Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
Genom-redigering af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) indeholder en genetisk kontrolleret og klinisk relevant platform, hvorfra at forstå menneskets udvikling og undersøge patofysiologi sygdommen. Ved at anvende stedspecifikke nukleaser (ssns) for genom redigering, den hurtige afledning af nye hPSC linjer huser specifikke genetiske ændringer i en ellers isogen indstilling bliver mulig. Zinkfinger nukleaser (ZFNs), transskriptionsaktivator–lignende effektor nukleaser (Talens) og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) / Cas9 er de mest almindeligt anvendte ssns. Alle disse nukleaser ved at indføre en dobbeltstrenget DNA pause på et bestemt sted, og derved fremme præcise gen redigering på et genomisk locus. SSN-meditated genom redigering udnytter to af cellens endogene DNA reparationsmekanismer, ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) og homologi rettet reparation (HDR), til enten at indføre indsættelses / deletionsmutationer eller altER genomet ved hjælp af en homolog reparation skabelon på stedet for den dobbeltstrengede brud. Elektroporering af hPSCs er et effektivt middel til transfektion ssns og reparation skabeloner, der inkorporerer transgener såsom fluorescerende journalister og antibiotikaresistens kassetter. Efter elektroporering, er det muligt at isolere kun de hPSCs der indarbejdet reparation konstruktionen ved at selektere for antibiotikaresistens. Mekanisk adskillelse hPSC kolonier og bekræfter ordentlig integration på målområdet gennem genotypebestemmelse muliggør isolering af målrettede korrekt og genetisk homogene cellelinjer. Gyldigheden af denne protokol demonstreres her ved hjælp af alle tre SSN platforme til at indarbejde EGFP og en puromycin modstand konstruere ind i AAVS1 sikker havn locus i humane pluripotente stamceller.
Genom redigering teknologier er i rivende udvikling i standard værktøjer til molekylær og cellebiologi 1. Gensplejsning af humane pluripotente stamceller (hPSCs), er af særlig interesse som hPSCs udgør en selvfornyende kilde til genetisk intakte primære humane celler. hPSCs kan differentieres i forskellige celletyper for sygdom modellering eller som kilde til transplantation behandlingsformer 2,3. Demonstreret her er en protokol, der bruger tre forskellige typer af stedsspecifikke nukleaser (ssns), sammenholdt med endogene DNA reparation mekanismer til målrettet integration af en reporter konstruktion på AAVS1 locus. Efter transfektion af ssns i hPSCs, vi demonstrere, hvordan at isolere isogene cellepopulationer huser reporter.
Evnen til at manipulere genomer, specielt pluripotente stamceller genomer, hjælp ssns er ikke et nyt fænomen, da nytten af zink finger nukleaser (ZFNs) og transskription activateller-lignende effektor nukleaser (Talens) for genet redigering blev påvist for flere år siden 4-10. Men med fremkomsten af S. pyogenes CRISPR / Cas9 teknologi 11-13, er gen redigering blevet bredt tilgængelige 14. Alle ssns indføre et dobbeltstrenget DNA brud (DSB) på det angivne målsted 1,4,5,11 der er repareret af endogene cellulære mekanismer ved hjælp af enten ikke-homolog endesammenbinding (NHEJ) eller homologi rettet reparation (HDR) 15. NHEJ er fejlbehæftet og kan indføre rammeskift mutationer, der resulterer i tab af genfunktion, mens HDR muliggør nye elementer, der skal indføres gennem co-transfektion af en reparation skabelon med SSN. Mens de grundlæggende principper for DNA-reparation, der letter gen redigering menes at være stort set den samme for hver SSN, kan bemærkes, nogle forskelle mellem platformene. De novo design ZFNs giver mulighed for fleksibilitet og nuklease optimering 16, men brugen af offentligttilgængelige samling biblioteker og screening-værktøjer til at designe individuelle ZFNs kan være tidskrævende. Når den ønskede sted for ZFN-medieret målretning bestemmes, kan ZFN parvis udformes med online-værktøj ZiFit 17. Efter design, kan ZFNs være modulært samles gennem flere runder af plasmid kloning 18. Alternativt er der mange kommercielt tilgængelige, pre-valideret ZFNs 19. Fortælling nucleaser kan også være udformet ved hjælp af online værktøjer og offentligt tilgængelige komponenter 17,20. For eksempel kan Talens hurtigt samlet fra blokke af fem fortælling gentagelser gennem FLASH samlingen 21 eller ved hjælp af PCR-hierarkiske Golden Gate samling 22. Nem SSN design og hastighed konstruktion ved hjælp af CRISPR / Cas9 har gjort genom redigering en bredt tilgængelig værktøj. Den korte guide RNA-medieret målretning af CRISPR / Cas9 også mulighed for multipleksing af vejledning RNA'er til at målrette flere loci med en enkelt konstruktion 14. Udformningenaf Cas9 til gen-redigering kræver kun identifikation af en protospacer tilstødende motiv (PAM, en NGG trinukleotid for S. pyrogenes Cas9) proximalt i forhold til mållocuset. Ved at indsætte et oligonukleotid svarende til de 20 basepar 5 'for PAM i px330 plasmid 14, kan konstruktionen samles i et kloningstrin. Ud over S. pyogenes Cas9, Cas9 fra N. meningitidis (NmCas9), som genkender en 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) har vist sig at muliggøre effektiv gen-redigering i hPSCs 23.
Ud over forskellene i let design SSN, hver platform har specifikke egenskaber. For eksempel ZFNs og Talens udnytte Fokl nukleasedomænet, som genererer en fire nukleotid 5 'overhæng 24, mens Cas9 menes at generere det meste stumpendede DSBs. ZFNs, Talens og Cas9 adskiller sig i deres protein stabiliteter, on-off-rate på mål-DNA, og tilstanden af DNA scanning, som alle Could teoretisk resultere i små forskelle i redigeringen udfald 1. Mens yderligere undersøgelser vil være forpligtet til fuldt ud at forstå konsekvenserne af disse forskelle, vi beskriver her en protokol, der er meget robust på tværs af alle tre platforme og kan bruges til let at generere genmodificerede hPSCs.
Uanset SSN valg, elektroporering er en solid procedure til transfektion ssns og homologi reparation skabeloner i hPSCs 25. Antallet af overlevende kolonier efter udvælgelse for antibiotikaresistens afhænger locusspecifikke parametre og redigeringen strategien (f.eks størrelse transgen insert og udvælgelsesmåde). Protokollen beskrevet her normalt resulterer i omkring 150-400 encellede afledte kolonier.
Gene-redigering på AAVS1 locus ved hjælp af denne protokol er tidligere blevet brugt til at demonstrere effektiviteten af ssns 4,5. AAV-CAGGS-EGFP reparation Skabelonen anvender et gen fælde strategy at give puromycin resistens i en locus-specifik måde. Kort fortalt, reparation skabelon indeholder en splejsningsacceptorsite opstrøms for promotor-puromycin-resistente kassette. Ved korrekt integration ind i den første intron af PPP1R12C genet ved AAVS1 locus, er modstanden kassetten udtrykt fra den redigerede genets promotor. Robustheden af denne specifikke AAVS1 analyse giver os mulighed for at sammenligne effektiviteten af hver SSN platform.
Gene redigering ved hjælp ssns er kraftfuld får mulighed for at afbryde og / eller ændre teoretisk helst gen. Anvende denne strategi til hPSCs giver alsidighed hPSCs efterfølgende kan differentieres i en lang række humane celletyper såsom neuroner 26, hepatocytter 27 og 28 cardiomyocytter. Derudover er anvendelsen af patient-afledt inducerede pluripotente stamceller tillader reparation eller indførelse af kendte sygdomsfremkaldende mutationer hos en patient-specifikke genetiske baggrund 29 </sup>, Hvilket giver en platform, hvorfra man undersøge sygdomsmekanismer og test terapi ved hjælp af en patientens egne celler 30. Sammenfattende gen redigering i hPSCs er en effektiv og alsidig tilgang til undersøgelse den grundlæggende biologi menneskelig udvikling og sygdom 31.
Den præsenteres her til isolering homogene populationer af gen-redigerede humane pluripotente stamceller metode er en kraftfuld metode til at generere isogene hPSC linjer, der kun adskiller sig ved den målrettede locus. Disse celler er et ideelt system til sondering mekanismerne i human cellulær differentiering og udvikling samt for at forstå patofysiologien af monogene sygdomme i et kontrolleret genetiske omgivelser. Som vist her, er det muligt at anvende tre uafhængige design SSN strategier (ZFNs, Talens og CRISPR / Cas9) for at opnå målrettet integration på AAVS1 locus. Hver af disse metoder har sine egne fordele og ulemper. En potentiel fordel ved ZFNs og til en vis grad, Talens er deres design fleksibilitet, som gør det muligt iterativ teknik med henblik på at forbedre DNA-bindende domæner af individuelle nukleaser 42. Denne nuklease optimering kunne øge specificiteten af ZFNs og Talens end hvad der er opnåeligt med CRISPR / Cas9 system. En sådan selektivitet kan være vigtig til kliniske anvendelser, der kræver en høj grad af målspecificitet. Den primære fordel ved CRISPR / Cas9 systemet er dets brugervenlighed. Selvom talen og ZFN byggesæt er blevet gjort tilgængelige for offentligheden (dvs. via Addgene 21), CRISPR / Cas9-baserede ssns er betydeligt lettere at konstruere, som den eneste nødvendige tilpasning er et par oligonukleotid 20 base (ved brug af px330 plasmidet design 14). Denne enkelthed viser sig at være en fordel for forskningslaboratorier søger at inkludere genom redigering i deres studier.
Der er alternative transfektionsteknikker, herunder nucleofection 43, for at skabe gen-redigerede hPSC linjer; dog elektroporation har vist sig at være konsekvent og omkostningseffektiv 4,5,25. Nucleofection kan anvendes til direkte transfektion Cas9-Guide RNA ribonucleoprotein komplekser ind i kernen, hvilket øger effektiviteten SSN end troskab 44. Voksende hPSCs på MEF'er er en robust og billig metode til at opretholde hPSCs i en pluripotent tilstand uden overdreven differentiering. Desuden giver mulighed for nem isolation af genetisk identiske kolonier. Alternativt er det muligt at dyrke hPSCs uden MEF'er, men disse dyrkningsbetingelser kan være dyrere end feeder baseret kulturer. Desuden er hele processen skalerbar, der giver mulighed for isolering af meget sjældne begivenheder redigering eller produktion af mange forskellige cellelinjer i parallelle eksperimenter redigering.
Den her beskrevne protokol er robust; men der er flere vigtige skridt, der påvirker den effektivitet, hvormed der kan opnås korrekt redigeres kloner. Det mest kritiske komponent til denne metode er at have høj kvalitet MEF'er og lægemiddelresistente DR4 MEF'er. Overlevelsen af enkelte hPSCs er spinkel, og lav kvalitet MEF'er vil hindre isolering af udifferentierede hPSC linjer. For det andet, anvendelse af Y-27632 er ogsåkommando til enkelt celle overlevelse uden at generere en selektionspres for celler med en unormal karyotype 45. For det tredje, picking godt fordelte kolonier sikrer genetiske homogenitet de afledte cellelinier. Endelig er det vigtigt at forberede glaspipetter således at åbningen er lille nok til at bryde kolonien i mange mindre stykker, der sikrer, at flere kolonier vil vokse i den nye brønd. Dette tillader plukning af godt fordelte subkloner for en replika plade til at have i kultur, efterlader den oprindelige plade af isolerede kolonier til genotypebestemmelse. En udfordrende del i denne protokol er den manuelle trækker af glas pipetter; dette bør praktiseres på forhånd. Det skal bemærkes, at der er flere teknikker til plukning klon, der ikke kræver et glas pipette. Eksperimentatorer opfordres til at finde en, der virker bedst for dem.
Der er begrænsninger forbundet med denne protokol, kan overvindes ved simple modifikationer. Et forsøg har til formål at oun forstyrre locus af interesse uden reparation eller én, hvis reparation skabelon indeholder ikke en selektionskassette, skal anvende en anden metode til at berige for celler, der blev redigeret. Bemærk, at antallet af kolonier, der skal plukkes til at finde en positiv klon øger i høj grad i fravær af markering. En strategi til forbedring af effektivitet er at co-transficere en ikke-integrerende plasmid, der udtrykker et fluorescerende protein. Efter at cellerne til at komme sig to dage, kan målrettede celler sorteres på positivt fluorescens under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering og genudpladet 29. Denne proces beriger for celler, der er blevet transficeret med plasmiderne ved elektroporering og derved øger sandsynligheden for en samtidig redigering begivenhed i cellen.
De her beskrevne teknikker kan udvides til at bruge flere RNA'er guide til samtidig målrette flere loci 14,46,47. Mange protokoller er blevet etableret for at differentiere hPSCsi distinkte celletyper, så forskellige genetiske manipulationer i celletyper af interesse 30. Samlet set har vi demonstreret potentialet for effektiv genom redigering i hPSCs uanset SSN valg. Vi foreslår, at denne teknik kan tilpasses til at skabe isogene hPSC linjer, der er blevet gen-redigeret på ethvert genomiske locus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev understøttet af en Brain Research Foundation Seed Grant (BRFSG-2014-02) til Helen Bateup. Dirk Hockemeyer er en New Scholar i Aging af Ellison Medical Foundation og er støttet af Glenn Fonden samt Den Shurl og Kay Curci Foundation. DH er også støttet af NIH tilskud 1R01CA196884-01.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |