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Bioengineering

세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

조직 지지체는 조직 재생 과정에서 중요한 역할을한다. 이상적인 발판는 데 적절한 구성, 대상 계수, 잘 정의 된 아키텍처 기능 같은 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 생체 조직의 고유 아키텍처를 요점을 되풀이 생체 적합 물질은 질병을 공부뿐만 아니라 손실과 잘못된 연부 조직의 재생을 촉진하기 위해 매우 중요합니다. 신규 biofabrication 기술이 연구 및 임상 적 적용을위한 생체 재료의 새로운 세대를 만들 아트 화상, 3 차원 (3D) 인쇄, 선택적 효소의 활성 상태를 결합하는 개발되었다. 개발 한 물질, 소 혈청 알부민 고무 특정 기하학적 특징을 지탱 몰드에 주입 반응이다. 이 희생 물질은 자연 골격 물질에 건축 기능의 적절한 전송을 할 수 있습니다. 프로토 타입은 4 3mm 채널에 repr로 3D 콜라겐 지지체로 구성분 지형 구조를 ESENT. 이 논문은 자연 구조의 생성이 biofabrication 기술의 사용을 강조한다. 이 프로토콜은 컴퓨터 지원 소프트웨어 (CAD) 골격 물질 내에서 구조적 특징을두고 고무의 효소 소화 하였다 BSA 고무 주입 반응 것이다 고형 금형 제조를 이용한다.

Introduction

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조직 공학 분야에서 조직 지지체를 제조하는 능력은 중요하다. 적합한 조직 골격이 3 차원 구조를 갖는 생체 적합성 재료로 구성되고, 생체 조직의 구조를 모방은 세포 및 조직의 성장 및 리모델링을 용이. 이 비계는 영양분의 수송 및 폐기물 1-4의 제거를 허용해야합니다. 이러한 지지체의 제조에서 주요 장애물 중 하나는 생체 적합성 물질로 특정 기하학적 특징 요점을 되풀이하는 능력이다. 몇몇 biofabrication 기술은 이러한 지지체의 기하학적 특징을 조절하는 것으로보고 된, 예로는 용매 캐스팅 9 조형 10 5-8 전기 방사되고, 그 중에서도 11 차원 인자. 이러한 기술은 제어 내부 및 외부 건축 기능을 상대적으로 쉽게 전송을 제공하는 짧은 가을, 비싼, 그들의 해상도와 인쇄 적성 (에 의해 제한되어 있습니다 (12)를 생성하기 위해 장시간을 요구 후 제조 기술을 필요로한다.

많은 상용 제조 시스템에서, 내부 보이드, 채널 및 기능 생성 모래 또는 다른 적합한 이동식 또는 희생 물질을 사용하여 달성된다. 금속 또는 플라스틱 부분 사형 주위에 형성되고, 그것이 경화되면, 모래가 제거된다. 거의 같은 방법으로, 생체 물질의 차세대 biosand 당량이 필요하다. 따라서, BSA 고무 biosand위한 대용품으로 개발되었다. BSA 고무는 글루 타르 알데히드와 가교 결합 소 혈청 알부민으로 구성된 신규 제형 재료이다. 궁극적 인 목표는 생분해 성 콜라겐 지지체에 특정 건축 기능을 다시하는 것입니다. 원 조직의 금형 치수 충실도를 유지하는 희생 biorubber의 특성을 설명한다.

생체 조직 탄성 관심 조직의 다른 특성을 모방하기 위해 동조 될 수있는 높은 정확도를 가진 비교적 쉽고 적시 문제에 생분해 성 물질의 특정 기하학적 유익을 제공하기 위해 실행 가능한 기술을 제공한다.

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Protocol

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1. 콜라겐 배치에서 고체의 비율을 결정

  1. 이전에 게시 된 절차 (13) 다음 콜라겐을 추출합니다. 콜라겐 20ml의 최소 해동. 형성된 하이드로 겔에서 콜라겐 농도를 조작하기 위해 배치 콜라겐 고체의 초기 비율을 결정한다.
    1. 알루미늄 호일 (약 6 × 6cm)의 세 가지 컷 25 ㎖ 비이커의 바닥을 사용하여 팬과 같은 각을 형성. 각 팬의 무게를 기록한다.
    2. 각 팬에 콜라겐을 소량 첨가하고 알루미늄 팬 콜라겐의 총 중량을 기록한다. 각 알루미늄 팬에 콜라겐의 0.8 g - 0.5를 추가합니다.
      주 :이 단계 후에,이 세 알루미늄 포일 팬은 각각 하나가 콜라겐의 소량을 가져야한다. 각 (총 3) 빈 알루미늄 팬의 무게와 콜라겐을 첨가 한 후 팬의 무게를 기록해야합니다.
    3. F를 사용하여 각 팬에서 콜라겐의 중량을 계산공식을 따르게 :
      콜라겐 무게 = 팬과 콜라겐 중량 - 팬 중량
    4. 24 시간 동안 100 ° C에서 오븐에 콜라겐을 보유하고있는 세 개의 알루미늄 팬을 놓습니다.
    5. 24 시간 후, 각각 알루미늄 팬의 중량 및 탈수 콜라겐을 기록한다.
    6. 다음 식을 이용하여 탈수 콜라겐의 중량을 계산한다 :
      탈수 콜라겐 무게 = 팬 탈수 콜라겐 중량 - 팬 중량
    7. 3 개의 시료는 아래 공식을 사용하여 콜라겐 고형분 농도를 결정하기 위해 고체의 비율을 계산한다 :
      식 (2)
    8. 3 개의 시료 각각 콜라겐 고형분의 비율을 이용하여 배치의 평균 콜라겐 고체 함량을 계산한다.
      참고 : 사용되는 콜라겐 수화 콜라겐 남아있는 것입니다. 탈수 콜라겐 중 어느 것도 사용되지 않습니다.
    9. 콜라겐 고체 (난의 비율을 결정한 후일괄 nitial 콜라겐 농도)을 남아있는 수화 된 콜라겐을 계속. 3 콜라겐 배치의 pH를 조정하는 보정 pH 미터를 사용한다.
      1. 소량 (12) N 염산 (HCL)의 (한 번에 2-5 μL)를 추가합니다. 항상 얼음에 보관하십시오. 콜라겐에 직접 염산 없어 - 튜브의 측면에 의해 산을 추가한다. 산을 첨가 한 후, 콜라겐 산 밀어 주걱을 사용하여 신속하게 혼합 교반한다.
    10. 이 3의 pH에​​ 도달하면, 콜라겐은 4 ℃에서 O / N을 앉아 보자.

BSA 고무 2. 준비

  1. 아래의 절차에 따라 소 혈청 알부민 (BSA) 솔루션을 준비합니다.
    1. 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 0.02 M PBS 용액을 만들기 위해 물 100ml에 두 개의 PBS 정제를 추가합니다.
    2. 아래 절차를 이용하여 30 %의 BSA 용액을 만들기 위해 2 × PBS로 BSA를 결합.
      1. 예를 들어, 2 × PBS 30 ㎖로 30 % BSA을 BSA 12.9 g을 사용한다. 교반 막대와 플라스크에 2 배 PBS (예를 들어, 10 ㎖)의 1/3을 추가합니다. 플라스크에 BSA (예를 들어, 6.45 g의 BSA)의 1/2을 추가하고 주걱을 사용하여 건조 용질 젖은.
      2. 모든 용질 때까지 PBS 다음 BSA를 추가하는이 과정을 반복하고 용매 플라스크에있다. 모든 용질 젖은 주걱을 사용합니다. 그것은 몇 가지 액체 덩어리의 혼합물과 같이 표시됩니다. 이 약 30 분 동안 앉아 보자.
      3. 그런 다음, 낮은 사이클에 교반기를 켜고 교반 막대 주위에 덩어리가 없는지 확인합니다. 이 솔루션의 모든 것을 얻기 위해 90 분 소요 또는 4 ℃에서 O / N 감동을 둘 수 있습니다. 용질 모두 용해 된 후, 20 ml의 시린지에 넣고 용액을 0.20 μm의 주사기 필터로 덮인. 필터를 통해 액체를 추방하고 새로운 튜브에 멸균 솔루션을 수집하는 플런저를 누르십시오. 4 ℃에서 보관하십시오.
    3. 3 % 글루 타르 알데히드의 soluti 준비멸균 여과 배 PBS와 25 % 글루 타르 알데히드 용액을 희석하여합니다. 예를 들어, 3 % 글루 타르 알데하이드 용액 10㎖를 들면, 2 내지 25 %의 글루 타르 알데히드 ㎖의 2 × 8 ml의 PBS를 사용한다. 4 ℃에서 보관하십시오.

3. 금형 치료

참고 :이 문서에 설명 된 프로토 타입은 사용자 정의 만든 스테인리스 Y 금형 조각을 사용합니다. 금형 유입 각각 4, 3mm, 두 유출 채널이 포함되어 있습니다. 첫째, 깨끗한 금형, 불포화 라드로 스프레이, 그들을 소독. 아래에 설명 된 절차에 따라 금형을 준비한다.

  1. 35 kHz의 주파수에서 초음파기를 사용하여 면도 스테인리스 금형. 소니 케이의 금형을 놓고 물과 얼음을 잠수함. 초음파 처리기가 실행되는 동안 항상 감기 금형을 유지합니다. 90 분 2 시간 동안 초음파 처리를 실행합니다.
    1. 각 기간 후에, 루어에는 재료는 스테인레스 강 또는 b을 잠글 수 없습니다가 있는지 확인하기 위해 바늘을 사용의 RAS 연결합니다. 금형의 양측의 전체 표면을 청소 비누와 물을 사용합니다. 채널에 장애물이 없는지 확인합니다.
  2. 오토 클레이브 봉지 형, 나사, 루어 락 커넥터를 배치하고 오토 클레이브.
  3. 시중에서 판매하는 돼지 기름 (혼합 지방산 이형제)와 공기 분무기 반 방식에 부착 병을 채 웁니다. 일반 캡 병 뚜껑을 교체합니다. 오토 클레이브 가방에 배치하고 오토 클레이브.
    주 : 라드 나중에 주입 반응 될 재료 (BSA 고무)의 방출을 용이하게하기 위해 사용된다. 이 내부 씰을 손상시킬 수 있습니다 autoclave-에 분무기 병 뚜껑을 올려 놓지 마십시오.
  4. 45 초 동안이나 전자 레인지에서의 명확하고 액체 때까지 돼지 기름을 따뜻하게. 돼지 기름 병에 공기 분무기 뚜껑을 나사. 분무기와 뚜껑을 연결합니다. 실험실 벤치에서 공기 소스에 분무기를 연결합니다. 공기 밸브를 개방하고,이 표면을 습윤 시작할 때까지 분무기의 노즐을 열고종이 수건.
  5. 표면이 완전히 피복 될 때까지 금형 표면에 수직 라드 스프레이. 각 조각은 분무 된 후, 배양 접시에 배치하고 밀봉. 2 시간 동안 4 ° C에서 금형을 놓습니다.
  6. 30 분 동안 UV 광에 노출시킴으로써 표면을 주형 살균 진행. 그들이 반응 주입 할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 그들을 다시 놓습니다.

BSA 고무 4. 반응 사출

참고 : 다음 단계에서 BSA 고무의 조기 설정을 방지하기 위해 사용할 준비가 될 때까지 모든 자료와 솔루션은 차가운 유지되어야한다.

  1. 다음 단계를 수행하여 금형에 BSA 고무를 전달하기위한 디스펜서를 준비합니다.
    1. 혼합 성분 모두 멸균 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 후드에서 30 분 동안 UV 광에 노출하여 (두 개의 O 링, 주사기 캡 이중 주사기 팁을 혼합하고, 4 일 디스펜서).
      참고 : PCR 후드가 t 있기 때문에 사용그 절차는 고정 제를 포함한다. 이러한 화학 물질로 인해 세포 독성에 대한 노출의 위험을 세포 / 조직 배양 후드에서 사용될 수 없다. 자외선이 포함되어 다른 후드가 적합 할 것이다.
    2. 솔루션 홀더에 끝 캡을 배치합니다.
    3. BSA의 1 비율 : 4로 혼합 및 주입을 수행 글루 타르 알데히드를. 솔루션의 가장 높은 금액을 제공 할 것입니다 이중 주사기 챔버에 30 % BSA를 추가 (그것은 채우기 위해 약 4 mL를 취하여 것입니다). 인접 실의 범람과 오염을 방지하기 위해 O 링을 배치하기에 충분한 공간을 남겨해야합니다.
    4. 다른 챔버에 3 % 글루 타르 알데히드 용액을 추가 (그것은 채우기 위해 약 1 mL를 취하여 것입니다). 인접 실의 범람과 오염을 방지하기 위해 O 링을 배치하기에 충분한 공간을 남겨해야합니다.
    5. 디스펜서에 이중 주사기를 놓습니다. 주사기 캡 상단에 위치하도록 수직으로 어셈블리를 기울입니다. 믹싱 팁 캡을 교체합니다.
    6. 사우스 캐롤라이나두 함께 스테인리스 금형 조각 REW.
    7. 오토 클레이브 가방의 내부 어셈블리를 놓습니다.
    8. 디스펜서의 모든 공기를 제거하려면 수직 위치에 고정 빠르게 핸들을 글루 타르 알데히드와 혼합 BSA의 작은 금액을 해제 한 시간을 짠다. 그런 다음 신속하게 주사기 팁에 스테인리스 Y 금형의 루어 락 커넥터를 연결합니다.
    9. 왼쪽과 오른쪽에 BSA-글루 타르 알데히드 혼합물을 디스펜서 스테인리스 Y 금형 잡아. 다른 내부 보이드 용액으로 채워 확인 압력솥 백 측면에 배기를 누름으로써 유출 채널의 좌우의 배기를 각각 덮는. 그리고, 가로 금형을 배치 한 후 다시 주입.
    10. 25mm 페트리 접시에 디스펜서와 장소에서 금형을 분리합니다.
    11. 고무의 탈수를 방지하기 위해 페트리 접시 주위에 파라 필름을 배치합니다.
    12. 4 ° C 냉장고 O / N의 금형을 놓습니다.

주 : 콜라겐 과정 항상 얼음에 보관해야한다.

  1. 콜라겐 고형분의 비율을 사용하여 콜라겐 농도를 수정한다.
    1. 찬물로 초기 콜라겐 농도를 조정하여 1.75 %의 콜라겐 10 ㎖를 확인합니다.
    2. 조정 pH 측정기를 사용하여, 12 N 염산을 사용하여 pH 3를 조정한다. 콜라겐에 직접 염산 않는다 튜브의 측면에 의해 산을 추가한다. 산을 첨가 한 후, 콜라겐에 의해 산을 밀어 주걱을 사용하여 신속하게 혼합 교반한다.
    3. 별도의 원뿔 튜브에 콜라겐 4g의 무게를.
    4. 4 ° C와 20 ~ 30 분 동안 9,343 XG에서 공기를 제거하기 위해 콜라겐을 원심 분리기.
    5. 30 분 동안 세포 배양 후드 살균 및 4 ml의 콜라겐 라미닌의 14 μL를 추가 UV. 이 10 μg의 / μL의 최종 라미닌 농도가 발생합니다. 참고 : 라미닌이들 제공tructural 무결성, 접착 및 다양한 세포 반응을 촉진한다.
    6. 이전 살균 후드를 사용하여 PCR UV는 20 ~ 30 분에 불을 켭니다.
    7. 2 시간 동안 에탄올, 20 ML의 주사기에 부착, 루어 잠금 캡을 놓습니다. 그리고, 건조 및 자외선에 배치 할 수 있습니다.
    8. 감마 1200 cGy의 도달하도록 8.6 분간 콜라겐을 조사.
      주 : 시간 ​​세슘 소스의 감쇠에 의존 할 것이다. 동일한 투여 량에 도달하는 시간을 조정한다.

BSA 고무에 콜라겐을 6.Casting

  1. 1 : 1의 비율 (콜라겐 : HEPES : MEM) 콜라겐을 중합하려면 8을 사용합니다. 다음 절차 (단계 5.1.8)에서 산성화 콜라겐의 초기 4g에 기초한다.
    1. 물에 0.2 N HEPES 용액을 만들고, 1-5 M 수산화 나트륨 (NaOH) 용액을 소량의 (1-5 μL)을 첨가하여 9 pH를 조정한다. 조정 pH 측정기를 사용하여, 각각을 첨가 한 후, 용액의 pH를 모니터링한다. 4 ° C 또는 케에서 보관얼음에 EP.
    2. 후드를 소독하기 위해 20 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드의 자외선을 켭니다.
    3. 오토 클레이브 집게, 주걱, 살균 용 메스.
    4. 조직 문화 후드를 사용하여 0.2 N HEPES (pH가 9) 및 ml의 10 배 MEM 1.5의 1.5 ml의 혼합. 사용하기 전에 5 초 동안 얼음과 소용돌이를 잘 보관해야합니다. 4 ° C에서 보관 또는 얼음에 보관하십시오.
    5. PCR 후드를 소독하기 위해 30 분 동안 자외선을 켭니다.
    6. 10 분 동안 -20 ° C에서 12 웰 플레이트와 20 ML의 주사기를 놓고, 또는 준비가 될 때까지 계속합니다. 참고 : 사용할 준비가 될 때까지 차가운 모든 자료를 보관하십시오. 온도의 증가는 조기 콜라겐 fibrillogenesis를 유도한다.
    7. 70 % 에탄올로 후드에 살균하기에 건조 할 예정 모든 튜브와 웰 플레이트 스프레이. 나중에 사용하기 위해 냉각 얼음에 20 ML의 주사기를 놓습니다.
    8. PCR 후드, BSA 고무 메스를 사용 해제하는 스테인리스 금형을 열 BSA (R)의 배출 채널 컷ubber 금형.
    9. PCR 후드에서 HEPES-MEM 용액 1 ㎖를 멸균 콜라겐 튜브를 열고 추가 (확인 그것이 잘 혼합 더 단단한 보증금은 없는지, HEPES-MEM 솔루션을 추출하기 전에).
    10. 멸균 주걱을 사용하여, 철저하게 콜라겐과 완충 용액을 혼합한다.
    11. 닫기과 소용돌이 신속하게 잘 혼합 된 하이드로 겔을 보장합니다.
    12. 차가운 20 ML의 주사기에 전송합니다.
    13. 한 손으로도 내부 BSA 고무를 누르고, 다른 쪽을 이용하여, 웰의 바닥에 콜라겐 겔 용액의 절반을 분배.
    14. 멸균 핀셋을 사용하여, 고무 유입과 유출 끝이 아니라의 측면에 접촉되어 있는지 확인합니다.
    15. 완전히 덮여 때까지 고무의 상단에 콜라겐 솔루션을 따르십시오.
    16. BSA 고무가 콜라겐 내에서 정지되어 있고, 특히 고무의 끝 근처에 거품이 없는지 확인합니다.
    17. 덮개를 놓고 주위 파라 필름 포장잘 둘레.
    18. 37 ° C에서 1 시간 동안 인큐베이터에 넣어. 의 PCR 자외선을 유지합니다.
  2. 콜라겐의 중합 후, UV는하기 절차를 가교 하이드로 겔.
    주 : 콜라겐 가교 에너지의 양을 제어 할 수있는 UV 가교제 장치를 사용하여 수행한다.
    1. UV 가교제를 켜고 63 μJ / ㎠로 빈 챔버를 조사하는 에너지 설정을 사용합니다.
    2. 인큐베이터에서 젤을 제거합니다.
    3. 에탄올로 손을 스프레이하고, 챔버 내에서 가능한 한 빨리 뚜껑을 제거합니다.
    4. 챔버를 닫고 UV 에너지 설정을 선택하고 63 μJ / ㎠를 조사하여 하이드로 겔을 가교.
    5. 가교주기 후, PCR 후드에 자외선을 해제
    6. 에탄올로 손 스프레이 빠르게 웰 플레이트에 다시 뚜껑을 배치, 챔버를 엽니 다. 잘 플레이트를 이동PCR의 후드.
    7. 부드럽게 풀어 우물에서 젤을 제거, 멸균 주걱을 사용. 하이드로 겔의 바닥 가교 후드 겔 플립. 단계를 반복 6.2.3과 6.2.4.

BSA 고무 7. 효소 소화

  1. 중공 콜라겐 지지체를 위해, 하이드로 겔에 포함 된 차원에 영향을주지 않는 방식으로 BSA 고무를 제거한다. 절차는 다음과 같다.
    1. 조직 문화 후드를 소독하기 위해 20 ~ 30 분 동안 자외선을 켭니다.
    2. 0.25 % 트립신 용액의 pH 7.8을 확인합니다. 예를 들어, 물 15 mL를 들어, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 트립신 0.0376 g을 추가한다. 1 M NaCl을 소량 (2-5 μL)을 추가하여 7.8로 pH를 조정합니다. 20 mL의 주사기에 넣고 용액을 0.20 μm의 주사기 필터로 덮인. 필터를 통해 액체를 추방하고 새로운 튜브에 멸균 솔루션을 수집하는 플런저를 누르십시오.
    3. 수조를 켜고 (30)의 온도를 설정기음.
    4. 30 분 후, 자외선을 끕니다. 후드에 사용되는 모든 튜브와 재료에 에탄올을 스프레이.
    5. 별도의 원뿔 관에서 후드와 장소에 따라 콜라겐 하이드로 겔을 전송합니다.
    6. 각 튜브에 7.8의 pH와 0.25 % 트립신 용액 (젤을 충당하기에 충분한) 약 3 ~ 5 ML을 추가합니다.
    7. 약 1 분 동안 가볍게 파라 필름과 소용돌이 튜브를 밀봉합니다.
    8. 15-24 시간 동안 30 ° C의 물을 욕조에 넣어. BSA 고무 소화 또는 하이드로 겔에서 제거 될 때까지 물을 욕조에있는 동안, 가볍게 자주 젤을 소용돌이.
      참고 : 위해 BSA 고무가 제거되었는지 확인하기 위해, 하나 고무 트립신 용액에 떠 또는 고장난 조각이있다. 하이드로 겔 내에서 시각적 어두운 부분이 없어야합니다.
  2. 아래에 설명 된대로 모든 BSA 고무 및 트립신은 하이드로 겔에서 제거되었는지 확인하기 위해, 린스.
    1. PCR의 ~이 켭니다20 ~ 30 분 동안 D 자외선.
    2. Mosconas 솔루션을 준비합니다. 물에서 염화칼륨 (KCl을, 28.6 mM)을 (수 NaHCO3 11.9 mM)을 포도당 (9.4 mM)을하고 (NaH를 2 PO 4, 0.08 mm)를 결합한다. 1 M NaOH를 12 M HCl 용액으로 pH 7.4까지를 조정합니다. 20 ML의 주사기에서 솔루션을 배치하고 솔루션을 소독하기 위해 0.20 ㎛의 주사기 필터를 사용합니다.
    3. 후드에 그들을 배치하기 전에 에탄올로 모든 스프레이 및 에탄올 건조 할 수 있습니다.
    4. 튜브를 열고 새 50 ML 원뿔 관에 멸균 Mosconas 솔루션의 5 ~ 10 mL로 전송합니다.
    5. 효소 용액을 포함하는 원뿔형 튜브에 콜라겐 겔을 전송. 하이드로 겔이 완전히 용액으로 덮여 있는지 확인합니다. 30 분 동안 4 ° C의 냉장고에있는 통에 튜브를 남겨주세요.
    6. Mosconas 솔루션과 두 번 단계를 반복 7.2.5을 대기음.
    7. 4 ℃에서 보관하십시오.

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Representative Results

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결과는이 기술이 biofabrication 생체 조직에서 본 공간 배열을 모방 할 수 3D 골격을 생성하는데 효율적임을 보여준다. 구조적 특징들은 조직의 생체 내 상호 작용 및 세포 기능에 중요한 역할을하는 조직 공학 응용을위한 중요한 파라미터이다.

BSA 고무의 일관성 및 균일 혼합 성이 그 의도 된 형상을 유지할 수 BSA 고무의 제조에서 중요한 파라미터이다. 단백질의 용해성은 단백질 - 단백질 상호 작용하고, 전체 단백질의 거동 변화를 유도 용매와 같은 분자간 상호 작용 효과에 의해 결정된다. BSA 용액의 전도도는 용액의 염 농도의 지표 인 측정 하였다. 표 1리스트를 combinatiBSA의 기능은, 용매, 및 글루 타르 알데히드 테스트. 예상 한 바와 같이, 가장 높은 전도도를 가지고 샘플 (2 × PBS 용매) BSA의 용해도를 촉진.

이 희생 물질의 개발을위한 적절한 조건을 결정하기 위해 사용되는 또 다른 파라미터는 반응 속도였다. 예상대로 BSA의 반응 시간이 증가 글루 타르 알데히드의 농도가 감소 하였다. 고정액은 아미노산의 α-아미노기 펩티드 N 말단 아미노기 및 시스테인의 설 프히 드릴 기와 반응한다. 글루 타르 알데히드는 분자간 공유 결합 (도 1A) (14)을 형성하는 리신 아미노기 통해 BSA와 주로 반응한다. 잠복기 후, 샘플은 증가 글루 타르 알데히드 농도 (그림 1B). 20 %, 30 %,와 강도 증가, 어두운 노란색과 갈색에 옅은 노란색에서 색상 변화를 보였다물에 2 % 글루 타르 알데히드와 D 40 % BSA는 고무를 형성하지 않았다. 40 % BSA 용액은 점도가 높기 때문에 상기 반응성 정착액에 따라 고무 강도를 변화 결과. 이 동작은 균일 단백질 사슬을 관통에서 글루 타르 알데히드의 어려움에 의해 발생 될 수있다. 용매는 크게 단백질의 용해도뿐만 아니라 정착액과의 반응에 영향을 주었다. 배 PBS 솔루션은 쉽게 혼합 가능한했다. 물 BSA 용액을 혼합하는 것이 어려웠습니다. BSA에 대한 용해도가 크게 단백질의 구조적 변경을 일으키는 용매 (표 2)의 전도도에 의해 영향을 받는다. 가장 유망한 샘플 1X PBS 및 배 PBS에서 3 % 글루 타르 알데히드로 30 % BSA였다.

고무 하중 지탱 력 수 있었던 것을 보장하기 위해, 압축 시험을 실시 하였다. BSA 고무의 4 개의 샘플의 기계적 특성을 측정 하였다 : 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드에서배 PBS, 1X PBS, PBS 1X PBS에서 2 배에서 20 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드 및​​ 20 % BSA 2 % 글루 타르 알데히드에서 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드. 사인파는 스트레스와 변형 곡선 (부록 그림 3)로 전송 부하 및 변위 곡선 (보충 그림 2) 사이의 아주 작은 상 변화를 보여 주었다. 응력 변형 곡선에 기초하여, 처음 세 개의 샘플 로딩 및 언 로딩 (도 2A-2C) 사이에 히스테리시스를 나타내었다. 이 세 가지 시편은 힘이인가 될 때 탄성과 점성 속성이 모두 포함 된 점탄성 물질로 행동했습니다. 20 % BSA 2 % 글루 타르 알데히드는 영구 변형 (그림 2D)의 흔적을 보여 주었다. 1X PBS와 2 배 PBS에서 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드는 비슷한 동작 (그림 2E 온로드 및 언로드 사이클)을 보여 주었다. 탄성율은 이들 4 개의 샘플 (도 2F)의 직선 부분에서 측정 하였다. 인산염 농도용매를 크게 테스트 범위 (p는 = 0.03)에서 탄성 계수 증가했다. 1X PBS에서 20 % BSA 2 % 글루 타르 알데히드는 낮은 탄성 계수를 나타내는, 쉽게 변형.

특정 시점에서 효소와 접촉하여 배치되면 고무의 효소 소화를 평가하기 위해, 반응 속도를 산출 BSA 고무의 소실에 기초 하였다. 효소 분해 과정은 배치 반응기로 처리 하였다. 치료 및 분해의 동력학을 수득 하였다 동결 건조 후에 남은 고무 종래부터 고무 농도와 비교.도 3은 글루 타르 알데하이드 및 BSA, 용매의 농도와 관련하여, 각 시료에 대한 반응 속도를 나타내고, 체류 시간. 명확한 경향은 가교제 농도 엔티티의 해리 반응 속도 사이에서 관찰되었다. 통계 학적 분석은 각각의 시점에서 실시 하였다. 일에 대한즉 15 시간 시점은 글루 타르 알데히드 농도는 상당히 0.02 AP 값 (부록 표 4)에서 얻어진 반응 속도에 영향을 미쳤다. 그 시점 이후, ​​글루 타르 알데히드 및 BSA 농도 모두 크게 레이트 (부록 표 5-7)에 영향을 미쳤다. 가장 유력한 요인은 전체보다 중요한 P 값에 의해 지시 된 글루 타르 알데히드 농도였다. 글루 타르 알데히드의 농도의 증가는 고무 엔티티 소화 반응 속도를 감소시켰다.

트립신 용해 된 단백질의 양은 BCA 분석 (도 4)를 사용하여 측정 하였다. 일반적인 경향이 관찰되었다 정착액의 낮은 농도 이상의 단백질 BSA 고무로부터 절단 하였다. 트립신 따라서 위에 전체 구조를 용해, BSA 및 글루 타르 알데히드로 형성 새로 생성 된 공유 결합을 절단하여 고무 샘플과 상호 작용시각. 1X PBS로 2 배 PBS에 비해 이른 시점에서 더 가용성 단백질이있는 것으로 보인다. 시간이 지나면, 48 시간까지 지속적으로 증가하고 감소가 15 시간에 단백질 용액에서의 증가가있다. 이 트립신 지속적으로 작은 펩타이드와 아미노산을 생성하여, 단백질을 절단하고 때문일 수 있습니다. 또한, 단지 세 개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드를 읽을 수의 분석 한계에 기인 할 수있다. 통계 분석은 BSA 및 글루 타르 알데히드 농도가 상당히 BSA 고무 (p <0.05)의 단백질의 분리에 영향 것으로 나타났다. 글루 타르 알데히드의 증가는 용해 된 단백질의 감소를 유발하면서 BSA 농도의 증가는 상등액의 단백질의 증가를 일으켰다.

이 희생 물질의 분해를 측정하기 위해, 고무 접점에 배치하기 전에 (습식 기준) 칭량트립신와 CT. 효소 분해 용액에 넣고 고무의 건조 중량의 상당 효소 용액을 BSA 고무와 반응하고, 이에 따라, 단백질을 가용화 보충도 1에 도시 된 값을 사용하여 결정 하였다. 처리 후 남은 고무 O / N을 동결 건조하고 칭량 하였다.도 5는 용매 고무의 해리의 영향을 보여준다. BSA 및 글루 타르 알데히드의 동일한 농도에서 배 PBS 용매 고무는 1X PBS에 비해 그 이상의 물질을 유지.

세 고체 금형 조각을 제작 하였다 : 루프 금형 (보충도 4a), 안정성 조각 (부록 그림 4B), 및 Y 금형 (그림 6A, 왼쪽). 스테인리스 Y 금형 조각 (오른쪽 그림 6A) Microlution 기계를 사용하여 만들어졌습니다. 이 몰드는 반응이 30 % BSA 및 3 % glutaralde 주입시켰다배 PBS (왼쪽 그림 6B)에서 하이드. 고무를 4 ℃에서 O / N을 반응시켰다. 고무 콜라겐 (그림 6B, 센터)에 주조 한 후 효소 (오른쪽 그림 6B) 소화했다. 예비 데이터는 pH가 7.8에서 15 시간 동안 30 ° C의 온도에서, BSA 고무가 콜라겐 지지체를 최소한으로 분해 될 수 있음을 제안 하였다. 15 시간 후, 고무 효소가 콜라겐의 기하학적 특성에 영향을 미치지 않고 채널을 남긴다 충분히 이른바 약화된다. 3D 콜라겐 지지체는 특정 기하학적 특징을 가지고 만들었습니다. 그림 6B (오른쪽) BSA 고무의 효소 분해 후 콜라겐 하이드로 겔 내부의 4 mm 직경의 채널을 보여줍니다. 채널은 원래 치수가 유지되도록 캘리퍼스로 측정 하였다. 실제로, 콜라겐 겔에 새로운 채널 4 mm였다. BSA 고무 금형은 우리를 시험 한 300 μm의 작게 치수를 보유 할 수 있습니다안정성 금형을 보내고 (그림 7). 이 비계는 잔여 글루 타르 알데히드 검사를하고 우리는 Mosconas 세척 후 잔류 물을 찾을 수 없습니다.

그림 1
도 1 BSA 고무 등을들 수있다. (A) BSA 고무 반응. 글루 타르 알데히드는 공유 결합을 생성하여 BSA를 가교. (B) 고무 BSA. 다른 BSA의 농도, 글루 타르 알데히드의 농도, 용매의 종류는 24 웰 플레이트에 주조, 4 ° C에서 O / N을 반응시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
BSA 고무 그림 2. 응력 - 변형 곡선. BSA 루의 응력 - 변형 곡선 bbers. (A) 2 × PBS에서 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드; (B) 1X PBS 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드; (C) 배 PBS 중 20 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드; 1X PBS 및 (D)의 20 % BSA 2 % 글루 타르 알데하이드 (3 회). 곡선 일부 히스테리시스를 가지고 있지만, 원래의 모양으로 돌아 AC 쇼 고무. 샘플 D 쉽게 로딩 및 언 로딩 프로세스 동안 영구 변형이 매우 낮은 탄성률의 고무를 나타낸다. 그래프 E (각 시료의 한주기를 나타내는)의 하나의 로딩 및 언 로딩 사이클에서와 같이 샘플 A와 B는 매우 유사한 거동을 나타내었다. 신축성 정착액의 농도 및 사용되는 용매 (F)에 의해 영향을 받았다. 샘플은 염이 증가 (** p <0.05) 모듈러스의 상당한 증가를 표시. 높은 정착 농도 BSA 고무의 탄성이 크게 증가 (* p <0.05)을 발생.arget = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
BSA 고무도 3의 분해 반응 속도. 고착성이 증가함에 따라, 반응 속도는 1X PBS (A), 2 × PBS (B) 및 물 (C)의 모든 샘플에 대해 감소한다. 배 PBS에서 40 % BSA 2 % 글루 타르 알데히드 반응의 가장 높은 비율 중 하나를 보여줍니다. 이는 BSA 단백질을 균질하게에서 직면하는 어려움에 기인한다. (파란색 : 20 % BSA, 보라색 : 30 % BSA, 그리고 빨간색 : 40 % BSA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 단백질 quantifi 효소 절단 후에 양이온. 고착성이 증가함에 따라, 고무에서 용해 단백질 1X PBS (A), 2 × PBS (B) 및 물 (C)의 모든 샘플에 대해 감소한다. (파란색 : 20 % BSA, 보라색 : 30 % BSA, 그리고 빨간색 : 40 % BSA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 고무 소화. 우리는 건조 기준 제품의 시작을 비교하고 종료에 의해 ​​소화 고무의 양을 결정했다. 우리는 6 % 글루 타르 알데히드 샘플에 소화 최소한의 획득 및 1X PBS에서 가장 30 %에서 BSA 2 % 글루 타르 알데히드가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ove_content "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 그림 6
그림 6. 분지 프로토 타입. 분기 혈관의 (A) 대표. 왼쪽 그림은 G 코드로 변환하고 오른쪽에 표시되는 Microlution 363-S를 사용하여 제작 된 마스터 캠에서 만든 고체이다. 스테인레스 몰드 피스는 두 3mm 유출 채널 4mm 유입 채널을 나타낸다. (B) 3D 콜라겐 지지체. 위의 금형을 사용하여 만든 BSA 고무는 왼쪽에 표시. 센터 콜라겐 겔에 포함 된 고무를 나타낸다. 고무 효소 분해 후 콜라겐 지지체 내에서 왼쪽 채널이 오른쪽에있는 바와 같다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
도 7 BSA 채널. 300㎛ 인 BSA 채널 안정성 피스 주형으로부터 제거 하였다. 채널 주위 이형제의 얇은 층이있다. 추가 영역이 명확하게 현미경으로 구분되어 쉽게 제거 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

BSA (%) Glutaldehyde (%)
(20) (2)
(20)
(20) 6
(30) (2)
(30)
(30) 6
(40) (2)
(40)
6

. 세 가지 용매를 사용하여 : 1 비율 표 1. BSA 고무 매개 변수 BSA 및 정착는 4로 혼합 하였다.

견본 전도도 (MS / cm) pH를
BSA (%) 용제
(30) 배 PBS 11.43 7.06
(30) 1X PBS 6.35 7.05
(30) DI 2.39 6.76
(20) 배 PBS 13.00 6.92
(20) 1X PBS 8.67 7.09
(20) DI 2.08

표 2 전도도 및 BSA 샘플의 pH. BSA 용액의 전도도 및 pH는 다른 용매의 존재 하에서 측정 하였다. 전도도 증가 배속 및 1X PBS 사이에 도시된다.

(6)
BSA (%) 글루 타르 알데히드 (%) 용제 관찰
(20) (2) 1X PBS 소프트, 쉽게 변형 재료
(20) 1X PBS 소프트하지만, 2 % 글루 타르 알데히드보다 튼튼한
(20) 6 1X PBS 스티프, 조금 취성
(30) (2) 1X PBS 좋은 일관성
(30) 1X PBS 좋은 일관성
(30) 6 1X PBS 다루기 힘든
(40) (2) 1X PBS 젤 /​​ 고무 일관성을 만드는 매우 일관성
(40) 1X PBS 일관성은 샘플에 따라 다양
(40) 6 1 배 PB에스 다루기 힘든
(20) (2) 배 PBS 소프트, 쉽게 변형 재료하지만 1X PBS 샘플보다 더 튼튼한
(20) 배 PBS 하지만 소프트 2 %보다 엄격한
(20) 6 배 PBS 좋은 일관성
(30) (2) 배 PBS 좋은 일관성, 1X PBS보다 더 studry
(30) 배 PBS 좋은 일관성, 1X PBS보다 더 studry
(30) 배 PBS 좋은 혼합 성하지만 britle
(40) (2) 배 PBS 일관성은 샘플에 따라 다양
(40) 배 PBS 일관성은 샘플에 따라 다양
(40) 6 배 PBS 일관성은 샘플 따라 다양하고 취성이었다
(20) (2) 젤 /​​ 고무 물질을 형성하지 않았다
(20) 겔 형성하지만 t보다 엄격한 것그는 일관성 PBS와 2 배 PBS를 1 배
(20) 6 겔을 형성하지만, 1X PBS와 2 배 PBS보다 더 엄격한, 일치하지 않는 것
(30) (2) 젤 /​​ 고무 물질을 형성하지 않았다
(30) 겔을 형성하지만, 1X PBS와 2 배 PBS보다 더 엄격한, 일치하지 않는 것
(30) 6 겔을 형성하지만, 1X PBS와 2 배 PBS보다 더 엄격한, 일치하지 않는 것
(40) (2) 젤 /​​ 고무 materi를 형성하지 않았다알
(40) 일관성은 샘플에 따라 달라질 - 상단에 엄격한
(40) 6 일관성은 샘플에 따라 달라질 - 상단에 엄격한

BSA 고무 O과 반응 후 BSA 표 3. 고무. / N, 시료 8 mm 생검 펀치 구멍 하였다. 이 표는 일관성과 샘플의 모양의 시각적 관찰을 포함합니다.

보충 그림 1
부록 그림 1. 고체 비율입니다. 각각의 고무에서 고체의 비율 (건조 중량 / 습 중량)을 측정 하였다. 용매 percenta에 영향을 미치지 않았다고체의 GE (p> 0.05). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2
부록 그림은 PBS 2 배 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드 2. 사인파. 샘플의 압축 하중과 변위는 경과 시간의 함수로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3
보충 PBS 배도 30 % BSA 3 % 글루 타르 알데히드 3. 사인파. 스트레스와 샘플 스트레인 계산 경과 된 시간의 함수로서 플롯 팅 하였다. 작은 위상 시프트가 INDI고무의 점탄성 행동 cative. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4
부록 그림 4. 마스터 캠 고체. (A) 루프와 (B)의 안정성 조각. 이러한 사용하여 마스터 캠을 설계 한 후, G 코드는 수입하고 Microlution 기계 또는 메이커 봇 3D 복제기를 사용하여 PLA 조각을 사용하여 스테인리스 스틸 또는 황동 조각. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

제한 최소 최대
-17
변위 (mm) -1.5 0.3
웨이브 1 단계 레벨 2 주파수 (Hz) 주기
사인 -15 -삼 1 5,000
데이터 취득
스캔 타임 1.008
검사 점 360
검사의 수 </ TD> (5)
이후 검사 스캔 사이에 1.008 초

부록 표 1. 압축 테스트 매개 변수를 설정합니다. 사인파를 사용하여는, 부하 및 변위의 관계는 고무의 네 가지 유형에 대해 측정 하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

ANOVA 결과
DF SS MS 에프 의미 F
회귀 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
잔여 (20) 1.40E + 01 6.99E-01
합계 (23) 9.99E + 02
회귀 분석
계수 표준 오차 t 통계 P-값
차단 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
글루 타르 알데히드 (%) 3.17E-01 </ TD> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
용제 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

부록 표 BSA 고무 고형분의 비율 2. 통계 분석. BSA 및 글루 타르 알데히드 크게 고형분의 비율에 영향을 미쳤다. 용매는 고체의 비율에 영향을주지 않았다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

ANOVA 결과
DF SS MS 에프 의미 F
회귀 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
잔여 (7) 6.07E + 04 8.67E + 03
합계 (10) 3.67E + 05
회귀 분석
계수 표준 오차 t 통계 P-값
차단 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23E-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
용제 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
글루 타르 알데히드 (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

부록의 표는 PBS 농도 관련된 탄성률 3. 통계적 분석. PBS 농도는 크게 탄성 계수에 영향을 미쳤다. 용매에 염의 증가는 탄성 계수의 증가가 발생했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

ANOVA 결과
DF SS MS 에프 의미 F
회귀 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
잔여 (60) 3.34E-14 5.57E-16
합계 (63) 3.96E-14
회귀 분석
계수 표준 오차 t 통계 P-값
차단 3.74E-08 1.37E-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
글루 타르 알데히드 (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
용제 -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

부록 표 효소 소화 15 시간이. 글루 타르 알데히드 농도가 상당히 높은 글루 타르 알데히드의 농도 감소에 의해 고무의 소화의 반응 속도에 영향을 후 반응 속도 4. 통계 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

P-값
ANOVA 결과
DF SS MS 에프 의미 F
회귀 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
잔여 (62) 4.20E-15 6.78E-17
합계 (65) 1.16E-14
회귀 분석
계수 표준 오차 t 통계
차단 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
글루 타르 알데히드 (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
용제 -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

부록 표 효소 소화에 24 시간 후에 반응 속도 5. 통계적 분석. BSA 및 글루 타르 알데히드 농도는 상당히 고무 소화 반응 속도에 영향을 미쳤다. 글루 타르 알데히드의 더 높은 농도에서, t의 감소가그는 반응 속도. 높은 BSA 농도에서 반응 속도의 증가가 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

ANOVA 결과
DF SS MS 에프 의미 F
회귀 3.10E-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64E-11
잔여 (64) 2.42E-15 3.78E-17
합계 67 5.52E-15
회귀 분석
계수 표준 오차 t 통계 P-값
차단 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13E-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
글루 타르 알데히드 (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
용제 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

부록 표효소 분해의 48 시간 후, 반응 속도. BSA 및 글루 타르 알데히드 농도 6 통계 학적 분석은 상당히 고무 소화 반응 속도에 영향을 미쳤다. 높은 글루 타르 알데히드 농도에서 반응 속도의 감소가 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

ANOVA 결과
DF SS MS 에프 의미 F
회귀 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
잔여 (61) 1.46E-15 2.39E-17
합계 (64) 3.64E-15
회귀 분석
계수 표준 오차 t 통계 P-값
차단 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
글루 타르 알데히드 (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
그래서lvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

부록 표 효소 소화 72 시간 후에 반응 속도 7. 통계 분석. BSA 및 글루 타르 알데히드 농도는 상당히 고무 소화 반응 속도에 영향을 미쳤다. 글루 타르 알데히드의 더 높은 농도에서, 반응 속도의 저하가있다. 높은 BSA 농도에서 반응 속도의 증가가 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Biofabrication 생물학 및 공학 원리가 기​​본 조직을 모방 복잡한 물질을 생성하기 위해 병합하는 고도의 전문 분야 필드입니다. 이를 달성하기 위해서, 생체 조직으로부터 수집 한 정보를 사용하여 시험 관내 지지체로 번역 기술을 개발할 필요가있다. 이러한 방식으로, 플랫폼이 밀접 생체 조직, 구조적 기능적, 기계적 특성과 유사한 것으로 설계 될 수있다. 최적 발판 재료, 예컨대 생체 적합성 인 특정 성질을 가지고 관심 조직의 기계적 특성을 모방 제어 분해 능력 세포 생존을 지원할 수 및 2,3- 리모델링 조직을 허용 할 수 있어야한다.

제조 기술의 수많은 가능한 입체 구조를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 기술은 두 가지 범주로 구분 : 기존의를d를 고급. 종래 기술은 다공성 구조를 만드는 합성 및 천연 전통적인 재료의 사용을 포함한다. 일부 예는, 용매 캐스팅 동결 건조, 성형 용융물. 이러한 기술의 단점은 비계의 내부 채널을 가난한 구조 내에서 다공성의 제어 (기공 크기 및 기공 상호) 어려움을 포함한다. 고급 기법 중 다른 하나 조형 성형, 3D 인쇄 및 전기 방사를 포함한다. 이러한 기술들은 장거리 마이크로 아키텍처 채널의 부족 소경 노즐 재질에 따라 최적화를 통해 송출 할 수있는 동시에, 독성이있을 광범위한 후 처리를 필요로 최적의 기계적 강도를 제공하기 위해 재료 선택과 같은 단점이 있고 체외 구조에서 내부 구조의 설계에 제한. 3D 인쇄의 주요 단점은 충분한 세포 담체는 생체 물질의 가용성이며또한 구조적 정의 조직 (12)을 유지하기 위해 필요한 기계 특성을 가지면서. 여기에 제시된 기술은 모두 기존의 고급 제조 기술이 통합되어 있습니다. 두 세계의 최고는 컴퓨터를 이용한 만드는 제조 또는 수입, 효소 불안정한 고무의 개발로 원하는 구조의 융합에서 파생됩니다. 스테인레스 스틸 주형 밀링 머신을 이용하여 생성 되었으나, 그 제조 방법이 한정되는 것은 아니다. 3 차원 프린터 (예를 들면, 메이커 봇)을 사용하여 동일한 금형은 폴리 락트산 (PLA)로부터 제조 하였다. 음 금형은 어떤 물질에 기능을 쉽고 안정적​​인 전송을 만들 고체 금형을 제공하는 CAD 프로그램에 의해 설계 건축 지침을 사용하여 분쇄 하였다. 그것뿐만 아니라, 외부 조직 조성물의 제어를 가능하게한다는 점에서이 기술은 또한 매우 복잡한 내부 구조의 중요하다. 이 작품은 여기에 제시주로 균일 쉽게 적절한 시간에 분해되어 혼합 될 수 BSA 고무의 특성에 초점을 맞춘 구조의 변화에​​ 내성이며, 주조 공정 중에 안정성을 유지하면서, 예약 기능을 모방 할 수있다 . 이 기술의 한계를 테스트하고, 희생 물질의 해상도는 300 μm의 지름만큼 작은 크기를 유지할 수있다. 그러나,도 7은 채널 이형제의 얇은 층에 의해 둘러싸인 것으로 나타났다. 현미경을 사용하여,이 추가 영역을 명확하게 구별하고 원하는 치수로 제거 할 수있다. 이 biofabrication 기법 거시에서 마이크로 - 스케일 범위 내부 구조의 다양한 복제를 허용한다.

알부민은 순환계에서 가장 풍부한 단백질이다. 단백질은 고분자 전해질이기 때문에, 용해성이 정전 기적 ​​상호 작용에 의해 결정 하였다 15-17. 그것은 낮은 염분 농도 것을 보여왔다, 소금에 절인-에서의 용해도 (18)을 촉진 단백질에 효과가있다. 글루 타르 알데히드는 알부민의 특성 변화를 일으키는 가교제이다. 도 1에서 보이는 색상 변화 알디 19-21 결합의 형성에 기인한다. 글루 타르 알데히드는 분자간의 공유 결합을 형성하는 14 리신 아미노기 통해 BSA와 주로 반응한다. 데이터는 소금의 증가 (PBS 2 배 1X PBS에서) 고무의 탄성을 향상을 나타냅니다. 높은 글루 타르 알데히드 농도는 저농도들에 비해 초기 설정 엄격한 젤을 생산하고 있습니다. 그러나 이들은 균일하게 혼합하여 조제하는 것이 더 어렵고, 그들이 취성 겔을 형성한다. 높은 온도는 글루 타르 알데히드와 BSA의 반응을 촉진하기 때문에 금형으로 BSA 고무의 적절한 양을 전달하기 위해, 조립의 모든 부분이 감기 유지되어야한다.적합한 고무 (30 % BSA 배 또는 PBS 1X PBS에서 3 % 글루 타르 알데히드)을 영구적으로 변형하지 않고 부하를 견딜 수있는 점탄성 재료로서 행동한다. 운반 및 BSA 고무 구조 주위 주조 재료 때 매우 중요해진다.

트립신은 단백질을 가수 분해하는 세린 프로테아제이다. 트립신 절단 높은 특이성을 갖는 널리 사용되는 효소이다. 이 아미노산 리신의 카복실 측 주로 펩티드 사슬을 절단 22 아르기닌. BSA는 물에서 낮은 농도에서 쉽게 용해하고, 트립신 용이 그대로 비교적 본래 콜라겐을 떠나 BSA 고무 분해. 이 물질은 세포와 접촉 할 수 없습니다. 구조 무료 글루 타르 알데히드의 존재를 테스트하고,이 정착액의 흔적은 없었다. 이것은 biofabrication위한 희생 재료로서 고무 BSA의 효과를 보여준다. 이 프로토콜에서, 콜라겐은 OT 골격 물질로서 사용 되었으나트립신 분해에 내성이 그녀의 재료가 사용될 수있다.

향후 연구는 내피와 섬유 아세포 세포 골격 시드에 의해 하이드로 겔 내에서 혈관 구성 요소를 재구성에 초점을 맞춘 것입니다. 과제 중 하나는 기본 차원 분포를 모방 채널 내부에 걸쳐 세포의 균일 한 분포를 생성하는 것이다. 이 문제를 해결하기 위해 전략 밀봉 또는 채널의 플러깅 및 세포 현탁액의 주입을 허용하는 개발되고있다. 시험 물질은 39 ° C에서 열 가역 겔, 액체 및 30 ° C 23,24 상기 고체 플루로 닉 F127이다. 플루의 고농도 필요한 시간 시일을 만드는데 성공 하였다. 세포 현탁액은 지지체의 채널 내에 후 세포 차원 구조의 모든 측면에 부착 할 때까지 개체는 특정 시간에 대해 회전된다. 내부 채널을 유지하기위한 적절한 미디어를해야합니다세포 생존. 플루로 닉은 겔 형태를 유지하고, 수성 환경에서 용이하게 용해된다. 세포가 부착하면, 하이드로 겔은 미디어 범람 될 것이며, 연구의 목적에 따라 고정 또는 유동 조건에서 배양 할 수있다. 이 방법론은 추가로 부과됩니다 및이 게시에 후속이 될 것입니다. 본원에 기재된 biofabrication 기술은 현재 인간 신장 동맥의 골격 복제본을 개발 사용되고있다. 같은 접근은 임상 광범위한 응용이 기술의 적용을 확대하는 등의 심장 조직과 같은 다른 형태로 수행 될 수있다.

여기에 개발 biofabrication 기술은 빠르고 안정적으로 고유의 기하학적 특징을 요점을 되풀이 할 수 있습니다 체외 인공 지지체의 생성에 앞으로 단계입니다. 천연 물질은 콜라겐, 그것은 최적의 화학적 합성 물질을 통해 세포에 물리적 인 신호를 제공하기 때문에 선택되었다. 이 없음문화적 물질뿐만 아니라, 손상된 조직의 교체를 위해, 개발, 기형 및 질환 조직의 시험 관내 모델로서, 연구 치료에 사용될 수있다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

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References

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세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다
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Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

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