Introduction
El principal objetivo de este trabajo es demostrar la formación de imágenes ópticas de los cambios en los potenciales de membrana in vitro utilizando proteínas fluorescentes genéticamente codificados. cambios de imagen en el potencial de membrana ofrece la excitante posibilidad de estudiar la actividad de los circuitos neuronales. Cuando los cambios en el potencial de membrana resultado en un cambio de intensidad de fluorescencia, cada píxel de la cámara se convierte en un electrodo de sustituto que permite mediciones no intrusivas de la actividad neuronal. Durante más de cuarenta años, los colorantes orgánicos sensibles al voltaje han sido útiles para la observación de los cambios en el potencial de membrana 1-4. Sin embargo, estos colorantes carecen de especificidad celular. Además, algunos tipos de células son difíciles de teñir. indicadores de tensión codificados genéticamente (GeViS) superar estas limitaciones por tener las células a ser estudiadas específicamente expresan la sonda fluorescente sensible al voltaje.
Hay tres clases de GeViS. La primera clase de GEVI utiliza la voDominio de la fosfatasa de detección de voltaje ltage de detección, ya sea con una proteína única fluorescente (FP) 5-9 o una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) 10-12. La segunda clase de sensores utiliza rodopsina microbiana como un indicador fluorescente directamente 13-15 o por medio de FRET electrocrómico 16,17. La tercera clase utiliza dos componentes, el componente genético de ser una membrana anclada FP y un segundo componente que es un colorante unido a la membrana de temple 18-20. Mientras que las clases segunda y tercera son útiles para los experimentos in vitro y rebanada 19,20, sólo la primera clase de sensores son actualmente útil para los análisis in vivo 6.
En este informe vamos a demostrar la proyección de imagen del potencial de membrana utilizando la primera clase de GeViS (Figura 1) in vitro. Esta primera clase de sensores de voltaje es el más fácil hacer la transición a imágenes in vivo. Desde GeViS utilizing un dominio de detección de voltaje fusionado a un FP son aproximadamente 50 veces más brillante que la clase de sensores rodopsina, que se pueden visualizar utilizando la iluminación de la lámpara de arco en lugar de requerir un potente láser. Otra consecuencia de la disparidad en el brillo es que la primera clase de GeViS puede superar fácilmente la auto-fluorescencia del cerebro. Las sondas basadas en la rodopsina no puede. La tercera clase de sensor es tan brillante como la primera clase, sino que requiere la adición de un inhibidor químico que es difícil de administrar in vivo.
Nosotros, por lo tanto, demostrar la adquisición de una sonda con una sola FP (Bongwoori) 8 y una sonda que consiste en un par de FRET (Nabi 2) 12. El FRET construye en este informe son versiones de mariposa VSFP-CR (proteínas fluorescentes sensibles al voltaje - Trébol-mRuby2) 11 que consta de un donante fluorescente verde, trébol, y un aceptor fluorescente de color rojo, mRuby2, llamado Nabi 2.242 y 2.244 Nabi 
Figura 1. Dos Tipos de indicadores codificados genéticamente Tensión (GeViS) con imágenes formadas en este informe (A) Un mono FP basado GEVI que tiene un dominio de detección de voltaje transmembrana y una proteína fluorescente. (B) Un GEVI basado FRET compuesto por un dominio de detección de voltaje transmembrana, un donante de FRET y aceptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Declaración de Ética: El protocolo de experimentación animal fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el animal protocolo ICCT 2014-001.
1. Configuración del equipo
- configuración de imagen
- Coloque un microscopio de fluorescencia invertido en una mesa de aislamiento de vibraciones. Utilice un gran aumento (60X lente de inmersión en aceite con apertura numérica 1,35) lente objetivo y un cubo de filtro equipado con un espejo dicroico y filtros adecuados para las proteínas fluorescentes utilizados para la formación de imágenes de tensión.
Nota: Esta configuración utiliza un microscopio invertido con el fin de recurrir a los objetivos con mayor NA, pero microscopios verticales también se puede utilizar. De hecho, el microscopio invertido es sólo para el desarrollo de la sonda ya que una mayor apertura numérica (NA) de lente de objetivo recoge más luz que la que tiene un bajo NA mejorando así la relación señal a ruido (SNR; puede ser descrito como la señal óptica de pico dividido por el desviación estándar de la línea de basefluorescencia) de la grabación. Para los no desarrolladores, recomendaríamos un microscopio vertical para aplicaciones tales como división o en grabaciones in vivo. - Preparar una fuente de luz, por ejemplo., Lámpara de arco de xenón, equipado con un obturador mecánico para epifluorescencia eficiente de formación de imágenes de campo amplio. Dirigir la luz al microscopio a través de una guía de luz de montaje. La luz pasará a través del filtro de excitación y es reflejada por el primer espejo dicroico en el cubo de filtro. Alinear la luz para iluminar la muestra de manera uniforme con la intensidad de luz maximizada sobre el campo de visión 21.
Nota: Tradicionalmente, se utilizó una lámpara de arco de 75 vatios desde mayores bombillas potencia crean más grande pero no campos de iluminación brillantes. Los láseres pueden ser usados, pero están restringidas a una sola longitud de onda. LED son cada vez más brillante y de hecho pueden ser la fuente de luz de elección que ofrece múltiples longitudes de onda y que no requieren un obturador mecánico. - Montar las dos cámaras CCD a la FLUORESCmicroscopio ENCE como se muestra en la Figura 2D.
Nota: La primera cámara CCD tiene una alta resolución espacial y se utiliza para la identificación de una célula que expresa el GEVI en la membrana de plasma a ensayar. Para los cambios de imagen en el potencial de membrana, asegúrese de que la segunda cámara CCD tiene una alta frecuencia de imagen, tales como 1.000 cuadros por segundo (fps). Utilice un adaptador de cámara de doble puerto (Figura 2D (3)) para cambiar la vía de formación de imágenes entre las dos cámaras CCD. En esta configuración, una como reductor se utiliza para ajustar la imagen de la lente objetivo en el chip CCD en la segunda cámara CCD. - Instalar un divisor de imagen entre la primera (lento) y segunda cámaras CCD (rápido) para obtener imágenes de GEVI a base de FRET. Inserte un cubo de filtro que tiene un espejo dicroico (560 nm) y dos filtros de emisión (520 nm / 645 nm y 40/75) en el divisor de imagen. Esto dará lugar a dos campos de visión, una para la fluorescencia del donante y el otro representa la fluorescencia del aceptor. Quitar este segundo cubo de filtro cuando la imagen de una GEVI con una sola FP.
Nota: El único GEVI basado FP probado en este método es Bongwoori que utiliza el FP, super eclíptica pHluorin A227D (SE A227D). El filtro de excitación (472 nm / 30), filtro de emisión (497 nm / pase de largo) y el espejo dicroico (495 nm) se seleccionaron en base a su espectro de excitación y emisión 5. En general, los filtros de excitación y emisión deben tener la coincidencia más grande con cada espectro del fluoróforo para adquirir una imagen brillante mientras que los bloques de espejos dicroicos cualquier luz de excitación transmitida a través del filtro de emisión. La selección de filtros y espejos dicroicos para la grabación GEVI basado FRET par 11 sigue el mismo principio, excepto que requiere un segundo cubo de filtro en el divisor de imagen para la observación simultánea de donante y aceptor de fluorescencia. El primer cubo de filtro colocado en la caja del filtro microscopio necesita tener un filtro de excitación (475 nm / 23) para Clover. A continuación, la emitida fluorescence de ambos programas marco se transmite al segundo cubo de filtro a través de la primera espejo dicroico (495 nm). El segundo filtro de cubo tiene un espejo dicroico (560 nm) y dos filtros de emisión (520 nm / 40 de Clover y 645 nm / 75 para mRuby2) para cada FP separando así la fluorescencia de dos diferentes programas marco.
- Coloque un microscopio de fluorescencia invertido en una mesa de aislamiento de vibraciones. Utilice un gran aumento (60X lente de inmersión en aceite con apertura numérica 1,35) lente objetivo y un cubo de filtro equipado con un espejo dicroico y filtros adecuados para las proteínas fluorescentes utilizados para la formación de imágenes de tensión.
| GEVI única basada FP (Bongwoori) | FRET basado GEVI par (Nabi Nabi 2.42 y 2.44) | ||
| En primer cubo de filtro colocado en el microscopio | filtro de excitación | 472 nm / 30 | 475 nm / 23 |
| espejo dicroico | 495 nm | 495 nm | |
| filtro de emisión | 497 nm / pase largo | - | |
| Segundo cubo de filtro colocado en el divisor de haz | espejo dicroico | - | |
| 1 filtro de emisión | - | 520 nm / 40 | |
| filtro de emisión 2 | - | 645 nm / 75 |
Tabla 1. Dos Diferentes conjuntos de filtros usados para una GEVI FP base individual y una de FRET a base GeVi Grabaciones
- aislamiento de vibraciones
- No montar cualquier equipo con componentes en movimiento en la tabla de aislamiento de vibraciones. Asegúrese de que los cables que están conectados a equipos que no están sueltos aislado para evitar la vibración de la muestra.
- cámara de patch clamp
- Sellar el fondo de la cámara de patch clamp con una fina # 0 cubierta de vidrio ya que la distancia de trabajo del objetivo es relativamente pequeña. Esto es una desventaja de la configuración de microscopio invertido.
Nota: Como un compromiso de tener un lente objetivo NA alta, la distancia de trabajo disminuye. Para colocar el uestraes dentro de la distancia de trabajo muy corto, el cristal de la cubierta y el cubreobjetos (paso 2) tiene que ser lo más fina posible.
- Sellar el fondo de la cámara de patch clamp con una fina # 0 cubierta de vidrio ya que la distancia de trabajo del objetivo es relativamente pequeña. Esto es una desventaja de la configuración de microscopio invertido.
- Control de temperatura
- Asegúrese de que la solución del baño fluye a través de un controlador de temperatura para mantener las células patched alrededor de 33 ° C durante todo el experimento.
- Las conexiones del equipo
- Conectar el amplificador de patch clamp y el obturador mecánico de la fuente de luz a la caja de comando Bayoneta, Neill-Concelman (BNC) de la cámara CCD de alta velocidad. Esto permitirá que el software de imágenes para controlar el amplificador, la cámara y la fuente de luz al mismo tiempo.
Nota: Los componentes eléctricos y de formación de imágenes tienen que ser sincronizados con el fin de proporcionar para las grabaciones eléctricas y ópticas simultáneas de actividad eléctrica.
- Conectar el amplificador de patch clamp y el obturador mecánico de la fuente de luz a la caja de comando Bayoneta, Neill-Concelman (BNC) de la cámara CCD de alta velocidad. Esto permitirá que el software de imágenes para controlar el amplificador, la cámara y la fuente de luz al mismo tiempo.
Figura 2. EquipoConfiguración ción de Imagen de tensión con GeViS El flujo de trabajo a raíz de la trayectoria de la luz, (A) lámpara de arco de xenón de 75W, (B) la luz de excitación de la lámpara de arco es filtrada por el filtro de excitación y luego se refleja en el primer espejo dicroico antes de que llegue a la platina, un recuadro en la esquina superior derecha muestra toda la configuración de la celda, (C) la cámara CCD de baja velocidad se utiliza para ayudar tanto en la elección de una abrazadera de células y el parche, (D) la parte de adquisición de imágenes; (1) la cámara de alta velocidad CCD, (2) el divisor de imagen tanto para FRET vincular y mono FP GeViS, (3) el como reductor para ajustar la imagen en el chip CCD de la cámara CCD de alta velocidad, (4) la doble puerto adaptador de cámara para cambiar la vía de formación de imágenes y (5) la cámara CCD de baja velocidad con una alta resolución espacial para la identificación de la célula para parche, (e & F) la adquisición de la imagen con un GEVI base de un solo FP (e) y un GEVI basados en FRET(F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Expresión de GeViS
- En las células embrionarias de riñón humano 293
- Cultivo embrionario de riñón humano 293 (HEK 293) células con medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una incubadora de CO 2 (5% 2 CO). Utilice una placa de cultivo tisular con un diámetro de 100 mm y altura de 20 mm. Iniciar el cultivo con 2 x 10 3 al 06 x 10 3 células / cm 2 y se incuba hasta que alcanzan el 80-90% de confluencia para la transfección posterior.
- En el día de la transfección, aspirar los medios de comunicación celulares y suavemente lavar una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Dispersar las células HEK 293 con solución de tripsina-EDTA 0,25% durante 1-2 minutos, aspirar la solución y golpear suavemente el lado del plato para separar la cells. Añadir un nuevo DMEM (10% FBS) y disociar las células aglutinadas con la pipeta. Determinar la concentración de células utilizando un hemocitómetro.
- Colocar 0,08 - 0,13 mm de espesor, 10 mm de diámetro cubreobjetos pre-recubiertas con poli-L-lisina en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Sembrar las células HEK 293 sobre cubreobjetos en células de 1 x 10 5 / cm2 densidad celular.
Nota: Puesto que las células HEK 293 son capaces de formar uniones comunicantes entre sí, el número de semillas necesita para producir células aisladas. - Transitoriamente transfectar las células con un constructo de gen apropiado que codifica una GEVI mediante el uso de un reactivo de lipofección siguiendo las instrucciones del fabricante.
Nota: Las construcciones genéticas utilizadas para este paso pcDNA3.1 utilizada (Bongwoori) y pUB2.1 (Nabi 2.242) como vectores columna vertebral. La cantidad de ADN utilizado fue 100 ng para cada cubreobjetos; sin embargo, las condiciones de transfección tienen que ser determinado empíricamente para cada GEVI a ensayar.
- En la cadera del ratón disociadalas neuronas primarias pocampal
- Diseccionar hipocampos a partir de embriones día 17 C57BL6 / N ratones y luego disociar las neuronas del hipocampo como se ha descrito previamente 22,23.
- Plate las neuronas disociadas en poli-D-lisina revestidos 0.08-0.13 mm de espesor, cubreobjetos de 10 mm de diámetro en las células 1 x 10 5 de densidad celular / ml. Se incuban las células a 37 ° C en incubadora con CO2 (CO2 al 5%).
- Transfectar las neuronas disociadas transitoriamente a los 6 - 7 días in vitro (DIV) con una construcción de gen que codifica una GEVI mediante el uso de un reactivo de transfección de fosfato de calcio como se describió anteriormente 24.
Nota: Las construcciones genéticas utilizadas para este paso pcDNA3.1 utilizada (Bongwoori) y pUB2.1 (Nabi 2,244) como vectores de columna vertebral. La cantidad de ADN utilizado fue 1 g para cada cubreobjetos. Una vez más, las condiciones de transfección tienen que ser determinado empíricamente para cada GEVI probado.
- Comprobar el nivel de expresión antes de la tensión imaging
- Tomar la placa de cultivo de tejido de la incubadora de CO2 y observar la fluorescencia de las células transfectadas con un microscopio de epifluorescencia.
- Después de confirmar la fluorescencia de la membrana, transferir el cubreobjetos a la cámara de parches para la formación de imágenes de tensión en la sección 3.
Nota: La imagen de tensión se guiaron a 16 - 24 horas después de la transfección. Sin embargo, ya que diferentes proteínas fluorescentes tienen diferentes tiempos de maduración, algunos GeViS necesitar más tiempo en la transfección de correos. Por ejemplo, los pares de FRET que contienen mRuby2 en este protocolo pueden tomar más tiempo para expresar ya que la maduración de mRuby2 tarda mucho más que 11 Clover. La fluorescencia del donante y del receptor debe ser revisado.
3. Protocolo de imagen Tensión
- Elija una célula sana con buena expresión en la membrana
- Usando microscopía, encontrar una célula sana (Figura 4B) que muestra fuertesmembrana de fluorescencia localizada en comparación con la fluorescencia interna. Trate de no parchear células redondeadas. Las células se están dividiendo circulares cualquiera o morir y son difíciles de arreglar. Aplicar un pulso de prueba de 5.0 mV en ms de amplitud y 5,0 en la duración para ayudar posteriores experimentos de patch clamp.
- Preparar la célula para obtener imágenes de voltaje
- Después de elegir una celda de parche, coloque la pipeta de patch clamp encima de la celda. Llevar la pipeta hasta que roce la membrana celular. En este paso, observar 1 MW - 2 mO aumento en la resistencia de la membrana en el software de patch clamp 25.
NOTA: En ocasiones, un buen sello giga-ohm pueden producirse con sólo tocar la membrana celular. Mientras el sello giga-ohm es estable, debería estar bien. - Establecer un sello giga-ohmios mediante la aplicación de una suave presión negativa a través de la pipeta. Establecer el potencial de la pipeta a un potencial de mantenimiento deseada.
- Mientras se mantiene el sello giga-ohmios, la imagen ºcélulas e con la cámara CCD de alta velocidad y enfocarla a la zona de membrana.
- La ruptura de la membrana celular mediante la aplicación de pulsos de aspiración por la boca o la jeringa suavemente para hacer una configuración de célula entera 26.
- Image el parche sujeta célula en una configuración de conjunto de abrazadera de célula de acuerdo con el diseño experimental utilizando un software de imágenes
- Iniciar el software de imágenes. Haga clic en [Obtener] - menú [SciMeasure Cámara] para abrir la página 'CCD tomar prestado ".
- Crear un nuevo archivo de datos para guardar las imágenes.
- Haga clic en [Salida analógica] y luego [Lea un ASCII] para abrir un archivo de protocolo de pulso para llevar a cabo la formación de imágenes. Haga clic en "la media de los repeticiones internas" si los datos deben ser promediados. A continuación, cierre la página de "SALIDA ANALÓGICA '.
Nota: Este protocolo de pulso debe ser diseñado y guardado como un archivo '.txt' de acuerdo con el propósito de cada experimento antes de este paso. - Establecer acervo específicoITION parámetros en la página 'CCD tomar prestado ". Introducir los valores específicos para 'Número de tramas para la adquisición "y" Número de estudios'.
Nota: El número de tramas se determina por la velocidad de la adquisición y la sincronización del protocolo de pulso. Por ejemplo, si la imagen en 1 kHz, 1.000 tramas es igual a 1 seg de tiempo de grabación. - Haga clic en [TOMA DE DATOS (Óptica + BNC)] para iniciar la grabación. Si bien la formación de imágenes de tensión se lleva a cabo, ver la ventana de osciloscopio del software de patch clamp para asegurar la configuración de células enteras estable durante la grabación.
Nota: Para probar rango de tensión de respuesta del GEVI, el tamaño de la señal en Df valor / F o resolución temporal en todo el rango de tensión fisiológica, llevar a cabo un experimento de fijación de voltaje de células enteras con impulsos de tensión de un protocolo de impulsos de traspasar los que van desde -170 mV a 130 mV. Para determinar el rendimiento de la GEVI en la resolución de los potenciales de acción evocados a partir de prima cultivadary neuronas, la imagen de la célula en una configuración de fijación de corriente de células enteras.
- Después de elegir una celda de parche, coloque la pipeta de patch clamp encima de la celda. Llevar la pipeta hasta que roce la membrana celular. En este paso, observar 1 MW - 2 mO aumento en la resistencia de la membrana en el software de patch clamp 25.
4. Adquisición de Datos
- Cálculo de Delta F / F
- Iniciar el software de imágenes. Haga clic en [Archivo] - [Leer archivo de datos] para abrir un archivo de datos para ser analizados. Observar la imagen celular en su intensidad de luz de reclinación (ILR) en el lado derecho
Nota: Los promedios de software los primeros 5 fotogramas para determinar RLI de la grabación. - Haga clic en "Mostrar BNCs 'para llevar los valores de corriente y voltaje medidos a la pantalla.
- Cambiar el modo de página de "RLI marco" a "resta del capítulo 'para utilizar la función de la substracción de fotograma para identificar los píxeles con señales ópticas sensibles. Este es el verdadero poder de la imagen, ya que cada píxel puede ser examinado por los posibles cambios en la fluorescencia.
- Seleccione dos puntos de tiempo (F 0 y F 1) para la resta. Identificar qué área de la célula esmostrando señales en respuesta a una membrana de cambio potencial.
Nota: El SNR para las imágenes de sustracción marco puede ser mejorada mediante la selección de varios fotogramas para cada punto de tiempo para promediar temporalmente la señal. El software resta la intensidad media de la luz tomada de fotogramas seleccionados y calcula los valores de F 1 0 -F (Df). Por lo general, uno elige un punto de tiempo adquirida en el punto de potencial y otro tiempo de retención tomada durante el periodo de estimulación. - Designar a los píxeles que necesitan ser analizados arrastrando o haciendo clic en cada píxel con el ratón del ordenador. Observar la representación gráfica de la intensidad media de fluorescencia de los píxeles seleccionados en el lado izquierdo de la ventana de software. Figuras 4B y 5B muestran imágenes representativas del análisis de la resta marco.
- Dividir los píxeles sustraídas por el ILR (F0). Haga clic en [Dividir por RLIs] para adquirir valores de Delta F / F
- Iniciar el software de imágenes. Haga clic en [Archivo] - [Leer archivo de datos] para abrir un archivo de datos para ser analizados. Observar la imagen celular en su intensidad de luz de reclinación (ILR) en el lado derecho
- Exportar datos
- Retire las gráficas de corriente y tensión por unclicking menú 'Mostrar los BNC. Ir a [SALIDA] - [Guardar trazas como se muestra (ASCII)] para exportar la traza de fluorescencia en un formato de archivo ASCII para análisis de ajuste de la curva por el software de gráficos estándar.
Análisis 5. Datos
- Voltaje de la propiedad de detección de la GEVI
- Dibuje el cambio de fluorescencia frente gráfico de tensión (VF) determinando los valores de Delta F / F en función del voltaje en un programa de análisis de datos. Adaptarse a la curva a una función de Boltzmann (Tabla 2) para determinar el rango de tensión de la señal óptica haciendo clic en [Análisis] - [montaje] - [ajuste sigmoidal] - [diálogo Abrir], y luego seleccione la función de Boltzmann.
Nota: El ajustar a una función que lo hace posible para caracterizar las propiedades de detección de tensión de diferentes sondas de tensión o para comparar sus actuaciones en diferentes células. La función de Boltzmann puede ser utilizado para las sondas de prueba en este papel, porque las curvas de FV de estas sondas muestran patrón sigmoidal. - Normalizar cada valor? F / F usando los valores iniciales y finales (A 1 y A 2) calculado por la función.
Nota: En la ecuación de Boltzmann, el mínimo es de un 1 y el máximo es A 2. Para la normalización, utilizar un software de aplicación de hoja de cálculo para ajustar los valores Delta F / F mediante la definición de A 1 como cero y A 2 como uno. La media de los valores normalizados? F / F y calcular el error estándar para el análisis estadístico. - Replot el Delta F normalizado / F valores de tensión frente a los descritos anteriormente en la sección 5.1.1).
- Dibuje el cambio de fluorescencia frente gráfico de tensión (VF) determinando los valores de Delta F / F en función del voltaje en un programa de análisis de datos. Adaptarse a la curva a una función de Boltzmann (Tabla 2) para determinar el rango de tensión de la señal óptica haciendo clic en [Análisis] - [montaje] - [ajuste sigmoidal] - [diálogo Abrir], y luego seleccione la función de Boltzmann.
- La velocidad de la respuesta óptica
- Abra el archivo ASCII adquirida desde el paso 4.2.2) con un análisis de los datosprogramas y trazar el rastro? F / F en función del tiempo.
- Haga clic en "selector de datos" en el software de análisis de datos y seleccionar un punto de tiempo que corresponde al comienzo de un pulso de voltaje escalonado y un segundo punto de tiempo cuando la señal óptica ha alcanzado el estado estacionario. Montar este rango para tanto una función de decaimiento exponencial simple y doble clic en [Análisis] - [montaje] - [ajuste exponencial] - [diálogo Abrir], y elija una función de decaimiento exponencial. Reporte el mejor ajuste.
Nota: Mediante el ajuste de las funciones de decrecimiento exponencial simple o doble, las constantes de tiempo cuantificados representados por τ se pueden adquirir. Esto ayudará a los experimentadores comparar la cinética de sus mediciones hechas con diferentes indicadores de tensión. La traza de fluorescencia podría mostrar componentes rápido y lento que se pueden describir con una función de decaimiento exponencial doble. En este caso, el cálculo resultará en dos constantes de tiempo con diferentes amplitudes. - Calcula THe constantes tau ponderado para comparar la cinética de sondas que exhiben dos componentes temporales a las sondas con un solo componente.
Nota: Un tau ponderada se calcula como la suma de τ 1 multiplicado por la amplitud relativa, A 1, más τ 2 multiplicado por la amplitud relativa, A 2, tal como se define por la siguiente fórmula;
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Representative Results
Transitoriamente células transfectadas pueden exhibir una variación significativa en la intensidad de fluorescencia y el grado de expresión en la membrana de plasma. Incluso en el mismo cubreobjetos algunas células tendrán diferentes niveles de fluorescencia interna. Esto es más probable debido a la cantidad de agente de transfección absorbido por la célula. De vez en cuando, el exceso de expresión hace que la célula de experimentar la respuesta de la proteína desplegada que resulta en apoptosis 27 (brillante, células redondeadas, con alta fluorescencia interna). Por consiguiente, el experimentador se advirtió a prueba tanto las células brillantes y oscuras células con la menor fluorescencia interna como sea posible ya que la expresión interna crea una fluorescencia no sensible que reduce la relación señal a ruido (SNR).
Otra consideración es la tasa de maduración de cromóforos. La figura 3 muestra disparidad en la fluorescencia del aceptor chromophmineral (mRuby2) que tiene un tiempo de maduración más largo que el cromóforo donante (trébol).
Figura 3. Las imágenes confocales de células HEK 293 transfectadas transitoriamente con un Based GEVI FRET, Nabi2.242. (A) Las imágenes confocales de una célula HEK que muestran fluorescencia de membrana localizada de FRET donante y aceptor, (B) Las imágenes confocales muestran una posible consecuencia de la maduración lenta de mRuby2. Los cuatro células exhiben fluorescencia del trébol mientras que sólo dos exposiciones mRuby2 fluorescencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las imágenes fueron adquiridas mediante un microscopio confocal. Para el donante FRET, Trébol, se usó 488 nm láser para la excitación y la emisión fue captrado con 525/50 nm de paso de banda del filtro. El aceptor de FRET, mRuby2, se iluminó con 561 nm de láser para la excitación y 595/50 nm de paso de banda del filtro se utilizó para la emisión. Las muestras para formación de imágenes confocal se fijaron con paraformaldehído al 4% / solución de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato ajustado a pH 7,4 y luego se montan con un reactivo anti-desvanecimiento.
Una vez que se optimizan las condiciones de transfección, el siguiente fuente de variación viene de la determinación de la región de interés a analizar. Uso de la resta marco para identificar las regiones de la célula con el mayor cambio de fluorescencia se utiliza a menudo para maximizar el valor Delta F / F. Una alternativa es seleccionar todos los píxeles que reciben la luz de la celda. Esto aumenta el número de píxeles que resulta en la reducción de ruido, pero disminuye el tamaño de la señal, ya que se incluye la fluorescencia interna no responde. Ambos métodos son bien siempre y cuando el experimentador se mantiene constante.
Figura 4. Imagen de tensión con una sola FP basado en GEVI Expresadoen células HEK 293 y las neuronas del hipocampo primaria. (A)? F / F rastro de un único basado FP GEVI, Bongwoori, que muestra las respuestas a impulsos de tensión escalonadas registrados a 1 kHz con una cámara CCD de alta velocidad. (B) Una célula HEK 293 fotografiado con la cámara CCD de alta velocidad; (Izquierda) Intensidad de luz de reclinación (ILR) de una célula que expresa (a la derecha) la imagen de la substracción de fotograma que indica los píxeles donde se observó el cambio de fluorescencia y Bongwoori. (C) La grabación óptica de potenciales de acción inducidos de ratón neuronas primarias del hipocampo que expresan Bongwoori. Los potenciales de acción fueron evocados en el modo de fijación de corriente de células enteras. La traza? F / F se selecciona entre los píxeles correlacionados con el soma. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Un representante fluolectura cencia de los cromóforos donante y aceptor se muestra en la Figura 5A. La polaridad del cambio de fluorescencia es opuesto para el donante y aceptor que permite el análisis radiométrico para reducir las fuentes de ruido correlacionado, por ejemplo., El movimiento. Por ejemplo, el ruido de movimiento correlacionado exhibirá un cambio en la fluorescencia en la misma dirección tanto para el donante y aceptor de fluorescencia. Mientras que la sonda basada FRET es capaz de formación de imágenes radiométrica, a menudo es mejor sólo para analizar el cromóforo más brillante. Esto es porque el cromóforo regulador puede aumentar sustancialmente el ruido de la grabación. La Figura 5B muestra este efecto. La resta marco en la Figura 5B de la más brillante Clover muestra claramente que la señal óptica es en la célula. Por el contrario, la resta marco de la fluorescencia mRuby2 muestra un mayor grado de ruido de toda la célula. Por lo tanto, sólo la señal de donantes de trébol se muestra en una neurona del hipocampo en Fi5C figura.
Figura 5. formación de imágenes de tensión con una de FRET a base GEVI expresado en células HEK 293 células y neuronas primarias del hipocampo. (A) ? F / F rastro de un GEVI basado FRET, Nabi2.242, que muestra las respuestas a dos longitudes de onda de impulsos de tensión escalonadas registrados a 1 kHz con una cámara CCD de alta velocidad. (B) superior; el donante (Trébol-ILR, Trébol-marco de sustracción) y el receptor (mRuby2-ILR, mRuby2-marco de sustracción) imágenes procesadas con dos umbrales diferentes para cada FP, Inferior; el mismo umbral se utiliza tanto para los donantes (Trébol-ILR, Trébol-marco de sustracción) y aceptador de imágenes (mRuby2-ILR, mRuby2-marco de sustracción) para ilustrar la oscuridad relativa de mRuby2. Todas las imágenes fueron tomadas de la misma célula HEK 293 que expresan Nabi2.242. (C) La longitud de onda 520 nm tras de los potenciales de acción inducidos a partir de una neurona primaria del hipocampo del ratón que expresan sensor de Nabi2.244. La traza? F / F se selecciona entre los píxeles correlacionados con el soma. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Consecuencias de niveles variables de luz para? F y Delta F / F valores. (A) Una imagen de un celular HEK 293 que expresan una única basada FP GEVI, Bongwoori, mostrados en la intensidad de la luz de reclinación (ILR), (B) los restos de fluorescencia que muestran un promedio del núcleo ? F (F x 0) -F valores de tres regiones diferentes, región 1: región de la membrana con la señal de fluorescencia bien localizado, la región 2: una región con fluorescencia brillante interna, unad región 3: región distante de la señal óptica, (C) los restos de fluorescencia que muestran un promedio de los valores del kernel? F / F provocadas por las mismas regiones en (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| conceptos | ecuaciones | Observación |
| cambio de fluorescencia fraccionada (? F / F) |  | F 1 = intensidad de la luz medida en un punto del tiempo, F 0 = intensidad de la luz medida a potencial de mantenimiento |
| función de Boltzmann |  | y =? F / F, V = potencial de membrana en mV, V 1/2 es el potencial de membrana en mV a la mitad del máximo? F / F, A |
| Doble función de decaimiento exponencial | y = y 0 + 1 A e - (t - t0) / τ 1 + A 2 e - (t - t0) / τ 2 | tau 1, τ 2 = constantes de tiempo, a 1, a 2 = amplitudes, t, t = 0 dos puntos de tiempo, y 0 = compensados |
Tabla 2. Ecuaciones
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Discussion
El sistema nervioso utiliza el voltaje de varias maneras diferentes, la inhibición provoca una ligera hiperpolarización, entrada sináptica provoca una ligera despolarización y una acción resultados potenciales en un cambio relativamente grande de tensión. La capacidad de medir los cambios en el potencial de membrana por GeViS ofrece el potencial prometedor de análisis de varios componentes de los circuitos neuronales simultáneamente. En este informe se demuestra un método fundamental para los cambios de imagen en el potencial de membrana utilizando GeViS.
Una clave importante para los cambios de imagen de la tensión es la expresión eficiente de la GEVI en la membrana plasmática. La expresión intracelular crea una fluorescencia no sensible que reduce la SNR de la sonda. La optimización de las condiciones de transfección mejora enormemente la consistencia de las mediciones ópticas. De hecho, cuando se prueba un nuevo GEVI es aconsejable probar también una sonda conocida para asegurar que las diferencias en la actividad óptica se debe enteramente a la nesonda w y no las condiciones de las células.
La Figura 6 muestra el efecto de fluorescencia interna en la disminución de la sensibilidad de la formación de imágenes de tensión, Delta F / F de valor. La Figura 6B muestra Delta F valores de una célula HEK que expresa la GEVI base de un solo FP, Bongwoori. Traza 2 proviene de la región 2 (color azul) en la que la fluorescencia interna relativamente brillante se ve en la Figura 6A. Este seguimiento tiene el mismo nivel de valor? F como traza 1. Sin embargo, en la figura 6C, donde las huellas en la Figura 6B se dividieron por valores RLI para los valores? F / F, la traza 2 gotas de manera significativa debido a la fluorescencia brillante interna que disminuye? F / F valores. Fluorescencia traza 3 tiene una muy pequeña? F, pero también tiene un valor muy pequeño RLI (F). El resultado es una señal de Delta F fraudulenta / F que tiene un aumento sustancial en el ruido de la grabación. Este ejemplo se incluye para demostrar el Delta F es tambiénimportante. Un gran cambio en Delta F / F no es útil si F es muy baja, para empezar.
El uso de un divisor de imágenes permite la medición simultánea de dos longitudes de onda en una única cámara CCD. Esto ayuda en gran medida la medición de los cambios fluorescentes dependientes de FRET para el desarrollo de la sonda y reduce el coste de la instalación. Sin embargo, debido a la aberración cromática, estas dos imágenes serán ligeramente fuera de foco que requiere la necesidad de un objetivo apocromático. Cuanto más luz, mejor SNR, por lo que la elección de los objetivos de la más alta apertura numérica también mejora la imagen de fluorescencia. Además, se puede utilizar fuentes de luz más fuertes tales como diodos emisores de luz (LED) o láser para aumentar la SNR. LEDs no requieren un obturador mecánico.
En este informe se muestran las señales ópticas de una sola FP GEVI y un GEVI basados en FRET. La ventaja principal de un GEVI basados en FRET es que la imagen radiométrica permite la reducción de ruido correlacionado due a la respiración y el flujo de la sangre en vivo. La polaridad opuesta de las señales fluorescentes confirma un cambio real en el potencial de membrana. Sin embargo, ya que las intensidades de fluorescencia de los dos cromóforos a menudo varían de manera significativa, la SNR también variar. Esto confunde el análisis radiométrico y limita su utilidad 28. También puede haber una señal de FRET-independiente 29. Por tanto, es a veces mejor utilizar sólo el cromóforo fluorescente brillante cuando se utiliza FRET para analizar los cambios en el potencial de membrana.
formación de imágenes tensión es más difícil que la de imágenes de calcio debido a la velocidad y la variabilidad de los cambios en el potencial de membrana en comparación con imágenes de calcio que mide el flujo de calcio. El potencial de membrana cambios en las escalas de tiempo muy rápido en comparación con el flujo de iones de calcio, y eventos subumbral en las neuronas no se pueden medir con imágenes de calcio 30. Además, la sonda de tensión debe estar en la membrana plasmáticapara ser eficaz que reduce la cantidad de sonda disponible a los cambios de informe ópticamente en el potencial de membrana. En consecuencia, el número de fotones que en realidad puede llegar al chip CCD es relativamente pocos. Esto requiere la necesidad de una alta velocidad y una cámara de baja lectura de ruido con alta eficiencia cuántica y una sonda que provoca una alta SNR de los cambios en el potencial de membrana. Por imágenes de células in vitro, los investigadores comprender mejor los posibles beneficios y riesgos de GeViS antes de intentar mediciones in vivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 60X objective lens (numerical aperture = 1.35) | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| Excitation filter | Semrock | FF02-472/30 | For voltage imaging of super ecliptic pHluorin in Bongwoori |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75W Xenon arc lamp | CAIRN | OptoSource Illuminator | LEDs and lasers are also effective light sources |
| Slow speed CCD camera | Hitachi | KP-D20BU | |
| Dual port camera adaptor | Olympus | U-DPCAD | |
| High speed CCD camera | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| Image splitter | CAIRN | Optosplit 2 | |
| Excitation filter | Semrock | FF01-475/23-25 | For voltage imaging of FRET pair based GEVI consisting of Clover and mRuby2) |
| Dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| Emission filter | Chroma | ET520/40 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| Emission filter | Chroma | ET645/75 | |
| Vibration isolation system | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| Patching chamber | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 Micro Coverglass (22 x 40 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-344B | |
| #0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm diameter glass coverslip | Ted Pella | 260366 | |
| Lipofection agent | Life Technologies | 11668-027 | |
| Calcium phosphate reagent | Clontech - Takara | 631312 | |
| Patch clamp amplifier | HEKA | EPC 10 USB amplifier | |
| Multi-channel data acquisition software | HEKA | Patchmaster | |
| Image acquisition and analysis software | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| Spreadsheet application software | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| Data analysis software | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| Demagnifier | Qioptiq LINOS | Optem standard camera coupler 0.38x SC38 J clamp | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1R confocal microscope | |
| Anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 |
References
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