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Bioengineering

Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles

doi: 10.3791/53578 Published: February 12, 2016

Abstract

andamiaje de tejido juegan un papel crucial en el proceso de regeneración de los tejidos. El andamio ideal debe cumplir varios requisitos, tales como que tiene la composición adecuada, el módulo de objetivo, y las características arquitectónicas bien definidas. Biomateriales que recapitular la arquitectura intrínseca de tejido in vivo son de vital importancia para el estudio de enfermedades, así como para facilitar la regeneración de tejido blando y perdido con formato incorrecto. Una nueva técnica fue desarrollada Biofabrication que combina la proyección de imagen del arte, la impresión en tres dimensiones (3D), y la actividad enzimática selectiva para crear una nueva generación de biomateriales para la investigación y aplicación clínica. El material desarrollado, albúmina de suero bovino de caucho, es la reacción se inyecta en un molde que mantiene características geométricas específicas. Este material de sacrificio permite la transferencia adecuada de las características arquitectónicas de un material de soporte natural. El prototipo consiste en una estructura de colágeno 3D con 4 y 3 mm canales que represent una arquitectura ramificada. En este trabajo se hace hincapié en el uso de esta técnica Biofabrication para la generación de construcciones naturales. Este protocolo utiliza un software asistido por ordenador (CAD) para la fabricación de un molde sólido que va a ser la reacción inyectado con goma BSA seguido de la digestión enzimática de la goma, dejando sus características arquitectónicas dentro del material de soporte.

Introduction

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En el campo de la ingeniería de tejidos la capacidad de fabricar andamios de tejido es vital. Un andamio de tejido adecuado tiene una estructura 3D, se compone de materiales biocompatibles, e imita la arquitectura del tejido vivo en para facilitar el crecimiento de células y tejidos y remodelación. Este andamio debe permitir el transporte de nutrientes y la eliminación de desechos 1-4. Uno de los principales obstáculos en la producción de estos andamios es la capacidad de recapitular características geométricas específicas en un material biocompatible. Varias técnicas Biofabrication han sido reportados para el control de las características geométricas de estos andamios, ejemplos se electrospinning 5-8, disolvente a presión 9, 10 estereolitografía, y 3D-impresión 11, entre otros. Estas técnicas están a la altura para proporcionar una transferencia relativamente fácil de elementos arquitectónicos internos y externos controlables, son caros, están limitados por su resolución y capacidad de impresión ( 12.

En muchos sistemas de fabricación comercial, la creación de vacíos internos, canales y funciones se consigue utilizando arena u otros materiales extraíbles o de sacrificio adecuados. La parte de metal o de plástico se forma alrededor del molde de arena, y una vez que se solidifica, se retira la arena. De la misma manera, la nueva generación de biomateriales necesita la bioarena equivalente. Por lo tanto, el caucho de BSA fue desarrollado como un sustituto de bioarena. El caucho de BSA es un material de nueva formulación que consiste en albúmina de suero bovino reticulado con glutaraldehído. El objetivo final es volver a crear las características arquitectónicas específicas en una estructura de colágeno biodegradable. Se describen las características de la biorubber sacrificial que mantiene la fidelidad dimensional con el molde de tejido original.

in vivo y otras características del tejido de interés.

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Protocol

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1. Determinar el porcentaje de sólidos en el lote de colágeno

  1. Extraer el colágeno siguiendo un procedimiento previamente publicado 13. Descongelar un mínimo de 20 ml de colágeno. Determinar el porcentaje inicial de sólidos de colágeno en el lote con el fin de manipular la concentración de colágeno en los hidrogeles formados.
    1. Cortar tres piezas de papel de aluminio (alrededor de 6 x 6 cm) y la forma de cada uno de ellos como un pan mediante el uso de la parte inferior de un vaso de precipitados de 25 ml. Anotar el peso de cada bandeja.
    2. Añadir una pequeña cantidad de colágeno para cada pan y registrar el peso total de la bandeja de aluminio y colágeno. Añada 0,5 - 0,8 g de colágeno en cada recipiente de aluminio.
      Nota: Después de este paso, hay tres moldes de papel de aluminio y cada uno debe tener una pequeña cantidad de colágeno. Asegúrese de registrar el peso de cada uno (en total 3) bandeja de aluminio vacía y el peso de la sartén después de la adición de colágeno.
    3. Calcular el peso del colágeno en cada molde con el fespués de fórmula:
      El colágeno de peso = Pan y el peso de colágeno - Pan de peso
    4. Coloque las tres bandejas de aluminio que sujetan el colágeno en el horno a 100 ° C durante 24 horas.
    5. Después de 24 horas, se registra el peso de cada recipiente de aluminio y el colágeno deshidratado.
    6. Calcular el peso del colágeno deshidratado usando la siguiente ecuación:
      peso deshidratado colágeno = Pan y el peso de colágeno deshidratado - Pan de peso
    7. Calcular el porcentaje de sólidos para las tres muestras para determinar la concentración de sólidos de colágeno utilizando la siguiente fórmula:
      Ecuación 2
    8. Calcular el contenido de sólidos de colágeno media del lote usando el porcentaje de sólidos de colágeno para cada una de las tres muestras.
      Nota: El colágeno que se utilizará es lo que queda del colágeno hidratado. será necesario utilizar ninguno de colágeno deshidratado.
    9. Después de determinar el porcentaje de colágeno sólido (iconcentración de colágeno nitial) del lote, continuar usando el colágeno hidratado restante. Utilice un medidor de pH calibrado para ajustar el pH del lote de colágeno a 3.
      1. Añadir pequeñas cantidades (2-5 l a la vez) de 12 N de ácido clorhídrico (HCl). Mantener en hielo en todo momento. No añadir el ácido clorhídrico directamente al colágeno - añadir el ácido al lado del tubo. Después de añadir el ácido, utilizar la espátula para empujar el ácido al colágeno y rápidamente se agita la mezcla.
    10. Una vez que se alcanza un pH de 3, dejar que el colágeno se sientan O / N a 4 ° C.

2. Preparación de la BSA de goma

  1. Preparar la solución de albúmina de suero bovino (BSA) siguiendo el procedimiento que aparece a continuación.
    1. Preparar la solución de 2x tampón fosfato salino (PBS). Añadir dos comprimidos de PBS a 100 ml de agua para hacer una solución 0,02 M PBS.
    2. Combinar BSA con PBS 2x para crear una solución de BSA 30% usando el procedimiento enumerado a continuación.
      1. Por ejemplo, para hacer una BSA 30% con 30 ml de 2x PBS, utilizar 12,9 g de BSA. Añadir 1/3 de la 2x PBS (por ejemplo, 10 ml) a un matraz con una barra de agitación. Añadir 1/2 de la BSA (por ejemplo, 6,45 g BSA) al matraz y el uso de una espátula, mojar el soluto seco.
      2. Repita este proceso de adición de PBS y luego BSA hasta que todo el soluto y el disolvente es en el matraz. Utilice la espátula para mojar todo el soluto. Se parece a una mezcla de un poco de líquido y macizos. Dejar reposar durante aproximadamente 30 minutos.
      3. A continuación, gire el agitador en un ciclo de baja y asegurarse de que no hay grumos de todo el barra de agitación. Se debe tomar 90 minutos para conseguir todo en solución o se puede dejar de agitar O / N a 4 ° C. Después de que el soluto se disuelve todo, colocar la solución en una jeringa de 20 ml y se tapó con un filtro de jeringa de 0,20 micras. Presione el émbolo para expulsar el líquido a través del filtro y recoger la solución esterilizada en un tubo nuevo. Almacenar a 4 ° C.
    3. Preparar 3% de glutaraldehído solutien diluyendo solución de glutaraldehído al 25% esterilizada por filtración con 2x PBS. Por ejemplo, para 10 ml de solución de glutaraldehído al 3%, utilizar 2 ml de 25% de glutaraldehído y 8 ml de 2x PBS. Almacenar a 4 ° C.

3. Tratamiento Moldes

Nota: El prototipo que se describe en este documento utiliza un acero inoxidable Y pieza de molde hecho a medida. El molde contiene una entrada y dos canales de salida de 4 y 3 mm, respectivamente. En primer lugar, los moldes limpios, rociarlas con manteca de cerdo no saturado, y esterilizarlos. Preparar los moldes siguiendo el procedimiento descrito a continuación.

  1. Limpiar moldes de acero inoxidable utilizando ultrasonidos a una frecuencia de 35 kHz. Colocar los moldes en el baño de ultrasonidos y sumergirlos en agua y hielo. Mantenga los moldes de frío en todo momento, mientras que el aparato de ultrasonidos se está ejecutando. Ejecutar el aparato de ultrasonidos durante 2 períodos de 90 minutos.
    1. Después de cada período, utilizar una aguja para asegurarse de que no hay ningún material en el Luer Lock de acero inoxidable o bRass conector. Use agua y jabón para limpiar toda la superficie de los dos lados de los moldes. Compruebe que no hay ninguna obstrucción en los canales.
  2. Colocar los moldes, tornillos y conector de cierre Luer en una bolsa de autoclave y dejar él.
  3. Llene la botella que se conecta a una mitad de camino pistola de aire con manteca de cerdo disponible en el mercado (agente de liberación de ácidos grasos mixtos). Vuelva a colocar la tapa con una tapa de botella regular. Colocarlo en una bolsa de autoclave y dejar él.
    Nota: Manteca de cerdo se utiliza para facilitar la liberación del material que va a ser inyectado reacción más adelante (BSA caucho). No coloque la tapa de la botella del rociador en el autoclave- que puede dañar la junta interna.
  4. Calentar la manteca durante 45 segundos o hasta que la clara y líquida en un microondas. Tornillo de la tapa de pistola de aire a la botella de manteca de cerdo. Conectar la tapa con el pulverizador. Coloque el pulverizador a la fuente de aire a la mesa del laboratorio. Abrir la válvula de aire, y abrir la boquilla del pulverizador hasta que comienza a mojar la superficiede una toalla de papel.
  5. Pulverizar la manteca de cerdo perpendicular a la superficie del molde hasta que la superficie está totalmente cubierto. Después de cada pieza ha sido pulverizada, colocarlos en una placa de Petri y sellarlo. Colocar los moldes a 4 ° C durante 2 horas.
  6. Proceder para esterilizar los moldes mediante la exposición de la superficie a luz UV durante 30 min. Coloque de nuevo a 4 ° C hasta que estén listos para ser inyectada reacción.

4. Reacción de inyección de la BSA de goma

Nota: Todos los materiales y la solución se deben mantener en frío hasta que esté listo para usar para prevenir endurecimiento prematuro de la goma de BSA en los próximos pasos.

  1. Preparar el dispensador para la entrega de la goma de BSA a los moldes siguientes estos pasos.
    1. Esterilizar todos los componentes de mezcla (dos anillos O, tapa de la jeringa, doble jeringa, la punta de mezcla, y 4: 1 dosificador) al exponerlos a la luz UV durante 30 minutos en la campana de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
      Nota: Una campana de PCR se utilizó porque tsu procedimiento implica fijadores. Estos productos químicos no se pueden utilizar en la campana de cultivo de células / tejidos debido al riesgo de la exposición y la toxicidad a las células. Cualquier otra campana que contiene una luz ultravioleta será adecuado.
    2. Coloque la tapa de punta en el soporte de la solución.
    3. Realizar la mezcla y la inyección a una proporción de 4: 1 de BSA: glutaraldehído. Añadir el 30% de BSA a la cámara de doble jeringa que va a ofrecer la más alta cantidad de solución (Tardará aproximadamente 4 ml para rellenar). Asegúrese de dejar suficiente espacio para colocar la junta tórica con el fin de evitar la contaminación y desbordante de la cámara adyacente.
    4. Añadir solución de glutaraldehído al 3% a la otra cámara (que tomará alrededor de 1 ml para rellenar). Asegúrese de dejar suficiente espacio para colocar la junta tórica para evitar la contaminación y el desborde de la cámara adyacente.
    5. Coloque la jeringa doble en el dispensador. Incline el conjunto verticalmente, de modo que la tapa de la jeringa es en la parte superior. Vuelva a colocar la tapa con la punta de mezcla.
    6. Carolina del SurRew las dos piezas de molde de acero inoxidable juntos.
    7. Coloque el conjunto en el interior de una bolsa de autoclave.
    8. Para eliminar el aire en el dispensador, mantenerlo en la posición vertical y rápidamente apretar el mango de una vez para liberar una pequeña cantidad de la BSA mezclado con el glutaraldehído. A continuación, conecte de forma rápida conector de cierre Luer el acero Y del molde de acero a la punta de la jeringa.
    9. Sostenga el molde de acero inoxidable Y con la mano izquierda y el dispensador mezcla de BSA-glutaraldehído a la derecha. cubriendo alternativo cada uno de escape izquierda y derecha de los canales colectores presionando el tubo de escape a los lados de la bolsa de autoclave para asegurarse de que los huecos en el interior se llenan con la solución. A continuación, colocar los moldes de forma horizontal e inyectar de nuevo.
    10. Separar los moldes de dispensador y colocar en una placa de Petri de 25 mm.
    11. Coloque Parafilm alrededor de la placa de Petri para prevenir la deshidratación de la goma.
    12. Colocar el molde en la nevera 4 ° C O / N.

Nota: El colágeno debe mantenerse en hielo en todo momento durante el proceso.

  1. Modificar la concentración de colágeno utilizando el porcentaje de sólidos de colágeno.
    1. Hacer 10 ml de colágeno 1,75% mediante el ajuste de la concentración inicial de colágeno con agua fría.
    2. El uso de un medidor de pH calibrado, ajustar el pH a 3 utilizando 12 N ácido clorhídrico. No añadir el ácido clorhídrico directamente al colágeno añadir el ácido al lado del tubo. Después de añadir el ácido, utilizar la espátula para empujar el ácido en el colágeno y rápidamente se agita la mezcla.
    3. Pesar 4 g de colágeno en un tubo cónico separado.
    4. Centrifugar el colágeno para eliminar el aire a 4 ° C y 9.343 xg durante 20 a 30 min.
    5. UV esterilizar la campana de cultivo de células durante 30 minutos, y añadir 14 l de laminina al colágeno 4 ml. Esto dará lugar a una concentración de laminina final de 10 g / l. Nota: La laminina ofrece sintegridad STRUCTURALES, adhesión, y promueve diversas respuestas celulares.
    6. Girar la PCR luz ultravioleta durante 20-30 minutos antes de usar la campana para la esterilización.
    7. Coloque la tapa de cierre Luer, para adjuntar a una jeringa de 20 ml, en etanol durante una hr 2. Luego, deje que se seque y lo coloca a la luz UV.
    8. Gamma irradiar el colágeno de 8,6 minutos para llegar a 1.200 cGy.
      Nota: El tiempo dependerá de la decadencia de la fuente de cesio. Ajustar el tiempo para llegar a la misma dosis.

6.Casting colágeno en BSA goma

  1. Para polimerizar el colágeno, usar un 8: 1 ratio: 1 (colágeno: HEPES: MEM). El siguiente procedimiento se basa en un 4 g inicial de colágeno acidificado (de la etapa 5.1.8).
    1. Hacer una solución 0,2 N HEPES en agua, y ajustar el pH a 9 mediante la adición de pequeñas cantidades (1 a 5 l) de solución de hidróxido de sodio 1 a 5 M (NaOH). El uso de un medidor de pH calibrado, controlar el pH de la solución después de cada adición. Almacenar a 4 ° C o keep sobre hielo.
    2. Encienda la luz UV de la campana de cultivo de tejidos durante 20-30 minutos para esterilizar el capó.
    3. fórceps autoclave, espátula, y el bisturí para la esterilización.
    4. Mezclar 1,5 ml de 0,2 N HEPES (pH 9) y 1,5 ml de 10x MEM utilizando el campana de cultivo de tejido. Asegúrese de mantener en hielo y agitar durante 5 segundos antes de su uso. Almacenar a 4 ° C o mantener en hielo.
    5. Para esterilizar el capó PCR, encender la luz UV durante 30 minutos.
    6. Colocar una placa de 12 y una jeringa de 20 ml en -20 ° C durante 10 min, o hasta que esté listo para continuar. Nota: Mantenga todos los materiales en frío hasta que esté listo para su uso. El aumento de la temperatura induce fibrilogénesis prematura de colágeno.
    7. Rociar todos los tubos y placas, así que van a estar en la campana con un 70% de etanol y dejar secar durante la esterilización. Coloque una jeringa de 20 ml en hielo para enfriar para su uso posterior.
    8. En la campana de PCR, abrir los moldes de acero inoxidable para liberar el caucho de BSA y el uso de un bisturí, cortar los canales de escape de la BSA rubber molde.
    9. Bajo el capó PCR, abrir los tubos de colágeno estériles y añadir 1 ml de la solución de HEPES-MEM (asegúrese de que antes de extraer la solución de HEPES-MEM, que se mezcla bien y no hay depósitos sólidos).
    10. Usando la espátula estéril, mezclar a fondo la solución de colágeno y tampón.
    11. Cerrar y agitar rápidamente para asegurar un hidrogel bien mezclada.
    12. Transferencia a una jeringa de 20 ml fría.
    13. Con una mano, sostenga el BSA de goma en el interior del pozo y, con la otra, dispensar medio de la solución de hidrogel de colágeno en la parte inferior del pozo.
    14. Usando las pinzas estériles, asegúrese de que los extremos de flujo de entrada y de salida de goma estén en contacto con las paredes del pozo.
    15. Verter solución de colágeno en la parte superior de la goma hasta que está completamente cubierto.
    16. Asegúrese de que el caucho de BSA está suspendido dentro del colágeno y de que no hay burbujas, especialmente cerca de los extremos de la goma.
    17. Coloque la tapa y se envuelve alrededor de la Parafilmcircunferencia del pozo.
    18. Poner en la incubadora durante 1 hora a 37 ° C. Mantenga la luz UV en la PCR.
  2. Después de la polimerización del colágeno, UV reticular el hidrogel a través de la siguiente procedimiento.
    Nota: La reticulación del colágeno se realiza utilizando un aparato de agente de reticulación UV en la que la cantidad de energía puede ser controlada.
    1. Encienda el agente de reticulación UV y utilizar la configuración de energía para irradiar la cámara de vacío con 630.000 mu J / cm2.
    2. Retire los geles de la incubadora.
    3. Pulverizar las manos con etanol, y, dentro de la cámara, retire la tapa lo más rápido posible.
    4. Cierre la cámara de UV y reticular los hidrogeles mediante la selección de la configuración de energía y la irradiación de 630.000 mu J / cm2.
    5. Después del ciclo de reticulación, apagar la luz UV en el capó de PCR
    6. Pulverizar las manos con etanol y abrir la cámara, colocar rápidamente la tapa de nuevo en la placa también. Mover la placa dea la campana PCR.
    7. El uso de la espátula estéril, suavemente aflojar y remover el gel del pozo. Voltear los geles bajo el capó para reticular la parte inferior del hidrogel. Repita el paso 6.2.3 y 6.2.4.

7. Digestión enzimática de la goma de BSA

  1. Con el fin de tener una estructura de colágeno hueco, eliminar BSA de goma de una manera que no afecta a las dimensiones embebidos en el hidrogel. El procedimiento se describe a continuación.
    1. Encienda la luz UV durante 20-30 minutos para esterilizar la campana de cultivo de tejidos.
    2. Hacer 0,25% de solución de tripsina pH 7,8. Por ejemplo, para 15 ml de agua, añadir 0,0376 g de tripsina en un tubo cónico de 50 ml. Ajustar el pH a 7,8 mediante la adición de pequeñas cantidades (2-5 l) de 1 M de NaCl. Colocar la solución en una jeringa de 20 ml y se tapó con un filtro de jeringa de 0,20 micras. Presione el émbolo para expulsar el líquido a través del filtro y recoger la solución estéril en un tubo nuevo.
    3. Encienda el baño de agua y ajustar la temperatura a 30DO.
    4. Después de 30 minutos, apagar la luz UV. Pulverizar etanol en todos los tubos y materiales que se utilizarán en la campana.
    5. Transferir el hidrogel de colágeno bajo el capó y el lugar en el tubo cónico separada.
    6. Añadir alrededor de 3-5 ml (suficiente para cubrir los geles) de solución de tripsina al 0,25% con un pH de 7,8 a cada tubo.
    7. Sellar los tubos con Parafilm y agitar suavemente durante aproximadamente 1 min.
    8. Lugar en el baño de agua a 30 ° C durante 15-24 horas. Mientras que en el baño de agua, ligeramente vórtice los geles con frecuencia hasta que la goma de BSA se ha digerido o retirar material de hidrogel.
      Nota: Con el fin de determinar si el caucho BSA se ha eliminado, ya sea el caucho está flotando en la solución de tripsina o hay piezas averiados. No debe haber zonas oscuras visuales dentro del hidrogel.
  2. Para asegurarse de que todo el caucho de BSA y la tripsina se ha eliminado de los hidrogeles, enjuagarlo como se describe a continuación.
    1. Encienda el hoo PCRd luz UV durante 20-30 min.
    2. Preparar la solución Mosconas. Combinar cloruro de potasio (KCl, 28.6 mM), (NaHCO3, 11,9 mM), glucosa (9,4 mM) y (NaH 2 PO 4, 0,08 mM) en agua. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1 M o solución 12 M HCl. Colocar la solución en una jeringa de 20 ml y el uso de un filtro de jeringa de 0,20 micras para esterilizar la solución.
    3. Rociar todo con etanol antes de colocarlos en el capó y permitir que el etanol se seque.
    4. Abrir el tubo y la transferencia de 5-10 ml de solución estéril Mosconas a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    5. Transferir el hidrogel de colágeno al tubo cónico que contiene la solución de enzima. Asegúrese de que el hidrogel está completamente cubierto con la solución. Deje el tubo en la coctelera en la nevera a 4 ° C durante 30 minutos.
    6. Aspirar la solución Mosconas y repita el paso 7.2.5 dos veces.
    7. Almacenar a 4 ° C.

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Representative Results

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Los resultados demuestran que esta técnica Biofabrication es eficiente en la generación de andamios 3D que pueden imitar la disposición espacial visto en el tejido in vivo. Las características arquitectónicas son parámetros vitales para la aplicación de la ingeniería de tejidos, que juegan un papel crucial en la interacción de las células in vivo y la funcionalidad de los tejidos.

La consistencia y la capacidad de mezcla del caucho de BSA fue un parámetro importante en la producción de un caucho de BSA que es homogénea y es capaz de mantener su forma prevista. La solubilidad de las proteínas se determina por efectos intermoleculares, tales como la interacción proteína-proteína, y la interacción con el disolvente, lo que induce cambios en el comportamiento global de la proteína. Se midió la conductividad de la solución de BSA, que es una indicación de la concentración de sal de las soluciones. Tabla 1 enumera los combinaticomplementos de BSA, a prueba de disolventes, y glutaraldehído. Como era de esperar, las muestras que tenían la más alta conductividad (2x disolvente PBS) facilitó la solubilidad de la BSA.

Otro parámetro utilizado para determinar la condición apropiada para el desarrollo de este material de sacrificio era la velocidad de reacción. El tiempo de reacción de la BSA disminuyó a medida que la concentración de glutaraldehído aumentado, como se esperaba. El fijador reacciona con los grupos a-amino de los aminoácidos, el grupo amino terminal de N de péptidos, y el grupo sulfhidrilo de la cisteína. El glutaraldehído reacciona predominantemente con el BSA a través de los grupos amino de la lisina para formar los enlaces covalentes intermoleculares (Figura 1A) 14. Después de un período de incubación, las muestras mostraron un cambio de color de amarillo pálido a amarillo oscuro y marrón, el aumento en intensidad con el aumento de la concentración de glutaraldehído (Figura 1B). El 20%, 30%, unad 40% de BSA con 2% de glutaraldehído en el agua no se formó una goma. La solución de BSA 40%, debido a su alta viscosidad y el fijador altamente reactivo, resultó en fuerza variable a lo largo del caucho. Este comportamiento puede deberse a la dificultad de la glutaraldehído en penetrar en las cadenas de proteínas de forma homogénea. El disolvente influenciada en gran medida la solubilidad de la proteína, así como su reacción con el fijador. Las soluciones de PBS 2x eran fácilmente mezclable. La solución de BSA con agua era difícil de mezclar. BSA solubilidad se ve afectada en gran medida por la conductividad del disolvente (Tabla 2), provocando cambios conformacionales en la proteína. Las muestras más prometedores eran la BSA 30% con 3% de glutaraldehído en PBS 1x y 2x PBS.

Para asegurarse de que el caucho fue capaz de fuerzas de carga sufridas, se realizó un ensayo de compresión. Se midieron las propiedades mecánicas de cuatro muestras de caucho BSA: 30% de BSA 3% de glutaraldehído en2x PBS, 30% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 1x, 20% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 2x y 20% de BSA 2% de glutaraldehído en PBS 1x. Las ondas sinusoidales mostraron un cambio muy pequeño de fase entre las curvas de carga y desplazamiento (Suplemento Figura 2) que se transfieren a las curvas de tensión y tracción (Suplemento Figura 3). Sobre la base de las curvas de tensión y deformación, las primeras tres muestras presentaron histéresis en el medio de carga y descarga (Figura 2A-2C). Estas tres muestras se comportaron como un material viscoelástico que contiene propiedades elásticas y viscosas cuando se aplican fuerzas. El 20% de BSA glutaraldehído al 2% mostró signos de deformación permanente (Figura 2D). El 30% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 1x y 2x PBS mostró un comportamiento similar (Figura 2E -ona carga y descarga ciclo). El módulo elástico se determinó a partir de la porción lineal de estas cuatro muestras (Figura 2F). La concentración del fosfatodisolvente aumentó significativamente el módulo de elasticidad en el intervalo ensayado (p = 0,03). El 20% de BSA 2% de glutaraldehído en PBS 1x deforma fácilmente, mostrando un menor módulo elástico.

Para evaluar la digestión enzimática de la goma, la velocidad de reacción se calculó basándose en la desaparición de la goma de BSA cuando se pone en contacto con la enzima en el punto de tiempo específico. El proceso de la digestión enzimática fue tratado como un reactor discontinuo. Una comparación entre la concentración de caucho de partida antes del tratamiento y el caucho de la izquierda después de haber sido liofilizado se hizo para obtener la cinética de la digestión. La Figura 3 muestra la velocidad de reacción para cada muestra en relación con la concentración de glutaraldehído y BSA, disolvente y el tiempo de residencia. Se observó una tendencia clara entre las concentraciones de agente de reticulación y la velocidad de reacción de la disociación de la entidad. El análisis estadístico se llevó a cabo en cada punto de tiempo. para THe 15-hr punto de tiempo, la concentración de glutaraldehído afectó significativamente la velocidad de reacción que resulta en un valor de p de 0,02 (Suplemento Tabla 4). Después de ese punto del tiempo, tanto el glutaraldehído y la concentración de BSA afectaron significativamente la tasa (Suplemento Tabla 5-7). El factor más influyente fue en general la concentración de glutaraldehído, indicado por un valor más significativo p. El aumento de la concentración de glutaraldehído disminuye la velocidad de reacción de la digestión de la entidad de goma.

Se determinó la cantidad de proteína disuelta por la tripsina utilizando un ensayo de BCA (Figura 4). Se observó una tendencia común: cuanto menor es la concentración del fijador, la proteína más se digirió a partir de la goma de BSA. Tripsina interactuó con la muestra de caucho mediante la escisión de la BSA y los enlaces covalentes de nueva creación formadas por el glutaraldehído, disolviendo de este modo la estructura global sobrehora. Parece que con el 1x PBS hay más proteína solubilizada en un punto de tiempo anterior en comparación con el 2x PBS. Con el tiempo, se produce un aumento de las proteínas en solución a 15 horas, y que siguió aumentando hasta 48 horas y luego disminuyó. Esto podría ser debido a la tripsina constantemente escindir las proteínas y, así, la creación de péptidos más pequeños y aminoácidos. También se puede atribuir a las limitaciones del ensayo, que sólo puede leer péptidos que están compuestos de tres o más aminoácidos. El análisis estadístico mostró que la concentración de BSA y el glutaraldehído afectó significativamente la liberación de la proteína de la goma de BSA (p <0,05). Un aumento en la concentración de BSA provocó un aumento de la proteína en el sobrenadante, mientras que un aumento en glutaraldehído causó una disminución de la proteína disuelta.

Para medir la disociación de este material de sacrificio, el caucho se pesó (base húmeda) antes de colocarlo en contact con la tripsina. El equivalente de peso seco de la goma colocado en la solución de digestión enzimática se determinó utilizando los valores mostrados en la Figura 1. Suplemento La solución de enzima hace reaccionar con el caucho de BSA, y por lo tanto, se solubilizaron la proteína. El caucho restante después del tratamiento se liofilizó O / N y se pesa. La Figura 5 muestra que el disolvente influyó en la disociación del caucho. A la misma concentración de BSA y el glutaraldehído, los cauchos de disolvente 2x PBS retienen más de su material en comparación con el 1x PBS.

Se fabricaron tres piezas de molde de sólidos: Molde de lazo (Suplemento Figura 4A), pieza de estabilidad (Suplemento Figura 4B), e Y del molde (Figura 6A, izquierda). El acero inoxidable Y pieza de molde se ha creado usando la máquina Microlution (Figura 6A, derecha). Este molde se inyecta reacción con un 30% de BSA y el 3% glutaraldeHyde en 2x PBS (Figura 6B, izquierda). El caucho se dejó reaccionar O / N a 4 ° C. El caucho se vació con colágeno (Figura 6B, centro) y después enzima digiere (Figura 6B, a la derecha). Los datos preliminares sugieren que a pH 7,8 y una temperatura de 30 ° C durante 15 h, la goma de BSA puede ser digerido con un impacto mínimo en el andamio de colágeno. Después de 15 h, la goma se debilita por la enzima y suficiente que deja los canales sin afectar a las características geométricas del colágeno suelto. Un andamio de colágeno 3D fue creado que tiene características geométricas específicas. Figura 6B (derecha) muestra un canal de 4 mm de diámetro dentro de un hidrogel de colágeno después de la digestión enzimática de la goma de BSA. El canal se midió con un calibrador para asegurarse de que la dimensión original se mantuvo. De hecho, el nuevo canal en el hidrogel de colágeno era 4 mm. Los moldes de goma pueden contener BSA dimensiones tan pequeñas como 300 micras, lo que nos puso a pruebaing el molde estabilidad (Figura 7). Estos andamios se ensayaron para glutaraldehído residual y no se encontraron residuos después de los lavados Mosconas.

Figura 1
Figura reacción de goma. (A) de caucho BSA 1. BSA. El glutaraldehído reticula la BSA mediante la creación de enlaces covalentes. (B) de BSA goma. Diferentes concentraciones de BSA, concentraciones de glutaraldehído, y el tipo de disolvente fueron fundidas en placas de 24 pocillos y se hicieron reaccionar O / N a 4 ° C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Curvas de tensión-deformación de cauchos de BSA. Curvas tensión-deformación de BSA ru bbers. (A) 30% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 2x; (B) 30% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 1x; (C) 20% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 2x; y (D) 20% de BSA 2% de glutaraldehído en PBS 1x (3 ciclos). Las curvas AC Mostrar cauchos que tienen algún histeresis, pero vuelven a su forma original. Muestra D muestra una goma con un muy bajo módulo elástico que se deforma fácilmente de forma permanente durante los procesos de carga y descarga. Muestra A y B mostraron un comportamiento muy similar como se ve en un ciclo de carga y descarga en el gráfico E (representante de un ciclo de cada muestra). La elasticidad fue influenciado por la concentración del fijador y el disolvente utilizado (F). Las muestras muestran un aumento significativo en el módulo con un aumento de sales (** p <0,05). Una concentración más alta fijador causó un aumento significativo en la elasticidad de los cauchos de BSA (* p <0,05).arget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La velocidad de reacción de la desintegración del caucho BSA. A medida que aumenta la adherencia de, la velocidad de reacción disminuye para todas las muestras en 1X PBS (A), 2x PBS (B), y agua (C). El 40% de BSA 2% de glutaraldehído en PBS 2x muestra una de las tasas más altas de reacción. Esto es debido a la dificultad encontrada en la fabricación de la proteína BSA homogénea. (azul: 20% de BSA, púrpura: 30% de BSA, y rojo: el 40% de BSA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. La proteína cuantifi catión después de la digestión enzimática. A medida que aumenta la adherencia de, la proteína disuelta a partir de los cauchos disminuye para todas las muestras en 1X PBS (A), 2x PBS (B), y agua (C). (azul: 20% de BSA, púrpura: 30% de BSA, y rojo: el 40% de BSA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 5
Figura 5. digestión de goma. Se determinó la cantidad de caucho digerido mediante la comparación de la partida y productos finales en base seca. Se obtuvo la menor cantidad de la digestión de la muestra glutaraldehído al 6% y más del 30% de BSA 2% de glutaraldehído en PBS 1x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 6
Figura 6. prototipo ramificada. (A) Representación de la vasculatura rama. Se muestra a la izquierda es el sólido creada en Mastercam que se convirtió en código G y fabricado utilizando la Microlution 363-S como se ve a la derecha. La pieza de molde de acero inoxidable representa un canal de entrada de 4 mm con canales de flujo de salida de dos de 3 mm. Andamio de colágeno (B) en 3D. Muestra a la izquierda es la goma de BSA hecho usando el molde se muestra arriba. El centro muestra el caucho incrustado en el hidrogel de colágeno. Muestran a la derecha son los canales izquierdo dentro de la estructura de colágeno después de la goma fue digerido enzimático. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ftp_upload / 53578 / 53578fig7.jpg "/>
Figura 7. BSA canal. Un canal 300 micras BSA se retira del molde pieza estabilidad. Hay una fina capa de agente de liberación de molde alrededor del canal. El área adicional se diferencie claramente bajo un microscopio y se puede quitar fácilmente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

BSA (%) Glutaldehído (%)
20 2
20 3
20 6
30 2
30 3
30 6
40 2
40 3
6

. Tabla 1. Parámetros de goma de BSA BSA y fijador se mezclaron en una proporción de 4: 1 usando tres disolventes diferentes.

Muestra Conductividad (mS / cm) pH
BSA (%) Solvente
30 2x PBS 11.43 7.06
30 1x PBS 6.35 7.05
30 DI 2.39 6.76
20 2x PBS 13.00 6.92
20 1x PBS 8.67 7.09
20 DI 2.08

Tabla 2. conductividad y el pH de las muestras de BSA. Las conductividades y pH de las soluciones de BSA se midió en presencia de diferentes disolventes. Un aumento en la conductividad se muestra entre 2x y 1x PBS.

6
BSA (%) Glutaraldehído (%) Solvente observaciones
20 2 1x PBS material deformable suave, fácil
20 3 1x PBS Soft pero más robusto que el glutaraldehido 2%
20 6 1x PBS Rígido, un poco frágil
30 2 1x PBS buena consistencia
30 3 1x PBS buena consistencia
30 6 1x PBS Frágil
40 2 1x PBS Muy inconsistente en la creación de una consistencia de gel / caucho
40 3 1x PBS La consistencia varía a lo largo de la muestra
40 6 1x PBS Frágil
20 2 2x PBS Suave, material deformable fácil, pero más resistente que la muestra 1x PBS
20 3 2x PBS Soft pero más rígido que el 2%
20 6 2x PBS buena consistencia
30 2 2x PBS Buena consistencia, más studry que con 1x PBS
30 3 2x PBS Buena consistencia, más studry que con 1x PBS
30 2x PBS Buena capacidad de mezcla, pero britle
40 2 2x PBS La consistencia varía a lo largo de la muestra
40 3 2x PBS La consistencia varía a lo largo de la muestra
40 6 2x PBS La consistencia varía a lo largo de la muestra y que era quebradizo
20 2 Agua No se formó un material de gel / caucho
20 3 Agua Se formó un gel pero parecen más rígido que tél PBS 1x y 2x PBS, inconsistente
20 6 Agua Se formó un gel pero parecen más rígido que el PBS 1x y 2x PBS, inconsistente
30 2 Agua No se formó un material de gel / caucho
30 3 Agua Se formó un gel pero parecen más rígido que el PBS 1x y 2x PBS, inconsistente
30 6 Agua Se formó un gel pero parecen más rígido que el PBS 1x y 2x PBS, inconsistente
40 2 Agua No se formó un / materi goma de gelAlabama
40 3 Agua La consistencia varía a lo largo de la muestra - más rígido en la parte superior
40 6 Agua La consistencia varía a lo largo de la muestra - más rígido en la parte superior

Tabla 3. caucho de BSA. Después de la goma de BSA reaccionó S / N, un agujero de punzón de biopsia de 8 mm de la muestra fue tomada. Esta tabla contiene algunas observaciones visuales de la consistencia y el aspecto de las muestras.

Adicional Figura 1
Suplemento Figura 1. porcentaje de sólidos. El porcentaje de sólidos de cada uno de caucho se determinó (/ peso húmedo peso seco). El disolvente no afectó a las Percentage de sólidos (p> 0,05). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Adicional Figura 2
Figura 2. Suplemento de onda sinusoidal de 30% de BSA 3% de glutaraldehído 2x PBS. La carga de compresión y el desplazamiento de la muestra se muestran como funciones del tiempo transcurrido. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Adicional Figura 3
Suplemento Figura 3. onda sinusoidal de 30% de BSA 3% de glutaraldehído 2x PBS. El estrés y la tensión de la muestra se calcularon y se representaron gráficamente como una función del tiempo transcurrido. Hay un desfase pequeño, indicative del comportamiento viscoelástico del caucho. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Adicional Figura 4
Suplemento Figura 4. sólidos Mastercam. Piezas (A) y la estabilidad de bucle (B). Después de diseñar estas usando Mastercam, el código G se importó y una pieza de acero inoxidable o latón utilizar la máquina Microlution o un trozo de PLA mediante el replicador de MakerBot 3D. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

límites min Max
-17 3
Desplazamiento (mm) -15 0,3
Ola Nivel 1 Nivel 2 Frecuencia (Hz) Ciclo
Seno -15 -3 1 5,000
Adquisición de datos
tiempo de exploración 1.008
puntos de escaneado 360
Número de exploraciones </ Td> 5
Con posterioridad Scan 1.008 sec entre escaneo

Suplemento Tabla 1. Parámetros de ensayo de compresión. El uso de una onda sinusoidal, se determinó la relación entre la carga y el desplazamiento de los cuatro tipos de caucho. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

resultados ANOVA
df SS SRA F importancia F
Regresión 3 9.85E + 02 3.28E + 02 4.70E + 02 1.06E-18
Residual 20 1.40E + 01 6.99E-01
Total 23 9.99E + 02
Análisis de regresión
coeficientes Error estándar t Stat P-valor
Interceptar 1.74E + 00 8.23E-01 2.12E + 00 4.70E-02
BSA (%) 7.82E-01 2.09E-02 3.74E + 01 5.49E-20
Glutaraldehído (%) 3.17E-01 </ Td> 1.03E-01 3.09E + 00 5.71E-03
Solvente 2.61E + 01 2.22E + 01 1.18E + 00 2.53E-01

Suplemento Tabla 2. El análisis estadístico del porcentaje de sólidos en el caucho de BSA. La BSA y glutaraldehído afectadas significativamente el porcentaje de sólidos. El disolvente no influyó en el porcentaje de sólidos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

resultados ANOVA
df SS SRA F importancia F
Regresión 3 3.06E + 05 1.02E + 05 1.18E + 01 4.00E-03
Residual 7 6.07E + 04 8.67E + 03
Total 10 3.67E + 05
Análisis de regresión
coeficientes Error estándar t Stat P-valor
Interceptar 6.50E + 02 4.25E + 01 1.53E + 01 1.23e-06
BSA (%) 4.67E + 00 3.80E + 01 1.23E-01 9.06E-01
Solvente 1.02E + 02 3.80E + 01 2.67E + 00 3.20E-02
Glutaraldehído (%) 1.16E + 02 5.70E + 01 2.03E + 00 8.21E-02

Tabla 3. Suplemento El análisis estadístico del módulo elástico en relación con la concentración de PBS. La concentración de PBS afectada significativamente el módulo elástico. El aumento de sales en el disolvente provocó un aumento del módulo elástico. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Resultado ANOVA
df SS SRA F importancia F
Regresión 3 6.15E-15 2.05E-15 3.68E + 00 1.67E-02
Residual 60 3.34E-14 5.57E-16
Total 63 3.96E-14
Análisis de regresión
coeficientes Error estándar t Stat P-valor
Interceptar 3.74E-08 1.37e-08 2.74E + 00 8.03E-03
BSA (%) 3.89E-10 3.62E-10 1.07E + 00 2.88E-01
Glutaraldehído (%) -5.92E-09 1.83E-09 -3.23E + 00 2.02E-03
Solvente -6.78E-08 3.76E-07 -1.80E-01 8.58E-01

Suplemento Tabla 4. Análisis estadístico de la velocidad de reacción después de 15 h de digestión enzimática. La concentración de glutaraldehído afectó significativamente la velocidad de reacción de la digestión de la goma por la disminución en las concentraciones de glutaraldehído superiores. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

P-valor
resultados ANOVA
df SS SRA F importancia F
Regresión 3 7.36E-15 2.45E-15 3.62E + 01 1.21E-13
Residual 62 4.20E-15 6.78E-17
Total sesenta y cinco 1.16E-14
Análisis de regresión
coeficientes Error estándar t Stat
Interceptar 2.98E-08 4.77E-09 6.25E + 00 4.22E-08
BSA (%) 4.56E-10 1.26E-10 3.62E + 00 6.03E-04
Glutaraldehído (%) -6.04E-09 6.15E-10 -9.82E + 00 3.00E-14
Solvente -6.57E-08 1.31E-07 -5.02E-01 6.17E-01

Suplemento Tabla 5. El análisis estadístico de la velocidad de reacción después de 24 h de la digestión enzimática. La concentración de BSA y el glutaraldehído afectó significativamente la velocidad de reacción de la digestión de la goma. A concentraciones de glutaraldehído más altas, hay una disminución en tque la velocidad de reacción. A mayores concentraciones de BSA, se produce un aumento en la velocidad de reacción. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

resultados ANOVA
df SS SRA F importancia F
Regresión 3 3.10E-15 1.03E-15 2.74E + 01 1.64E-11
Residual 64 2.42E-15 3.78E-17
Total 67 5.52E-15
Análisis de regresión
coeficientes Error estándar t Stat P-valor
Interceptar 2.17E-08 3.50E-09 6.20E + 00 4.55E-08
BSA (%) 2.13e-10 9.20E-11 2.31E + 00 2.39E-02
Glutaraldehído (%) -3.94E-09 4.53E-10 -8.70E + 00 1.90E-12
Solvente 3.04E-08 9.57E-08 3.18E-01 7.51E-01

Tabla suplemento6. El análisis estadístico de la velocidad de reacción después de 48 h de la digestión enzimática. La concentración de BSA y el glutaraldehído afectó significativamente la velocidad de reacción de la digestión de la goma. A concentraciones más altas de glutaraldehido, hay una disminución en la velocidad de reacción. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

resultados ANOVA
df SS SRA F importancia F
Regresión 3 2.19E-15 7.29E-16 3.05E + 01 3.56E-12
Residual 61 1.46E-15 2.39E-17
Total 64 3.64E-15
Análisis de regresión
coeficientes Error estándar t Stat P-valor
Interceptar 1.05E-08 2.84E-09 3.69E + 00 4.80E-04
BSA (%) 3.61E-10 7.48E-11 4.83E + 00 9.48E-06
Glutaraldehído (%) -3.07E-09 3.69E-10 -8.33E + 00 1.21E-11
Asi quelvent 3.97E-08 7.80E-08 5.09E-01 6.12E-01

Suplemento Tabla 7. El análisis estadístico de la velocidad de reacción después de 72 h de la digestión enzimática. La concentración de BSA y el glutaraldehído afectó significativamente la velocidad de reacción de la digestión de la goma. A concentraciones de glutaraldehído más altas, hay una disminución en la velocidad de reacción. A mayores concentraciones de BSA, se produce un aumento en la velocidad de reacción. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

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Biofabrication es un campo altamente multidisciplinar en el que los principios de la biología y la ingeniería se fusionan para generar materiales complejos que imitan el tejido nativo. Con el fin de conseguir esto, hay una necesidad de desarrollar técnicas que utilizan la información reunida a partir de tejido in vivo y traducirlo en un andamio in vitro. De esta manera, una plataforma puede diseñarse que se parece mucho a las propiedades arquitectónicas, funcionales y mecánicas del tejido in vivo. El material de andamiaje óptima debe poseer ciertas propiedades, tales como ser biocompatible, imitar las propiedades mecánicas del tejido de interés, sea capaz de degradación controlada, capaz de soportar la viabilidad celular, y capaz de permitir la remodelación tisular 2,3.

Una multitud de técnicas de fabricación se han desarrollado para generar construcciones viables, tridimensionales. Estas tecnologías se dividen en dos categorías principales: una convencionald avanzó. Las técnicas convencionales incluyen el uso de materiales tradicionales sintéticas y naturales para hacer estructuras porosas. Algunos ejemplos son solventes a presión, secado por congelación, y se funden moldeo. Las desventajas de estas técnicas incluyen el mal control de la porosidad dentro de la estructura (tamaño de poro y la interconectividad de los poros) y dificultad para hacer canales internos dentro de los andamios. Las técnicas avanzadas incluyen la estereolitografía, piezas de fundición, la impresión 3D, y electrospinning, entre otros 1. Estas técnicas tienen inconvenientes tales como la falta de canales microarquitectura de largo alcance, la selección del material para proporcionar una resistencia mecánica óptima mientras que ser capaz de dispensar a través de boquillas de pequeño diámetro, la optimización depende del material, requerirá una amplia post-procesamiento que podría ser tóxico, y restricción en el diseño de arquitecturas internas en una construcción in vitro. Un inconveniente importante en la impresión en 3D es la disponibilidad de los biomateriales que son portadores de células adecuadas, Mientras que también tiene las propiedades mecánicas requeridas para mantener una organización arquitectónica definido 12. La tecnología que aquí se presenta incorpora tanto las técnicas de fabricación convencionales y avanzados. Lo mejor de ambos mundos se deriva de la convergencia de la fabricación asistida por ordenador para crear o importar la arquitectura deseada con el desarrollo de un caucho enzima lábil. Los moldes de acero inoxidable fueron creados usando una máquina de fresado, pero su fabricación no se limita a esta técnica. El uso de una impresora 3D (por ejemplo, Makerbot), los mismos moldes se fabrican a partir de ácido poliláctico (PLA). Los moldes negativos se molieron utilizando directivas arquitectónicos diseñados por el programa de CAD, que proporciona moldes sólidos que crean una transferencia fácil y fiable de características para cualquier material. Esta tecnología es importante ya que permite no sólo el control de la composición del tejido externo, sino también de la arquitectura interna de gran complejidad. El trabajo que aquí se presentase centra principalmente en la caracterización de la goma de BSA, que se puede mezclar homogéneamente, se digiere fácilmente en una cantidad razonable de tiempo, era resistente a alteraciones en su estructura, y es capaz de imitar las características minutos, mientras se mantiene su estabilidad durante el proceso de colada . La limitación de esta técnica fue probada y la resolución del material de sacrificio puede mantener las dimensiones tan pequeñas como de 300 micras de diámetro. Sin embargo, la Figura 7 muestran que el canal está rodeado por una delgada capa de agente de liberación de molde. Utilizando un microscopio, esta área adicional se distingue claramente y se puede quitar para tener la dimensión deseada. Esta técnica Biofabrication permite la replicación de una amplia variedad de estructuras internas que van desde macro a micro-escala.

La albúmina sérica es la proteína más abundante en el sistema circulatorio. Dado que las proteínas son polielectrolitos, la solubilidad se determinó mediante interacciones electrostáticas 15-17. Se ha demostrado que a bajas concentraciones de sal, hay un desplazamiento salino en efecto en la proteína facilitando su solubilidad 18. El glutaraldehído es un agente de reticulación que causa cambios en las propiedades de la albúmina. El cambio de color se ve en la Figura 1 se atribuye a la formación de los enlaces aldimina 19-21. El glutaraldehído reacciona predominantemente con el BSA a través de los grupos amino de la lisina para formar los enlaces covalentes intermoleculares 14. Los datos indican que el aumento de las sales de mejora de la elasticidad del caucho (de 1x PBS a 2x PBS). La concentración de glutaraldehído alto produce geles más rígidos que los definidos con anterioridad en comparación con los de baja concentración. Sin embargo, son más difíciles de dispensar, mezclar homogéneamente, y forman geles frágiles. Para entregar la cantidad apropiada de BSA de goma en los moldes, cada parte del conjunto se debe mantener frío, ya temperaturas más altas aceleran la reacción glutaraldehído y BSA.El caucho ideal (30% de BSA 3% de glutaraldehído en PBS 2x o 1x PBS) se comporta como un material viscoelástico que pueda soportar la carga sin deformarse de forma permanente. Esto es muy importante cuando la manipulación y el material de fundición alrededor de la estructura de caucho de BSA.

La tripsina es una serina proteasa que hidroliza las proteínas. La tripsina es una enzima ampliamente utilizado que tiene una alta especificidad de escisión. Se escinde el cadenas de péptidos principalmente en el lado carboxilo de los aminoácidos lisina y arginina 22. BSA es fácilmente soluble a bajas concentraciones en agua, y la tripsina digiere fácilmente el caucho de BSA dejando intacta y relativamente intacto del colágeno. El material no tendrá ningún contacto con las células. La construcción se ensayó para determinar la presencia de glutaraldehído libre y no había rastros de este fijador. Esto demuestra la eficacia de la goma BSA como un material de sacrificio para Biofabrication. En este protocolo, el colágeno se utiliza como el material de soporte, pero cualquier otsu material que es resistente a la digestión con tripsina podría ser utilizado.

El trabajo futuro se centrará en la reconstitución de los componentes vasculares dentro de los hidrogeles sembrando el andamio con las células endoteliales y fibroblastos. Uno de los retos es crear una distribución uniforme de las células de todo el interior de los canales que imitan la distribución 3D nativo. Para solucionar este problema, se está desarrollando una estrategia que permite el cierre o taponamiento de los canales y la inyección de la suspensión celular. El material ensayado es Pluronic F127, que es un gel termorreversible, líquida a 4 ° C y un sólido por encima de 30 ° C 23,24. Una alta concentración de Pluronic tuvo éxito en la creación del sello temporal necesario. Después de la suspensión celular se encuentra dentro de los canales del andamio, la entidad se hace girar por una cantidad específica de tiempo hasta que las células se adhieren a todos los lados de la estructura 3D. El canal interior tendrá medios adecuados para el mantenimientola supervivencia celular. Pluronic mantiene su forma de gel y es fácilmente soluble en un ambiente acuoso. Una vez que las células se adhieren, el hidrogel se inunda con medios de comunicación, y puede ser cultivado en condiciones estacionarias o de flujo, dependiendo del propósito del estudio. Esta metodología será evaluada más allá y se convertirá en la continuación de esta publicación. La técnica Biofabrication descrito en este documento está siendo actualmente utilizado para desarrollar una réplica andamio de una arteria renal humano. El mismo enfoque se podría hacer con otros tipos de tejidos, tales como cardiaco, para ampliar la aplicabilidad de esta técnica para una amplia gama de aplicaciones clínicas.

La técnica Biofabrication desarrollado aquí es un paso adelante en la generación de andamios in vitro que pueden recapitular características geométricas intrínsecas forma rápida y fiable. Un material natural, tal como colágeno, se seleccionó porque ofrece señales físicas a las células más de materiales sintéticos óptima y químicas. estos namateriales turales se pueden utilizar para la investigación terapéutica, como modelos in vitro de desarrollo, malformación, y tejido de la enfermedad, así como para la sustitución de tejido dañado.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I Collagen extracted from calf hide
Hydrocloric Acid (HCl) Sigma-Aldrich 7647-01-0
Phosphate Buffer Solution (PBS Tablets) MP Biomedical U5378 1 tablet per 100 ml makes 1x PBS
Albumium from bovine serum (BSA) Sigma-Aldrich A9647
Glutaraldehyde Sigma -Aldrich G5882 Toxic
Lard Fields 3090
Stainless Steel Molds Milled using Microlution Machine
Air Brush Kit Central Pneumatic 47791
Mixing Tip for double syringe Medmix ML2.5-16-LLM Mixer, DN2,5X16, 4:1 brown, med
Small O ring for double syringe Medmix PPB-X05-04-02SM Piston B, 5 ml, 4:1, PE natural
Double Syringe cap  Medmix VLX002-SM Cap, 4:1/10:1, PE brown, med
Big O ring for double syringe Medmix PPA-X05-04-02SM Piston A, 5 ml, 4:1
Double Syringe Medmix SDL X05-04-50M Double syringe, 5 ml, 4:1
Double Syringe Dispenser Medmix DL05-0400M Dispenser, 5 ml, 4:1, med , plain
Laminim 3.6 mg/ml - extracted USC lab
20 ml Syringe Luer Lock Tip BD 302830
Luer Lock Caps Fisher JGTCBLLX
HEPES Sigma -Aldrich H4034
Gibco Minimum Essential Media 10x (MEM) Life Technologies 1143-030
Trypsin Life Technologies 27250-018
UV Crosslinker  Spectroline UV XLE1000
Sodium Cloride (NaCl) Fisher S271-10 To prepare Mosconas
Potassium chloride (KCl) Sigma -Aldrich P5405-250 To prepare Mosconas
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328-500 To prepare Mosconas
Glucose Sigma -Aldrich G-8270 To prepare Mosconas
Sodium Phosphate didasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich S-7907 To prepare Mosconas
Sterile Filter for syringes Corning 431224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles
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Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).More

Rodriguez-Rivera, V., Weidner, J. W., Yost, M. J. Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels. J. Vis. Exp. (108), e53578, doi:10.3791/53578 (2016).

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