En roman-strategien kombinere Array-CGH, hele-exome sekvensering og In Utero elektroporation i gnavere for at identificere sygdomsfremkaldende gener for hjernens misdannelser

Summary

Periventricular nodulær heterotopia (PNH) er den mest almindelige form for misdannelser af kortikale udvikling (MCD) i voksenalderen, men dens genetiske grundlag forbliver ukendt i de fleste sporadiske tilfælde. Vi har for nylig udviklet en strategi til at identificere nye kandidat gener for MCDs og direkte bekræfte deres forårsagende rolle in vivo.

Abstract

Fødselsdefekter, der involverer hjernebarken — også kendt som misdannelser af kortikale udvikling (MCD) — er vigtige årsager til intellektuelle handicap og tegner sig for 20-40% af resistente epilepsi i barndommen. Høj opløsning brain imaging har lettet i vivo identifikation af en stor gruppe af MCD fænotyper. Trods fremskridt i brain imaging, genomisk analyse og generation af dyremodeller mangler en enkel arbejdsproces systematisk prioritere kandidat gener og teste funktionelle virkninger af formodede mutationer. For at løse dette problem, var en eksperimentel strategi muliggør identifikation af roman sygdomsfremkaldende gener for MCD udviklet og valideret. Denne strategi er baseret på at identificere kandidat genomisk regioner eller gener via array-CGH eller hele-exome sekvensering og kendetegner deres inaktivering eller overekspression af specifikke mutationer i udvikle gnaver hjerner via in utero virkninger elektroporation. Denne tilgang har ført til identifikation af C6orf70 -genet, kodning til en formodede vesikulære protein til patogenesen af periventricular nodulær heterotopia, en MCD forårsaget af defekte neuronal migration.

Introduction

Cerebral cortex spiller en central rolle i kognitive og intellektuelle processer og er involveret i følelsesmæssig kontrol samt indlæring og hukommelse. Det er derfor ikke overraskende, at mange neurologiske og psykiatriske sygdomme skyldes misdannelser af kortikale udvikling (MCD). Ætiologien af MCD er komplekse siden både erhvervet og genetiske faktorer er involveret. Den kumulative forekomst af genetisk bestemt andel af MCD er omkring 2%, og de er sporadisk i de fleste tilfælde. For eksempel, forekomsten af medfødt hjerne dysgenese blev anslået til at være højere end 1% i befolkningen, og nogle former for MCD er observeret i mere end 14% af alle patienter med epilepsi og i 40% af svær eller genstridig epilepsi^{1, 2}.

Periventricular nodulær Heterotopia (PNH) er en af de mest almindelige MCDs og er forårsaget af unormal migration af neuroner fra den ventrikulære zone (VZ) at udvikle hjernebarken. Manglende neuroner til at overføre resultater i klynger af heterotopisk neuroner langs væggene i de laterale ventrikler, der normalt kan visualiseres ved hjælp af magnetisk resonans Imaging (MR). De kliniske og anatomiske imaging funktioner i PNH er heterogene. Knuder kan variere fra små og ensidige til bilaterale og symmetrisk. Fælles kliniske sequelae omfatter epilepsi og intellektuelle handicap³. Mutationer i Filamin A (eller FLNA)-genet, der kortlægger i Xq28, blev fundet i 100% af familierne med X-linked bilaterale PNH og 26% af sporadiske patienter^3,4. En sjælden, recessive form af PNH forårsaget af mutationer i ARFGEF2 genet, som kort i 20q13, er blevet rapporteret i to blodsbeslægtet familier⁵. For nylig, biallelic mutationer i gener kodning receptor-ligand cadherin par DCHS1 og FAT4 er blevet identificeret i ni patienter, der lider af en multisystemic lidelse, der omfatter PNH⁶. PNH har også været forbundet med skrøbelige X syndrom⁷, Williams syndrom⁸, 22q11 microdeletion syndrom⁹, gengangere på 5 p 15¹⁰, sletninger på 1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6 p 25¹³ og 6q terminal sletning syndrom^{14,15,16,17,18,19}, tyder på, at yderligere sygdomsfremkaldende gener er spredt hele genom. Ca. 74% af sporadiske PNH patienter er det genetiske grundlag imidlertid være belyst¹⁷.

Klassisk gen kortlægning tilgange som array komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) har vist sig for at være en kraftfuld værktøj til påvisning af sub mikroskopiske kromosomafvigelser, men regionerne genomisk identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde er ofte store og indeholder mange gener.

Fremkomsten af massive parallelle sekventering teknikker (dvs. hele-Exome-sekventering (WES) og Whole-Genome sequencing (WGS)) har væsentligt reduceret omkostningerne og tidsforbruget til at sekventere et hele menneskelige exome eller -genom. Fortolkning af WES og WGS data er imidlertid stadig udfordrende i fleste tilfælde, siden for hver patient snesevis til hundredvis (eller endda tusindvis, afhængigt af hvilken type analyse) varianter emerge fra data filtrering.

For at fremskynde processen med at identificere roman MCD sygdomsfremkaldende gener, en roman systematisk strategi kombinerer array-CGH, blev WES og i utero elektroporation (IUE) screening af kandidat gener designet. IUE gør det muligt at selektivt inaktivere (eller overexpress) specifikke gener eller mutationer i gnavere hjerner, muliggør hurtig evaluering af deres inddragelse i corticogenesis^18,19. RNAi medieret-knockdown eller overekspression af én eller flere kandidat gener forventes at medføre, når genet er forbundet med udvikling af sygdom, lokaliserede defekter i neuronal migration og/eller modning. Efter identifikation af et gen hvis inaktivering (eller overekspression) gengiver fænotype observeret hos patienter i gnavere, bliver det en enestående kandidat til screening i sporadiske patienter med MCD. Brug denne fremgangsmåde, afsløret vi for nylig den afgørende bidrag af C6orf70 -genet (også kendt som ERMARD) i PNH patogenese i patienter huser 6q27 kromosomale sletninger¹⁶.

Protocol

Etik erklæring: Wistar rotter blev parret, vedligeholdes og anvendes i de INMED dyr faciliteter, i samarbejde med EU og fransk lovgivning.

1. DNA-ekstraktion og for Array-CGH og WES

1. Uddrag genomisk DNA (gDNA) fra humant blod leukocytter fra patienter ved hjælp af en automatiseret DNA isoleret robot eller kommercielt tilgængelige manuel DNA udvinding kits efter producentens protokol. Kvantificere alle prøver ved hjælp af et spektrofotometer.

2. array-CGH protokol

1. Begrænsning fordøjelsen af gDNA
   1. Dobbelt digest 500 ng af renset gDNA fra en patient og en kommercielt tilgængelige menneskelige kontrol DNA med RsaI og AluI i 2 timer ved 37 ° C. Brug 0,5 µl af 10 U/μL enzym til hver reaktion. Ruger i 20 min. ved 65 ° C til at inaktivere enzymerne og flytte prøveglassene til is.
2. Prøven mærkning
   1. Tilføje den passende mængde af tilfældige primere behov for formatet microarray i brug til hver reaktion tube (f.eks. 5 µl til 1-pack, 2-Pak og 4-pack microarrays). Bland godt af pipettering forsigtigt op og ned.
   2. Overføre prøveglassene til en termisk cycler. Inkuber ved 95 ° C i 3 min og derefter ved 4 ° C i 5 min.
   3. Forberede en cyanine 3 og en cyanine 5 mærkning Master Mix på isen ved at blande de følgende bind: 10,0 µl 5 X reaktion Buffer, 5.0 µl 10 x dNTPs, 3.0 µl Cyanine 3-dUTP eller Cyanine 5-dUTP og 1.0 µl Exo (-) Klenow enzym, 2.0 µl nukleasen-gratis vand. Vælg mængden af hver reagens ifølge microarray format i brug.
   4. Tilføje mærkning Master Mix til hver reaktion rør indeholdende gDNA. Bland godt ved forsigtigt pipettering op og ned.
   5. Overføre prøveglassene til en termisk cycler og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer, 65 ° C i 10 min og derefter opretholde prøver ved 4 ° C.
3. Rensning af mærket gDNA
   1. Tilføje 430 µl 1 x TE (pH 8,0) til hver reaktion tube.
   2. Placer en rensning kolonne til 2 mL indsamling rør og etiket kolonnerne korrekt. Indlæse hver mærket gDNA en rensning kolonne.
   3. Der centrifugeres i 10 min på 14.000 x g i en microcentrifuge ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømnings- og placere kolonnen tilbage i 2 ml collection tube.
   4. Tilføje 480 µL 1 x TE (pH 8,0) til hver kolonne. Der centrifugeres i 10 min på 14.000 x g i en microcentrifuge ved stuetemperatur. Kassér gennemstrømnings.
   5. Vend kolonnen i en frisk 2 mL indsamling rør og centrifugeres i 1 min på 1.000 x g i en microcentrifuge ved stuetemperatur til at indsamle renset prøve.
   6. Bringe sample volumen som anmodet af microarray formatet i brug ved hjælp af en koncentrator eller tilføje 1 x TE (pH 8.0). For eksempel, for 1-pack microarray bringe mængden til 80,5 µL. Inkuber prøven i isbad i 5 min og derefter afpipetteres løsning op og ned 10 gange.
4. Forberedelse af mærket gDNA for hybridisering
   1. Kombiner test- og referencestoffer prøver ved hjælp af passende cyanine 5-mærket prøve og cyanine 3-mærket prøve i en frisk 1,5 mL RNase-fri rør. For eksempel, for 1-pack microarray sikre, at det endelige rumfang er 158 µL. vælge omfanget af hver prøve ifølge microarray format i brug.
   2. Brug et spektrofotometer til måling af afkast, graden af mærkning eller specifikke aktivitet ved måling af absorbans ved A260 nm (DNA), A550 nm (cyanine 3) og A650 nm (cyanine 5).
      1. Beregner ved hjælp af formlen: [DNA concentration(ng/µl) x sample volumen (µl)] / 1.000 (ng/µg). Beregne specifikke aktivitet ved hjælp af formlen: pmol pr. µl af farvestof/µg pr. µl af gDNA.
         Bemærk: For eksempel til 0,5 µg input DNA, udbyttet skal være 8-11 µg og den specifikke aktivitet (pmol/µg) bør være 25-40 op til Cyanine-3 mærket 20 til 35 for Cyanine-5 mærket prøve og prøve.
   3. For at forberede mængden af hybridisering Master Mix behov for formatet microarray i brug, mix af følgende reagenser: 50 µL Cot-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH blokering Agent og 260 µl 2 x HI-RPM hybridisering Buffer.
   4. Tilføje den passende mængde af hybridisering Master Mix til 1,5 ml RNase-fri rør, der indeholder den mærkede gDNA for at få det samlede volumen kræves af microarray formatet i brug. For eksempel, for 1 pack microarray, sikre, at det endelige rumfang for hver reaktion er 362 µl.
   5. Bland prøven af pipettering op og ned, derefter hurtigt centrifugeres ved 14.000 x g og Inkuber i 3 min. ved 95 ° C og 37 ° C i 30 min.
5. Chambers forsamling og hybridisering
   1. Læg en ren pakning dias i salen base med pakning etiketten vender opad og justeret med den rektangulære del af salen base. Sikre at diasset pakning flugter med kammer base ikke og klem.
   2. Dispensere hybridisering prøve blandingen på pakning godt, og sørg for, at prøven er jævnt fordelt.
   3. Sætte et microarray dias på pakning dias vurdering af at sandwich-par er korrekt justeret. Derefter, samle reaktionskammeret sætte coveret på de klemt dias og hånd-stramme klemmen.
   4. Sikre dias befugtning ved at dreje den forsamlede kammer lodret. Sørg for, at bobler ikke er til stede i salen. Om nødvendigt, tryk forsamling på en hård overflade for at flytte stationære bobler.
   5. Sætte de forsamlede dias kamre i en rotator rack sat op til at rotere på 20 rpm. Sætte hybridisering kammer i ovn og udføre hybridisering ved 65 ° C til 24 eller 40 h ifølge microarray format i brug.
6. Microarray vask og scanning
   1. Tage hybridisering kammer ovn og nedsænkes i wash buffer 1. Fortsæt til sin demontering.
   2. Fjerne microarray dias og hurtigt sætte det ind i et dias rack i vaskebuffer 1 ved stuetemperatur.
   3. Vask array slide for 5 min med omrøring (bruge en loppe og en magnetomrører). Juster hastigheden på omrører til en indstilling af 4 (medium hastighed), for at få en god men ikke for kraftig blanding.
   4. Vask array dias i vaskebuffer 2 til 90 s omrøring. Forsigtigt inddrive diasset fra bufferen (det bør opstå tør) og læg det i en diasholderen ved hjælp af et dias protector.
   5. Indlæse diaset i array scanner og udføre scanning efter array producentens anvisninger.
   6. Analysere resultaterne ved hjælp af udvinding software følger med scanneren i brug ifølge producentens anvisninger (V.9.1.3.1).

3. WES protokol

1. Target berigelse
   1. Bruge dsDNA BR analysen til bestemmelse af blykoncentrationen i eksemplet gDNA efter instrument protokol.
   2. Fortynd 5 µg af høj kvalitet dobbeltstrenget DNA med 1 x lav TE buffer i 1,5 mL lav binde rør i en samlet maengde paa 50 µL.
   3. Oprette en sonikator og sætte en microtube i lastning og losning station efter fabrikantens anvisninger. Holde fælles landbrugspolitik på røret.
   4. Langsomt overføre 50 µl DNA-prøven gennem pre split septa uden at indføre bobler.
   5. Shear DNA ifølge indstillingerne foreslog fra den sonikator producent og vurdere kvalitet ved hjælp af en Bioanalyzer efter fabrikantens anvisninger. Target DNA fragment størrelse er 150 til 200 bp.
2. Reparation af DNA slutter
   1. Forberede ende reparation reaktion Mix ved at blande 40 µL af slutningen reparation enzym Mix med 10 µL af slutningen reparation Oligo Mix. Bland godt på en vortex-mixer.
   2. Inkuber prøver ved 20 ° C i 30 min i en termisk cycler og derefter holde dem ved 4 ° C. Brug ikke en opvarmet låg.
   3. Tilsæt 50 µL af slutningen reparation mastermix forberedt i trin 3.2.1 til hver 50 µL forskydes DNA-prøven godt. Bland godt ved pipettering op og ned eller ved blid vortexing.
   4. Rense prøve med en perler baseret rensning kit efter fabrikanten protokol.
3. Polyadenylation af 3' ender.
   1. Tilføj 20 µl af dA-hale Master Mix til hver ende-repareret, oprenset DNA-prøve (ca. 20 µL).
   2. Bland godt ved pipettering op og ned eller ved blid vortexing.
   3. Inkuber prøver ved 37 ° C i en termisk cycler og derefter holde det ved 4 ° C. Brug ikke en opvarmet låg.
4. Ligatur af før fange indeksering adapter.
   1. Tilføj 5 µL af ligatur Master Mix til hver A-tailed DNA-prøve.
   2. Tilføj 5 µL af den hensigtsmæssige præ capture indeks løsning til hver prøve.
   3. Forsegle brøndene og blandes omhyggeligt, ved vortexing for 5 s. kort centrifuge prøverne.
   4. Inkuber prøver ved 20 ° C i 15 min i en termisk cycler og derefter holde ved 4 ° C. Brug ikke en opvarmet låg.
   5. Rense prøver med en perler baseret rensning kit efter fabrikanten protokol.
5. Forstærkning af den indekserede bibliotek.
   1. Forberede den passende mængde af præ capture PCR-mastermix ved at blande 1 µL af Primer Mix og 25 µL PCR Master Mix. Bland godt på en vortex-mixer.
   2. Kombinere 26 µL af forstærkning blandingen i separate brønde af en PCR-plade og 24 µL af hver indekseret gDNA bibliotek prøve.
   3. Køre en PCR program med følgende trin: 98 ° C i 2 min., 5 cykler på 98 ° C til 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min og en sidste udvidelse ved 72 ° C i 10 min. Hold prøverne ved 4 ° C.
   4. Rense prøve med en perler baseret rensning kit efter fabrikanten protokol.
   5. Vurdere kvalitet med en Bioanalyzer efter fabrikanten protokol.
6. Sammenlægning af indekserede DNA-prøver til hybridisering
   1. For hver capture reaktion pool, kombinere den passende volumen af hver indekseret gDNA bibliotek prøve i et godt af en PCR-plade. For eksempel, menneskelige eller mus All-Exon fange biblioteker, kombinere 8 biblioteker pr. pool ved hjælp af 187.5 ng af hver indekseret bibliotek. Sikre, at hver endelige erobring reaktion pool indeholder 1.500 ng af indekserede gDNA.
   2. Reducere mængden i hver godt til < 7 µL ved hjælp af et vakuum koncentrator. Undgå fuldstændig udtørring prøven.
   3. Tilføje tilstrækkelig nukleasen-gratis vand til hver koncentreret gDNA pool at bringe de endelige godt bind 7 µL og derefter vortex pladen som indeholder gDNA kraftigt i 30 s. centrifugeres i en centrifuge eller mini plate spinner til at indsamle flydende i bunden af brøndene.
7. Hybridisering af gDNA bibliotek pools at indfange biblioteket
   1. Hver 7 µL indekseret gDNA pool, tilføje 9 µl blokerende Mix. Pipetteres op og ned for at blande.
   2. Cap brøndene, overføre forseglet pladen som indeholder gDNA til den termiske cycler og inkuberes ved 95 ° C i 5 min og derefter holde det ved 65 ° C. Sørg for, at pladen er afholdt på 65 ° C i mindst 5 min.
   3. Laves en passende fortynding af RNase blok, på grundlag af størrelsen af opsamling bibliotek (10% fortynding for biblioteker < 3,0 Mb og 25% fortynding for biblioteker > 3,0 Mb).
   4. Fange bibliotek størrelse, kombinere ordentlig mængden af fange bibliotek og fortyndes RNase blok løsning i en PCR-plade opbevares på is. Bland godt af pipettering. For indfangning biblioteker < 3,0 Mb, brug 2 µl af bibliotek og 5 µL af RNase blok i 10% fortynding. For indfangning biblioteker > 3,0 Mb, brug 5 µl af bibliotek og 2 µl af RNase blok på 25% fortynding.
   5. Tilføje 37 µL af hybridisering Buffer til hver brønd indeholder 7 µL af fange bibliotek/RNase blok mix. Mix kort og godt af pipettering centrifugeres pladen som indeholder mix.
   6. Vedligeholde gDNA pool plade på 65 ° C under brug af en multikanal-pipette til at overføre den hele 44 µL af fange bibliotek blanding fra trin 3.7.5 til hver prøve godt af gDNA pool plade. Bland godt ved langsomt pipettering op og ned 8 til 10 gange.
   7. Forsegle brønde med hvælvet strip caps. Sørg for, at alle brønde er helt forseglet. Placer en kompression mat over PCR-plade i den termiske cycler.
   8. Inkuber hybridisering blandingen i 24 timer ved 65 ° C. Bemærk: Prøver kan være hybridiseret i op til 72 timer, men skal kontrollere, at den udvidede hybridisering ikke forårsager omfattende fordampning i stikprøven brønde.
8. Forberedelse af streptavidin-belagt magnetiske perler
   1. Prewarm Wash buffer 2 ved 65 ° C i et vand bad eller varme blok.
   2. Energisk resuspend Streptavidin magnetiske perler på en vortex-mixer. De magnetiske perler bilægge under opbevaring.
   3. For hver hybridisering prøve, skal du tilføje 50 µL af de resuspenderede perler til wells af en PCR-plade.
   4. Vaske perlerne og resuspend dem i 200 µL af bindende Buffer.
9. Opsamling af hybridiserede DNA ved hjælp af streptavidin perler.
   1. Skøn og registrere omfanget af hybridisering løsning, der er tilbage efter 24 timers inkubation.
   2. Opretholde hybridisering pladen på 65 ° C, og bruge en multikanalpipette til at overføre den hele mængde (ca. 60 µL) af hver hybridisering blanding plade brønde indeholdende 200 µL af vasket streptavidin perler. Bland godt ved langsomt pipettering op og ned 3 til 5 gange.
   3. Cap brøndene og Inkuber capture plade på en Nutator mixer eller tilsvarende i 30 min. ved stuetemperatur. Kontroller, at prøverne korrekt blanding i brøndene.
   4. Kort centrifugeres capture plade i en centrifuge eller mini plate spinner.
   5. Sætte capture pladen i et magnetisk separator at indsamle perler fra suspension. Fjern og kassér supernatanten.
   6. Resuspend perlerne i 200 µL af Wash buffer 1. Mix af pipettering op og ned indtil perlerne er fuldt genopslemmes.
   7. Kort centrifugeres i en centrifuge eller mini plate spinner.
   8. Sæt pladen i den magnetisk separator.
   9. Vente på opklaring hen til klare, derefter fjerne og supernatanten.
10. Post fange prøve behandling for multipleksede sekventering
    1. Forberede den passende mængde af PCR reaktionsblanding ved at blande følgende: 9 µL nukleasen-gratis vand, 25 µL Master Mix og 1 µL Primer blandes efter antallet af redegoerelser. Bland godt brug en vortex-mixer og holde på is.
    2. For hver forstærkning reaktion, skal du placere 35 µL PCR reaktion blanding fra trin 3.10.1 i wells af en PCR-plade.
    3. Pipette hver perle-bundet erobrede bibliotek pool prøver op og ned til at sikre, at perle suspensionen er ensartet.
    4. Tilsæt 15 µL af hver erobrede bibliotek pool perle suspension til passende PCR reaktionsblandingen godt. Blandes grundigt ved pipettering indtil perle suspensionen er ensartet.
    5. Pladen forberedt i punkt 3.10.2 i en termisk cycler anbringes og køre programmet følgende PCR forstærkning: 98 ° C i 2 min., 8-11 cyklusser på 98 ° C til 30 s, 60 ° C til 30 s og 72 ° C i 1 min, efterfulgt af en sidste udvidelse ved 72 ° C i 10 min. Hold prøverne ved 4 ° C.
    6. Rense prøve med en perler baseret rensning efter fabrikanten protokol.
    7. Vurdere kvalitet med en Bioanalyzer efter fabrikanten protokol.
11. Forberede prøverne for multipleksede sekventering
    Bemærk: De endelige beriget prøver indeholde puljer af enten 8 eller 16 indekserede biblioteker, baseret på størrelsen fange bibliotek og deraf følgende før fange pooling strategi. Det samlede antal indekserede biblioteker, der kan være multipleksede i en enkelt sekventering lane bestemmes af output specifikationer af platformen bruges sammen med mængden af sequencing data, der kræves for at fange bibliotek.
    1. Beregne antallet af indekser, kan kombineres pr. vognbane, ifølge kapacitet af platformen. Det samlede antal indekserede biblioteker, der kan være multipleksede i en enkelt sekventering lane bestemmes af output specifikationer af platformen bruges sammen med mængden af sequencing data, der kræves for at fange bibliotek. For eksempel, for menneskelige alle Exon v5 bibliotek, den anbefalede Sequencing Data pr. indekseret bibliotek er 4 Gb og den anbefalede Sequencing Data pr. præ capture Pool er 32 Gb (8-indeks pools).
12. Sekvens af biblioteker.
    1. Indlæse biblioteker på den næste generation sequencing platform af valg og udføre sekvenseringen køre specifikationerne instrument.
13. Analysere exome sequencing data.
    1. Køre rørledningen og software valg for base kald. For eksempel, brug Stampy kort læser²⁰, fjerne dubletter med Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) og identificere enkelt nucleotid polymorfier og indsættelse eller sletning af baser (indels) med Platypus²¹. Filtrer synonymt varianter og dem observeret en allel frekvens < 5% og sammenligne data med dem fra forældrenes exomes til at identificere de novo varianter.

