Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
ヒト多能性幹細胞(hPSCs)のゲノム編集は人間開発を理解し、疾患の病態生理学を研究する、そこから遺伝的に制御され、臨床的に関連するプラットフォームを提供します。ゲノム編集のための部位特異的ヌクレアーゼ(のSSN)を採用することにより、それ以外の場合は同質遺伝子の設定で特定の遺伝子変異を保有する新しいHPSCラインの迅速な誘導が可能となります。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNは)、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ(TALENs)とクラスタ化された定期的interspaced短い回文繰り返し(CRISPR)/ Cas9は、最も一般的に使用されるのSSNです。これらのヌクレアーゼのすべては、それによってゲノム遺伝子座で正確な遺伝子編集を促進する、指定されたサイトで、二本鎖DNA切断を導入することによって機能します。 SSN-瞑想ゲノム編集は、挿入/欠失変異を導入したり代替するか、細胞の内因性DNA修復機構、非相同末端結合(NHEJ)と相同性を向い修理(HDR)のうちの2つを利用します二重鎖切断部位での相同修理テンプレートを使用してゲノムえー。 hPSCsのエレクトロポレーションは、蛍光レポーターおよび抗生物質耐性カセットとして導入遺伝子を組み込むのSSNや修理テンプレートをトランスフェクションの効率的な手段です。エレクトロポレーション後に、抗生物質耐性のために選択することによって、修復構築物を組み込んだだけhPSCsを単離することが可能です。機械的にHPSCコロニーを分離し、ジェノタイピングを通じて標的部位での適切な統合を確認すると、正確に標的と遺伝的に均一な細胞株を単離することができます。このプロトコルの有効性は、ヒト多能性幹細胞におけるAAVS1セーフハーバー座に構築EGFPおよびピューロマイシン耐性を組み込むためにすべての3つのSSNのプラットフォームを利用して、ここで示されています。
ゲノム編集技術が急速に分子および細胞生物学の1のための標準的なツールに進化しています。 hPSCsは、遺伝的に無傷の初代ヒト細胞の自己再生ソースを表し、ヒト多能性幹細胞(hPSCs)の遺伝子操作は、特に重要です。 hPSCsは、疾患のモデリングのための、または移植療法2,3のソースのような種々の細胞型に分化させることができます。ここでの実証は、AAVS1遺伝子座にレポーター構築物の標的組み込みのための内因性DNA修復機構に関連して、部位特異的ヌクレアーゼ(SSNの)の3つの異なるタイプを使用するプロトコルです。 hPSCsへのSSNのトランスフェクションの後、我々は、レポーターを保有する同質遺伝子の細胞集団を分離する方法を示します。
特に多能性細胞のゲノムを幹、ゲノムを操作する能力は、使用してのSSNは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNを)および転写activatのユーティリティなどの新しい現象ではありません遺伝子編集またはのようなエフェクターヌクレアーゼ(TALENs)が数年前に4-10実証されました。しかし、S。ピオゲネスCRISPR / Cas9技術11-13の出現により、遺伝子編集は14広くアクセスできるようになりました。すべてのSSNは、非相同末端結合(NHEJ)または相同性向かう修理(HDR)15のいずれかを使用して、内因性の細胞メカニズムによって修復された特定の標的部位1,4,5,11で二本鎖DNA切断(DSB)を導入。 HDRは、SSNと修復鋳型の同時トランスフェクションを介して導入される新規な要素を可能にしながら、NHEJは、誤りがちであり、遺伝子機能の喪失をもたらすフレームシフト変異を導入することができます。遺伝子編集を促進するDNA修復の基本原理は、各SSNのために大部分が同じであると考えられている一方で、プラットフォーム間のいくつかの違いに注意することができます。のZFNのデノボ設計は柔軟性およびヌクレアーゼの最適化16、公にのが使用することができます個々のZFNを設計するために利用可能な組立ライブラリおよびスクリーニングツールは、時間がかかることがあります。 ZFN媒介性標的化のための所望の遺伝子座が決定されると、ZFN対は、オンラインツールZiFit 17を設計することができます。設計後、ZFNはモジュール式には、プラスミドクローニング18のいくつかのラウンドを通じて組み立てることができます。また、事前検証済みのZFN 19、市販の多くがあります。 TALEヌクレアーゼは、オンラインツールと公に利用可能なコンポーネント17,20を用いて設計することができます。例えば、TALENsは急速FLASHアセンブリ21またはPCRベースの階層的なゴールデンゲートアセンブリ 22 を使用してを通じて、5 TALEリピートのブロックから組み立てることができます。 SSNの設計およびCRISPR / Cas9を使用して、建設の速度やすさ、広くアクセス可能なツールを編集するゲノムをしました。ガイドRNAの多重化は単一の構築物14でいくつかの遺伝子座を標的とするようにするためのショートガイドRNAを媒介CRISPR / Cas9の標的化もできます。デザイン標的遺伝子座に近接し、遺伝子編集のためのCas9のprotospacer隣接モチーフ(S.用NGGトリヌクレオチドはCas9をpyrogenes PAM)の識別のみを必要とします。 px330プラスミド14にPAMの20塩基対の5 '末端に対応するオリゴヌクレオチドを挿入することによって、構築物は、一のクローニング工程で組み立てることができます。 Sに加えて、 N.からピオゲネス Cas9、Cas9 5'-NNNNGATT-3 '(PAM)を認識し、 髄膜炎菌 (NmCas9)はhPSCs 23で効率的な遺伝子編集を可能にすることが示されています。
SSN設計の容易さの違いに加えて、各プラットフォームに固有の特性を有します。例えば、ZFNはとTALENsはCas9は主に平滑末端のDSBを生成すると考えられている間に4ヌクレオチドの5 'オーバーハング24を発生させるのFokIヌクレアーゼドメインを利用します。 ZFNは、TALENs、およびCas9は、オンオフ率標的DNAに、それらのタンパク質の安定性に異なり、DNAスキャンのモードすべてがCの理論的には、編集結果1の小さな差が生じるウルド。さらなる研究は、完全にこれらの違いの影響を理解するために必要とされるが、ここではすべての3つのプラットフォーム間で非常に堅牢で、容易に遺伝的に改変されたhPSCsを生成するために使用できるプロトコルを記述する。
かかわらず、SSNの選択の、エレクトロポレーションは、hPSCs 25にSSNのと相同性の修理テンプレートをトランスフェクトする堅牢な手順です。抗生物質耐性のための選択後にコロニーの生存数は、遺伝子座特異的なパラメータと編集方針(トランスジェニック挿入と選択のモードの例えば、大きさ)に依存します。ここで説明するプロトコルは、通常、約150〜400単一細胞由来のコロニーを生じます。
このプロトコルを使用してAAVS1遺伝子座での遺伝子編集は、以前のSSN 4,5の有効性を実証するために使用されています。 AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートは、遺伝子トラップstrを使用しています遺伝子座特異的にピューロマイシン耐性を付与するategy。簡単に言えば、修理テンプレートは、プロモーターのピューロマイシン耐性カセットの上流のスプライスアクセプター部位を含みます。 AAVS1遺伝子座におけるPPP1R12C遺伝子の最初のイントロン中に正しい組込みに際して、耐性カセットを編集する遺伝子のプロモーターから発現されます。この特定のAAVS1アッセイの堅牢性は、私たちは各SSNプラットフォームの効率を比較することができます。
SSNのを用いた遺伝子編集は任意の遺伝子を破壊および/または理論的に変更する能力与えられた強力です。 hPSCsは、その後、このようなニューロン26,27を肝細胞、心筋細胞28のようなヒトの細胞型の多数に分化させることができるようにhPSCsにこの戦略を適用すると、汎用性を提供します。加えて、患者由来の誘導多能性幹細胞の使用は、患者固有の遺伝的背景29における修復または既知の疾患を引き起こす変異の導入を可能にします</sup>、病気のメカニズムおよび患者自身のセル 30 を用いた試験治療を調査するためのプラットフォームを提供します。要約すると、hPSCsにおける遺伝子編集は人間開発や病気31の基本的な生物学を研究するための効率的で汎用性の高い手法です。
遺伝子編集されたヒト多能性幹細胞の均質な集団を単離するため、ここで提示された方法は、標的遺伝子座でのみ異なる同質遺伝子HPSC株を生成するための強力なアプローチです。これらの細胞は、ヒト細胞の分化および発生のメカニズムを探索するためだけでなく、制御の遺伝的環境の中で単一遺伝子疾患の病態生理を理解するための理想的なシステムです。ここで実証されるように、それはAAVS1遺伝子座での標的組込みを達成するために、3つの独立したSSNの設計戦略(ZFNは、TALENs、およびCRISPR / Cas9)を使用することが可能です。これらの方法のそれぞれが独自の長所と短所があります。電位のZFNの利点とは、ある程度、TALENsは個々ヌクレアーゼ42のDNA結合ドメインを改善するために、反復エンジニアリングを可能にするそれらの設計の柔軟性です。このヌクレアーゼの最適化は、CRIで達成可能であるものを超えてのZFNとTALENsの特異性を増加させることができますSPR / Cas9システム。このような選択性は、標的特異性の高い程度を必要とする臨床応用のために重要であり得ます。 CRISPR / Cas9システムの主な利点は、その使いやすさです。 TALENとZFNコンストラクションキットは、パブリック( すなわち、Addgene〜21)が利用できるようにしてきたがpx330プラスミドを使用する場合にのみ必要なカスタマイズが20塩基対のオリゴヌクレオチド(あるとして、CRISPR / Cas9ベースのSSNは、構築する非常に容易ですデザイン14)。このシンプルさは、彼らの研究におけるゲノム編集を含めるように探している研究室のために有利であることがわかります。
遺伝子編集しHPSCラインを作成するためのヌクレオ43、などの代替トランスフェクション技術があります。しかし、エレクトロポレーションは、一貫して費用対効果4,5,25であることが示されています。ヌクレオはSSN効率ANの増加、直接核にCas9ガイドRNAのリボ核タンパク質複合体をトランスフェクトするために使用することができDの忠実度44。 MEFの上に成長hPSCsは、過剰な分化せずに多能性状態でhPSCsを維持するために、堅牢かつ安価な方法です。また、遺伝的に同一のコロニーの容易な単離を可能にします。あるいは、しかしながら、これらの培養条件は、フィーダベースの培養よりも高価になることができ、MEFのない培養hPSCsすることが可能です。さらに、全体のプロセスは非常にまれな編集イベントの単離または並列編集実験で多数の異なる細胞株の生成を可能にする、拡張可能です。
ここで説明するプロトコルは強固です。しかし、正しく編集したクローンを得ることができると効率に影響を与えるいくつかの重要なステップがあります。この方法のための最も重要なコンポーネントは、高品質のMEFと薬剤耐性のDR4のMEFをしています。単一hPSCsの生存が希薄で、低品質のMEFは未分化HPSCラインの分離を妨げます。第二に、Y-27632の使用でもあります異常な核型45を有する細胞に対して選択的な圧力を生成せずに、単一の細胞の生存を可能にするキー。第三に、十分な間隔コロニーを選ぶことは由来細胞株の遺伝的均質性を保証します。最後に、開口部は、複数のコロニーを新しいウェルに成長することを確認して、多くの小片にコロニーを破壊するのに十分に小さくなるようにガラスピペットを準備することが重要です。これは、遺伝子型決定のために単離したコロニーの原版を残し、文化の中で持っているレプリカプレートでよく間隔のサブクローンのピッキングが可能になります。このプロトコルで挑戦的な部分は、ガラスピペットの引き上げマニュアルです。これは、事前に実施されなければなりません。これは、ガラスピペットを必要としないクローンピッキングの複数の技術が存在することに留意すべきです。実験者は、彼らのために最も適したものを見つけるために奨励されています。
単純な修正によって克服することができるこのプロトコルには制限があります。 Oに意図された実験NLY編集された細胞を富化する別の方法を使用する必要があり、修理またはその修理テンプレート選択カセットを含まないものなしに関心の座を崩壊させます。陽性クローンを見つけるために選ばれなければならないコロニーの数は、選択の非存在下では大幅に増加することに注意してください。効率を改善する1つの戦略は、蛍光タンパク質を発現する非組み込みプラスミドを同時トランスフェクトすることです。細胞は2日間回復させた後、標的細胞は、蛍光活性化セルソーティングを使用して正の蛍光でソートし、29を再播種することができます。このプロセスは、エレクトロポレーションによりプラスミドでトランスフェクトされた細胞のために豊かにし、それによって細胞内での同時編集イベントの確率が高くなります。
ここに記載された技術は、同時に複数の遺伝子座14,46,47を標的とするために 、複数のガイドRNAを使用するように拡張することができます。多くのプロトコルは、hPSCsを区別するために設立されました異なる細胞型に、関心対象30の細胞型における種々の遺伝子操作を可能にします。全体的に、我々は関係なく、SSNの選択のhPSCsで効率的なゲノム編集の可能性を実証しました。我々は、この技術は、任意のゲノム遺伝子座での遺伝子編集された同質遺伝子HPSCラインを作成するように構成することができることを提案します。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ヘレンBateupに脳研究財団のシード・グラント(BRFSG-2014から02)によってサポートされていました。ディルクHockemeyerは、エリソン医学財団のエイジングの新学者で、グレン財団だけでなく、ザ・Shurlとケイクルチ財団によってサポートされています。 DHはまた、NIHの助成金1R01CA196884-01によってサポートされています。
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |