一または二重指数関数的減衰関数に当てはめることにより、τで表される定量化時定数を取得することができます。これは、実験者が異なる電圧インジケーターで行われ、その測定値の動態を比較するのに役立ちます。蛍光トレースは二重指数減衰関数を用いて記述することができ、高速と低速のコンポーネントが表示される場合があります。この場合、計算は、異なる振幅を有する2つの時定数をもたらします。 - 目を計算します電子加重τ定数は、単一成分でプローブに2時間成分を示すプローブの動態を比較しました。
注：以下の式で定義されるように重み付けタウは、相対的な振幅を乗じτ1の合計として計算1、プラスτ2は、相対振幅を乗じ、2れます。
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Representative Results
一過性にトランスフェクトされた細胞は、有意な蛍光強度の変化と原形質膜発現の程度を示すことができます。でも同じカバースリップ上でいくつかのセルは、内部蛍光のレベルを変化させる必要があります。これは、細胞によって吸収されるトランスフェクション剤の使用量が最も可能性が高いです。時折、あまりにも多くの式は（明るい、高い内部蛍光で、細胞を四捨五入）細胞がアポトーシス27で得られた小胞体ストレス応答を体験させます。実験者は、したがって、内部表現は、信号対雑音比（SNR）を低下させる非反応性蛍光を生成するので、できるだけ内部蛍光明るい細胞および薄暗い細胞の両方をテストするために警告されます。
もう1つの考慮事項は、発色団の成熟速度である。 図3は、アクセプターchromophの蛍光の格差を示していますドナー発色団（クローバー）より長い熟成時間を持つ鉱石（mRuby2）。
HEK 293細胞を、図3共焦点画像を一過FRETベースGEVI、でトランスフェクトNabi2.242。（A）（B）の潜在的な結果を示す共焦点画像をFRETドナーおよびアクセプターからの膜局在化の蛍光を示したHEK細胞の共焦点画像mRuby2の遅い成熟。すべての4つのセルが2つだけの展示mRuby2蛍光ながらクローバーの蛍光を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
画像は、共焦点顕微鏡によって取得しました。 FRETドナーについては、クローバー、488 nmのレーザー励起に使用し、発光はCAPTましたuredで50分の525 nmのバンドパスフィルタ。 FRETアクセプター、mRuby2は、561 nmの励起用レーザーと50分の595 nmのバンドパスフィルターを用いて照射し、発光のために使用しました。共焦点イメージングのためのサンプルは、リン酸緩衝生理食塩水pH7.4で調整し、次いで、抗フェード試薬を搭載中の4％パラホルムアルデヒド/スクロース溶液で固定しました。
トランスフェクション条件を最適化したら、変動の次のソースを分析する関心領域を決定することから来ます。最高蛍光変化でセルの領域を同定するためにフレーム差分を使用すると、多くの場合、ΔF/ F値を最大化するために使用されます。代替的には、細胞からの光を受光する画素の全てを選択することです。これは、ノイズの低減をもたらす画素数を増加させるが、非応答内部蛍光が含まれているので、信号の大きさを減少させます。どちらの方法であれば、実験者が一貫したままとして罰金です。
シングルFPベースGEVI図4.電圧イメージング発現しますHEK293細胞および海馬一次ニューロン。高速CCDカメラを1 kHzで記録された階段状の電圧パルスに対する応答を示す単一のFPベースGEVI、Bongwooriの（A）ΔF/ Fトレース、インチ（B）高速CCDカメラで撮像されたHEK 293細胞。 Bongwoori＆（ 右 ）蛍光変化が観察されたピクセルを示すフレームサブトラクション画像を発現する細胞の（ 左 ）安静時光強度（RLI）。 （C）Bongwooriを発現するマウス海馬初代神経細胞から誘導された活動電位の光学記録。活動電位は、全細胞電流クランプモードで誘発されました。 ΔF/ Fトレースはソーマに相関画素から選択された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
代表FLUOドナーとアクセプター発色団のrescence読み出しは、図5Aに示されています。レシオメトリック分析を可能とするドナーおよびアクセプターが相関雑音源、 例えば 、動きを低減するための蛍光変化の極性が逆です。例えば、動き相関ノイズは両方のドナーおよびアクセプター蛍光のために同じ方向に蛍光の変化を示すであろう。 FRETベースのプローブはレシオメトリックイメージングが可能であるが、それは唯一の明るい発色団を分析するほうが良い場合が多いです。調光発色団は、実質的に記録のノイズを増加させることができるからである。 図5Bは 、この効果を示しています。光信号がセル内にある明るいクローバーから、図5（b）のフレーム減算は明確に示しています。これとは対照的に、mRuby2蛍光のフレーム減算は、細胞全体にノイズの高い程度を示しています。したがって、クローバーの唯一のドナー信号がFIの海馬ニューロンに示されていますグレの5C。
GEVI基づくFRET図5.電圧イメージングは、HEK293細胞および海馬初代神経細胞で発現させることができる。（A） 高速CCDカメラを1 kHzで記録された階段状の電圧パルスには2つの波長での応答を示すFRETベースGEVI、Nabi2.242のΔF/ Fトレース。 （B） トップ 。ドナー（クローバー-RLI、クローバーフレーム減算）とアクセプター（mRuby2-RLI、mRuby2フレーム減算）各FP、 ボトムための2つの異なるしきい値と処理された画像。同じしきい値はmRuby2の相対的な薄暗さを説明するために、ドナー（クローバー-RLI、クローバーフレーム減算）とアクセプター（mRuby2-RLI、mRuby2フレーム減算）画像の両方のために使用しました。すべての画像はNabi2.242を発現する同じHEK 293細胞から採取しました。 （C）520nmの波長TRNabi2.244センサーを発現するマウス海馬初代神経細胞から誘導された活動電位のエース。 ΔF/ Fトレースはソーマに相関画素から選択された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ΔFとΔF/ F 値に対する 変光レベルの図6.帰結 。（A）単一のFPベースGEVI、Bongwooriを発現しているHEK 293細胞の画像は、一休みする光強度に示す（RLI）、（B）蛍光トレース示すカーネル平均 、明るい内部蛍光を有する領域：よくローカライズされた蛍光シグナルを有する膜領域、領域2：ΔF三つの異なる地域、領域1からの値（Fは-F 0 X）D領域3：光信号から離れた領域、（C）は 、カーネルを示す蛍光トレースは、（B）に、同じ地域からΔF/ F値を平均し、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| コンセプト | 方程式 | リマーク |
| フラクショナル蛍光変化（ΔF/ F） |  | 時点で測定F 1 =光強度は、F 0 =光強度は保持電位で測定 |
| ボルツマン関数 |  | Y mV単位=ΔF/ F、V =膜電位、V 1/2は半最大ΔF/ F、AのmV単位膜電位であります |
| 二重指数減衰関数 | Y = Y 0 + 1 E - （トン-トン0）/τ1 + 2 E - （トン-トン0）/τ2 | τ1、τ2 =時定数、1、2 =振幅、T、T 0 = 2つの時点では、Y 0 =オフセット |
表2.式
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Discussion
神経系は、いくつかの異なる方法で電圧を使用して、阻害は、シナプス入力がわずかな脱分極および比較的大きな電圧変化における活動電位の結果を引き起こし、若干の過分極を引き起こします。 GEVIsによって膜電位の変化を測定する能力は、同時に神経回路のいくつかの成分を分析の有望な可能性を提供しています。この報告書では、GEVIsを使用して、膜電位のイメージングの変更のための基本的な方法を示しています。
電圧のイメージングの変化のための主要なキーは、原形質膜中のGEVIの効率的な発現です。細胞内発現は、プローブのSNRを低減し、応答しない蛍光を作成します。トランスフェクション条件を最適化することは非常に光学測定の一貫性を向上させます。小説GEVIをテストするとき確かに、また、光学活性の差は全くNEに起因していることを確認するために知られているプローブをテストすることをお勧めしますワットプローブと細胞のない条件。
図6は 、電圧イメージングの感度を低下させるのに内部蛍光の影響を示しているΔF/ F値。 図6Bは、ΔFは、シングルFPベースGEVI、Bongwooriを発現するHEK細胞を値を示しています。トレース2は比較的明るい内部蛍光は、 図6Aに見られる領域2（青色）から来ています。トレース1.しかし、 図6BのトレースがΔF/ F値のRLI値で割った図6Cに 、トレース2が原因でΔF/ Fを減少させ、明るい内部蛍光に著しく低下としてこのトレースは、ΔF値の同様のレベルを持っています値。蛍光トレース3は、非常に小さいΔFを持っているだけでなく、非常に小さなRLI値（F）を有しています。その結果、記録のノイズの実質的な増加を有する紛らわしいΔF/ F信号です。この例は、ΔFを実証するために含まれていました重要。 Fで始まることは非常に低い場合ΔF/ Fに大きな変化は有用ではありません。
画像スプリッタの使用は、単一のCCDカメラ上に二つの波長の同時測定を可能にします。これは、大幅プローブ開発のためのFRETに依存する蛍光変化の測定を支援し、セットアップのコストを削減します。しかし、色収差に起因し、これら2つの画像がアポクロマート対物レンズの必要性を必要とやや焦点外となります。だから最高の開口数の目標を選択するより多くの光より良いSNRが、また蛍光イメージングを向上させます。また、一方がSNRを増加させるために、発光ダイオード（LED）又はレーザのようなより強力な光源を使用することができます。 LEDは、メカニカルシャッターを必要としません。
この報告では、単一のFP GEVIとFRETベースのGEVIからの光信号を示しています。 FRETベースGEVIの主な利点は、レシオメトリックイメージングは、相関雑音dの低減を可能にすることですin vivoでの呼吸や血液の流れにUE。蛍光シグナルの逆の極性は、膜電位の実際の変化を確認します。 2発色団の蛍光強度は、多くの場合、大幅に異なるので、SNRも変化します。これはレシオメトリック分析を混乱させるし、その有用性28を制限しています。また、FRET-独立した信号29が存在する場合があります。膜電位の変化を分析するためにFRETを使用する場合にのみ、明るい蛍光発色団を使用することが時々良いです。
電圧画像化は、カルシウムフラックスを測定するカルシウムイメージングに比べて膜電位の変化の速度およびばらつきに起因するカルシウムイメージングよりも困難です。膜カルシウムイオンフラックスに比べて非常に速い時間スケールでの電位変化、およびニューロンにおけるサブスレッショルドイベントは、カルシウムイメージング30を用いて測定することができません。また、電圧プローブは、細胞膜に存在する必要があります膜電位の光学的にレポート変更に使用可能なプローブの量を減少させる効果があります。その結果、実際にCCDチップに到着することができます光子の数は比較的少ないです。これは、高い量子効率および膜電位の変化の際に高いSNRを誘発するプローブと、高速かつ低読み出しノイズカメラの必要性を必要とします。 インビトロで細胞を画像化することにより、研究者はより良いin vivoでの測定で試みる前にGEVIsの潜在的な利点と落とし穴を理解します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
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