4. plasmid DNA forberedelse til In Utero elektroporation

1. Designe flere korte hårnål RNA'er (shRNAs) rettet mod enten den kodende sekvens eller 3' UTR af kandidat gener som tidligere beskrevet²².
2. For at forhindre væk fra målet test virkninger shRNAs specificitet ved BLAST søgning mod databaser ved hjælp af standard metoder. Udelukke shRNAs viser mere end 50% af komplementaritet med andre rotte gener.
3. Klon udglødet oligonukleotider i en mU6-pro vektor som beskrevet tidligere²³.
4. Rense plasmid DNA med en Maxi-prep ifølge producentens anvisninger og gøre en endelig koncentration på 3 µg/µL.
5. Alikvot 20 µl DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-NGL enten alene eller sammen med 1,5 mg/ml af shRNA konstruere) og Tilføj 2 µL af hurtige grøn farvestof (2 mg/mL) til at tillade visuelle overvågning af injektion.

5. in Utero elektroporation

1. Kirurgisk procedure
   1. Bedøver E15.5 gravid hunrotter (E0 blev defineret som dag i bekræftelse af sæd-positive vaginal plug), ved hjælp af en kombination med en blanding af ketamin/xylazin (0,1 og 0,01 mg / body vægt, henholdsvis), som er givet via en intraperitoneal injektion for bedøvelsesmiddel induktion.
   2. Sørg for, at dyret er fuldt bedøvede ved at observere forsvinden af tå knivspids refleks.
   3. Barbere dyrets underlivet ved hjælp af en clipper for at fjerne skind. Desinficere huden ved hjælp af scrubs af povidon-jod og 70% alkohol. Anvende dyrlæge salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
   4. Placere dyret på en varmekilde og sætte en steril drapere (med et åbent vindue på 4-5 cm i midten) over stedet, incisionen. Bære dykkermasker, laboratoriekittel, caps og steril kirurgiske handsker. Bevare steriliteten indtil slutningen af operationen.
   5. Ved hjælp af skarpe saks lave et lodret snit (2-2,5 cm) i huden langs midterlinjen i caudale del af maven og derefter foretage et snit af muskel væg under huden – også på 2,5 cm — langs midterlinjen.
   6. Omhyggeligt udsætte en uterin horn fra bughulen. Drop 37 ° C pre varmede normale saltopløsning til at fugte embryoner. Holde livmoderen fugtig hele tiden.
2. Injektion af DNA og elektroporation
   1. Hold en af uterin hornene forsigtigt med ringmærket pincet og skub forsigtigt et embryon til livmodervæggen. Holde fosteret i den ene hånd og med anden hånd Indsæt omhyggeligt glas kapillærer 1 mm fra midterlinjen i den venstre lateral ventrikel (2-3 mm dyb) og injiceres ca 1 µL af DNA med hurtigt grøn tillade visuelle overvågning af injektion ved hjælp af en microinjector.
   2. Drop normale saltopløsning på 3 x 7 mm² elektroder overflade. Placer den positive sterile elektrode på den injicerede side (venstre lateral ventrikel) og negative sterile elektrode på højre hjertekammer. Levere 5 elektriske impulser med 950 ms mellemrum med en mund-kontrollerede pedal (4000 mF kondensator opkrævet til 40 V med en electroporator).
3. Post elektroporation procedurer
   1. Sætte tilbage uterin horn til bughulen, tilføje dråber af normale saltopløsning til hulrummet at tillade embryoner placeret mere naturligt og der tages højde for intraoperativ væsketab.
   2. Luk mavemuskel væg med resorberbare kirurgiske suturer, derefter huden ved hjælp af en simpel-afbrudt søm.
   3. Sætte rotten tilbage til buret og overvåge dyret, indtil det fremgår af anæstesi.
   4. Til smertebehandling administreres buprenorphin (0,03 mg/kg) til dyret ved en subkutan injektion hver 8-12 h, for op til 48 timer.

6. hjerne prøveforberedelse

1. Fiksering metode
   1. Ofre den gravid rotte 5 dage efter den kirurgiske procedure bruger gas anæstesi (isofluran) efterfulgt af en hurtig cervikal dislokation.
   2. Gøre et lodret snit til at genåbne i bughulen.
   3. Udsætte de uterine horn, fjerne embryoner fra livmoderen og Hug hovedet af dem ved hjælp af skarp saks.
   4. Fjerne hjernen med minimal skade på væv: bruger skarpe saks, gør et lille snit langs posterior (cerebellum) / anterior (olfactive pærer) akse af hovedet til at gennembore huden og kraniet, derefter ved hjælp af et par pincet skræl væk kraniet at udsætte den hjerne og fjerne det ved hjælp af en lille spatel.
   5. Fordyb hjerner natten over ved 4 ° C i en 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x fosfat Buffered saltvand (PBS).
2. Hjernen skæring
   1. Vask hjerner i 1 x PBS i 10 min.
   2. Integrere hjerner i 4% agar i plast indlejring forme.
      1. Forberede 50 mL 4% agar i 1 x PBS for indlejring 5 embryonale hjerner. Sikre at opløste Agarosen er på mere end 50 ° C.
   3. Holde hjerner i Agarosen at polymerisere i mindst 1 time ved 4° C. Fjern overskydende Agarosen omkring hjernen.
   4. Lim hjernen til at vibratome bundplade, orienteret så den forreste/posterior akse af hjernen er vinkelret på vingen. Vent et par minutter for limen tørre og placere plade med limet hjernen i vibratome afdeling.
   5. Fyld vibratome med 1 x PBS. Skær 100 µm tykt sektioner.
   6. Overføre hjernen skiver på dias, fjerne overskydende væske, tilsættes et par dråber af montering medium og placere en coverslip på toppen af hjerner

7. Konfokal Imaging og kvantitativ analyse

1. Lad den montering medium tørre natten over før imaging. Billede sektioner på 10 X på en laser-scanning Konfokal mikroskop.
2. Ved hjælp af software til kvantitative billedanalyse, konvertere billedet i 8-bit, skal du vælge én repræsentant normal god landbrugspraksis positive fluorescerende celle og manuelt angive sin form. For at gøre det, skal du klikke på "Skøn" og trække kanten af den celle ved hjælp af værktøjet frihånd markering. I denne tilbageholdes måde diameter og intensitet tærskel på cellen automatisk af softwaren.
3. Klik på "Find celler" at indrømme programmel hen til lokalisere transfekteret celler i cortex. Derefter, hvis det er nødvendigt, manuelt fjerne falske positiver.
4. Opdele hele tykkelsen af cortex i 8 områder af interesse normaliseret i enkelte afsnit. For at opnå dette, skal du klikke på "Region værktøj", Vælg 8 "Region striber" hvor først (1) og sidst (8) striber svarer til VZ og til toppen af CP henholdsvis. Klik på "Anvend" på indrømme programmel hen til tælle den relative placering af normal god landbrugspraksis transfekteret celler i hele cortex. Til sidst klik på "Gem kvantificering" eksportere data i en Excel-fil til analyse.

Representative Results

Den eksperimentelle strategi designet til at identificere roman MCD sygdomsfremkaldende gener er sammenfattet i figur 1.

Ved at udføre array-CGH i en kohorte af 155 patienter med udviklingsmæssige hjernen abnormiteter trinløst kombinerer PNH (figur 2A), corpus callosum dysgenese, colpocephaly, cerebellær hypoplasi og polymicrogyria forbundet med epilepsi, ataksi og kognitiv svækkelse, vi identificeret en 1,2 Mb minimal kritiske sletning i 6q27 deles af 12 patienter (figur 2B)²¹. Genomisk regionen indeholder fire kendte gener (THBS2, PHF10, TCTE3 og DLL1) og to forudsagt gener (WDR27 og C6orf70) (figur 2B).

Parallelt til array-CGH WES analyse i 14 patienter med isoleret bilaterale PNH og ingen kopi antal variationer analyse blev udført, at identificere en patient med en de novo mutation (c.752T > A: pIle250Asn) hos den forudsagte C6orf70 gen ( Genbank stammesamlingsnummer NM_018341.1) (figur 3).

At bekræfte, at mutationen identificeret i C6orf70 haft en forårsagende rolle i PNH og undersøge, om haploinsufficiency af andre gener kortlægning i 6q27 kan påvirke fænotype blev deres rolle i vivo neuronal migration udforsket ved hjælp af i utero RNAi-medieret knockdown tilgang^23,24 til tavshed deres udtryk i rotte kortikale neurale stamceller. Kun gener udtrykt i den tredje rotte cortex, PHF10, C6orf70 og DLL1, blev testet (figur 4A). Forskellige kort hårnål RNA'er (shRNAs) blev genereret målretning kodning sekvenser af disse tre gener. ShRNAs blev derefter introduceret til neuroprogenitors i rotte neocortex af i utero elektroporation i embryonale dag 15 (E15), når neuroner forpligtet til øverste kortikale lag er genereret. Grøn fluorescerende proteiner blev anvendt som Transfektion reporter. Relative fordeling af normal god landbrugspraksis-positive celler blev undersøgt 5 dage efter elektroporation. Knockdown af Dll1 og Phf10 resulterede i en mindre forsinkelse af radial neuronal migration (data ikke vist), hvorimod knockdown af C6orf70 nedsat neuronal migration og gav anledning til udvikling af heterotopisk knuder meget minder om dem, observeret i Flna knockdown model (figur 4B)²⁴. Omvendt havde transfections med den ineffektive C6orf70 uoverensstemmelse shRNA ingen indlysende konsekvenser på neuronal migration (figur 4B).

Figur 1: Arbejdsgang for identifikation af roman MCD sygdomsfremkaldende gener identifikation. Skematisk fremstilling af de forskellige tilgange, der kan bruges til at identificere nye sygdomsfremkaldende gener. Kasser farvet i gul repræsenterer metoderne beskrevet i den nuværende papir. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: 6q27 sletninger forårsage unormal hjernens udvikling med PNH. (A) patienten 2. T2-vejet koronale (venstre panel) og T1-vejet aksial (højre panel) afsnit viser PNH foring væggen i venstre tindingelappen (hvid og sort pilespids) under et udfoldet økarakter cortex. (B) patienten 11. T1-vægtet koronale sektion, viser bilaterale heterotopisk knuder langs væggene i de tidsmæssige horn (hvid pilespidser). (C) patienten 12. T2-vejet koronale sektion. PNH er stadig synlige (sort pilespids) til venstre, og hjertekamrene er forstørrede. (D) skematisk gengivelse af sletninger af det 6q27 område, som identificeres i PNH patienter ved hjælp af array-CGH (øverste del). De vandrette stiplede linjer repræsenterer sletninger identificeret i patienter. Størrelsen af den minimale kritiske slettet regionen er også indiceret og indeholder fire kendte gener: THBS2, PHF10, TCTE3 og DLL1 og to forudsagte gener: WDR27 og C6orf70 (øverste del). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Sekventering resultater. ( ) T2 - vægtede aksial sektion viser bilaterale PNH i frontal horn (hvid pilespidser) i patienten bærer c.752T > en mutation i C6orf70. (B) Sanger sekventering viser, at opstod mutationen identificeret af WES de novo. Placeringen af mutation er angivet med sort pilehoveder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Udtryk analyse af de gener, der er lokaliseret i 6q27 minimal kritiske region og C6orf70-knockdown ændrer radial migration af kortikale neuroner. (A) kvantitativ RT-PCR viser udtrykket af gener i regionen 6q27 kritisk i hjernebarken rotte. Cyclophilin A blev brugt til normalisering. (B) repræsentative neocortical koronale sektioner af E20 rat brains 5 dage efter elektroporation med enten grøn fluorescerende proteiner konstruere alene (kontrol), eller kombineret med shRNA målretning C6orf70 kodende sekvens (C6orf70-shCDS) eller med den relative ineffektive uoverensstemmelse konstruere (C6orf70-shCDSmm). Flna -knockdown (FLNA-shCDS) blev brugt som kontrol af nedsat neuronal migration. In utero elektroporation med enten C6orf70-shCDS eller FLNA-shCDS induceret anholdelsen af normal god landbrugspraksis-positive celler i den ventrikulære zone (VZ) (hvide pile), mens de celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis, alene eller i kombination med uoverensstemmelsen konstruere ændre ikke neuronal migration. Skalere barer = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

MCDs er vigtige årsager til intellektuelle handicap og tegner sig for 20-40% af resistente barndom epilepsi^1,2. Interesse i MCDs er steget dramatisk i de seneste ti år som følge af to hovedfaktorer. Først er forbedringen i brain imaging (især Mr), som giver mulighed for læger og videnskabsfolk til at visualisere mange hjernen misdannelser, der ikke var tidligere genkendt. Den anden er udvikling af genetiske værktøjer, der har tilladt identifikation af mange nye MCD sygdomsfremkaldende gener. Dette har stærkt forbedret vores kendskab til de mekanismer, der ligger til grund for hjernens udvikling og funktion, og tilladt for mere nøjagtig genetisk rådgivning.

Tidligere fokuseret forskere deres indsats primært på forårsagende gen identifikation, forlader design af funktionelle assays til at afklare deres rolle i hjernens udvikling at senere faser. Det er blevet vanskeligere på grund af progression fra undersøgelsen af sjældne, tilbagevendende genetiske sygdomme til mere almindelige sporadiske forstyrrelser for hvilken traditionelle gen at finde metoder ikke er indstillet. Nuværende metoder til at identificere sygdomsfremkaldende gener ofte tillader identifikation af relativt store regioner i genomet som indeholder mange gener (array-CGH) eller flere varianter i en række af kandidat gener, som er svære at validere (WES eller WGS).

Array-CGH og WES (eller WGS) tilgange har udvidet mutation frekvenser til mange genetiske sygdomme. Ikke desto mindre stadig nogle kritiske begrænsninger. For eksempel array-CGH behov for høj kvalitet DNA og undlader at identificere balancerede translokationer eller små sletninger/gengangere herunder dem, der vedrører én eller få exons af et enkelt gen. For at løse dette problem, kan array-CGH udføres med en højere opløsning end konventionelle sonde afstand (f.eks. ved hjælp af 1 M array-CGH kit) eller erstattes med SNP-array analyse. WES ofte dækker ikke store intragenic regioner og undlader at identificere dybt intronic mutationer. Hertil kommer, kan undertiden dækning være for lav til at identificere sygdomsfremkaldende mutationer (især i tilfælde af mutationer med lav procentdel af mosaicisme). En anden afgørende skridt for WES er at dataanalyse og filtrering stadig kræve en betydelig indsats. For at øge dækningen af WES, nedsættes antallet af patienter i en enkelt eksperiment eller anden fange kits kan bruges samtidig.

IUE er den mest hensigtsmæssige metode til at analysere virkningen af gener knockdown på neuronal migration. Dog, undersøgelser på andre trin af kortikale udviklingsmæssige, såsom neurogenese og neuronal modning, hæmmet af visse tekniske begrænsninger. Faktisk, IUE udføres før E13 er ofte mislykkede, mens undersøgelser i senere faser er begrænset af den høje sats af postnatal dødelighed forbundet til denne procedure. Desuden kan gen-knockdown effektivitet variere blandt electroporated embryoner fører til betydelige fænotypiske heterogenitet.

Samlet set har denne protokol fire store kritiske trin. Selv om det ikke er en del af den protokol, der er beskrevet i den nuværende papir, nødt vi til at påpege, at det første grundlæggende skridt skal tages hensyn til udvælgelse af patienter til at blive indskrevet i disse undersøgelser. Faktisk, processen med at identificere roman MCD gener kræver kliniske og billeddiagnostiske undersøgelser i en kohorte af patienter for hvem fænotype bør være så ensartet som muligt. Indsamling af patienter med meget homogene fænotype øger chancen for at identificere sygdomsfremkaldende mutationer i et givent gen. Det mindste antal patienter at være indskrevet i disse undersøgelser til at opnå succes er imidlertid svært at forudsige, da det stærkt afhænger af mutation satsen for de forskellige gener. For eksempel for gener såsom FLNA, som er muteret i 100% af familiær tilfælde af X-linked bilaterale PNH og 26% af sporadiske patienter, kunne antallet af patienter, der er nødvendige for at identificere flere hits i genet være forholdsvis lav. Omvendt, for gener med lav Mutationshastighed, antallet af patienter skal screenes er højere. For eksempel, i tilfælde af C6orf70, vi var i stand til at identificere en enkelt sygdomsfremkaldende mutation kun efter screening 64 patienter (14 gennem WES og 50 gennem konventionelle Sanger sekventering)¹⁶, estimering en mutation satsen for dette gen på omkring 1,5%. Det andet vigtige skridt er udelukkelse af mutationer i alle kendte MCD gener for at identificere nye sygdomsfremkaldende gener. Takket være fremkomsten af nye næste generation sequencing teknologier, kan mutation screening af kendte og kandidat gener nu udføres i en enkelt eksperiment. Dog bør relevante varianter filtrering bruges til at undgå tilstedeværelsen af et stort antal falske positiver eksperimentelt bekræftet og at bortfiltrere potentielt sygdomsfremkaldende mutationer. Faktisk, antallet af kandidat gener/varianter er særlig høj i WES eksperimenter. Hvis inddragelse af et bestemt gen er mistanke, bør mutation screening også suppleres af MLPA analyse, at udelukke microdeletions eller microduplications. Det tredje kritiske punkt er, at kromosomale rearrangementer påvirkes kraftigt af placeringen af pausepunktet. I denne forbindelse er det værd at udelukke, at i videst muligt omfang, driftsforstyrrelser eller forskydning af cis-regulerende elementer distalt for gener ikke inkluderet i sletning/dobbeltarbejde. Endelig, i vivo RNAi eksperimenter antager, at sygdomsfremkaldende gener spiller en direkte rolle i neuronal migration under vorden. Men ætiologien af MCD, herunder PNH, er heterogene og i utero tilgang kunne undlade at registrere virkningerne af gener involveret i udviklingsmæssige trin herunder neuronal spredning eller celle overlevelse. Derudover kunne lav kompleksitet af gnaver hjernen maskere virkningen af knockdown eller overekspression af en given kandidat gen, som kan være mere tydelig i den menneskelige hjerne.

Vi mener, at integration af genomforskning og i vivo funktionelle studier vil bidrage til at udvikle nye diagnostiske redskaber til identifikation af nye MCD sygdomsfremkaldende gener. Denne strategi kunne også give nye dyremodeller for at teste terapeutiske mål og forstå MCD, Patofysiologi, som har hidtil været begrænset af manglen eksperimentelle modeller og begrænset adgang til hjernevæv fra ramte patienter. Decifrere de molekylære processer, der er knyttet til MCD vil lidelser også give værdifulde nye oplysninger om fysiologiske hjerne udvikling generelt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine