Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
Genoma de edição de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) fornece uma plataforma controlada geneticamente e clinicamente relevante do que para entender o desenvolvimento humano e investigar a fisiopatologia da doença. Ao empregar nucleases específicas do site (CPFs) para edição genoma, o rápido derivação de novas linhas HPSC abrigando alterações genéticas específicas em um ambiente de outra forma isogênico se torna possível. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS) e agrupados repete regularmente palindr�icas curtas intercaladas (CRISPR) / Cas9 são os CPFs mais comumente usados. Todas estas nucleases funcionar através da introdução de uma pausa de DNA de cadeia dupla em um local especificado, promovendo assim a edição gene preciso em um locus genómico. Edição genoma SSN-meditado explora dois dos mecanismos da célula endógenos de reparo do DNA, final não homóloga juntar (NHEJ) e homologia reparo dirigido (HDR), quer para introduzir inserção / mutações de deleção ou alter o genoma utilizando um modelo de reparação homóloga no local da ruptura de cadeia dupla. Eletroporação de hPSCs é um meio eficiente de transfecção de CPFs e modelos de reparação que incorporam transgenes como repórteres fluorescentes e cassetes de resistência a antibióticos. Após a electroporação, é possível isolar apenas os hPSCs que incorporaram a construção de reparação por selecção de resistência a antibióticos. Mecanicamente separar colónias HPSC e confirmando a integração apropriada no local alvo através de genotipagem permite o isolamento de linhas celulares corretamente alvejadas e geneticamente homogéneos. A validade do presente protocolo é demonstrado aqui, utilizando todas as três plataformas SSN para incorporar EGFP e uma resistência puromicina construir no AAVS1 seguro lócus porto em células-tronco pluripotentes humanas.
Tecnologias de edição genoma estão evoluindo rapidamente em ferramentas padrão para biologia molecular e celular 1. A engenharia genética de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) é de particular interesse como hPSCs representam uma fonte de auto-renovação das células primárias humanas geneticamente intactas. hPSCs podem ser diferenciadas em vários tipos de células para a modelagem doença ou como uma fonte para terapias de transplante 2,3. Aqui demonstrada é um protocolo que utiliza três diferentes tipos de nucleases específicas do local (SSNs) em conjunto com os mecanismos de reparação de ADN endógenas alvo para a integração de uma construção repórter no locus AAVS1. Após transfecção de CPFs em hPSCs, demonstramos como isolar populações de células isog�nicas abrigar o repórter.
A capacidade de manipular genomas, especificamente pluripotent stem genomas celulares, usando CPFs não é um fenômeno novo como o utilitário de nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e transcrição activatnucleases efetoras ou semelhantes (TALENS) para a edição gene foi demonstrado há vários anos 4-10. No entanto, com o advento do S. pyogenes CRISPR / tecnologia Cas9 11-13, edição gene tornou-se amplamente acessíveis 14. Todos os CPFs introduzir uma quebra de DNA de cadeia dupla (DSB) no local de destino especificado 1,4,5,11 que seja reparado por mecanismos celulares endógenos usando não homóloga de reparação (NHEJ) juntando-final ou homologia dirigido (HDR) 15. NHEJ é propensa a erros e pode introduzir mutações deslocamento do quadro resultando em perda da função do gene, enquanto HDR permite novos elementos para ser introduzido através da co-transfecção de um modelo de reparação com o SSN. Embora os princípios subjacentes de reparo do DNA que facilitam a edição gene são pensados para ser basicamente o mesmo para cada SSN, algumas diferenças entre as plataformas podem ser observados. De novo projeto de ZFNs permite flexibilidade e otimização nuclease 16, no entanto, o uso de publicamentebibliotecas de montagem disponíveis e ferramentas de triagem para projetar ZFNs individuais pode ser demorado. Uma vez que o local desejado para segmentação ZFN mediada é determinado, pares ZFN pode ser projetado com a ferramenta on-line ZiFit 17. Depois de design, ZFNs podem ser modularmente montado através de várias rodadas de clonagem plasmídeo 18. Como alternativa, há muitos disponíveis comercialmente, pré-validado ZFNs 19. Nucleases CONTO também podem ser projetados usando ferramentas on-line e componentes publicamente disponíveis 17,20. Por exemplo, TALENS pode ser rapidamente montada a partir de blocos de cinco repetições conto, através do conjunto FLASH 21 ou usando PCR hierárquica montagem 22 Golden Gate base. Facilidade de projeto SSN e velocidade de construção utilizando CRISPR / Cas9 fez genoma editar uma ferramenta amplamente acessível. O guia curta mediada RNA-targeting de CRISPR / Cas9 também permite a multiplexação de RNAs guia para direcionar vários loci com uma única construção 14. O designde Cas9 para edição gene requer apenas a identificação de um motivo adjacente protospacer (PAM; um trinucleótido NGG por S. pyrogenes Cas9) proximal em relação ao locus alvo. Através da inserção de um oligonucleótido que corresponde aos 20 pares de bases 5 'do PAM no plasmídeo px330 14, a construção pode ser montado em uma etapa de clonagem. Além S. pyogenes Cas9, Cas9 de N. meningitidis (NmCas9) que reconhece um 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) foi mostrado para permitir a eficiente do gene de edição em hPSCs 23.
Em adição às diferenças na facilidade de concepção SSN, cada plataforma tem propriedades específicas. Por exemplo, ZFNs e TALENS utilizar o domínio de nuclease Fokl, que gera um de quatro nucleótidos 5 'saliência 24, enquanto Cas9 é pensado para gerar na maior parte neutralizar LAP casquilhos. ZFNs, TALENS, e Cas9 diferem nas suas estabilidades de proteína, a taxa de sobre-off no ADN alvo, e o modo de digitalização do ADN, todos os quais Could teoricamente resultar em pequenas diferenças no resultado de edição 1. Embora mais estudos serão necessários para compreender plenamente as consequências dessas diferenças, nós descrevemos aqui um protocolo que é altamente robusto em todas as três plataformas e pode ser usado para gerar prontamente hPSCs geneticamente modificados.
Independentemente da escolha SSN, eletroporação é um procedimento robusto para transfectar CPFs e modelos de reparação de homologia em hPSCs 25. O número de colónias sobreviventes após selecção para resistência a antibióticos depende de parâmetros específicas para um local e a estratégia de edição (por exemplo, tamanho de inserção transgénica e o modo de selecção). O protocolo aqui descrito geralmente resulta em cerca de 150-400 colónias derivadas de uma única célula.
No locus AAVS1 utilizando este protocolo de edição de gene tenha sido previamente utilizado para demonstrar a eficácia de SSN 4,5. O modelo de reparação de AAV-EGFP-CAGGS utiliza um str armadilha de genesategy para conferir resistência puromicina de uma maneira específica local. Resumidamente, o modelo de reparação contém um local aceitador de união a montante da cassete de promotor de resistência puromicina. Após integração correcta no primeiro intrão do gene PPP1R12C no locus AAVS1, a cassete de resistência é expresso a partir do promotor do gene editado. A robustez deste ensaio AAVS1 específica nos permite comparar a eficiência de cada plataforma SSN.
Edição Gene usando CPFs é poderosa, dada a capacidade de perturbar e / ou alterar teoricamente qualquer gene. Aplicando esta estratégia para hPSCs oferece versatilidade como hPSCs pode ser posteriormente diferenciadas em uma infinidade de tipos de células humanas, como neurônios 26, os hepatócitos 27 e cardiomiócitos 28. Além disso, a utilização de células estaminais pluripotentes induzidas derivadas de doentes permite a reparação ou a introdução de mutações causadoras de doenças conhecidas num fundo genético específico do paciente 29 </sup>, Proporcionando uma plataforma para investigar os mecanismos da doença e terapêutica de teste usando próprias células de um paciente 30. Em resumo, edição gene em hPSCs é uma abordagem eficiente e versátil para investigar a biologia básica do desenvolvimento humano e da doença 31.
O método apresentado aqui para o isolamento de populações homogêneas de células-tronco pluripotentes humanas editada por genes é uma abordagem poderosa para gerar linhas HPSC isogênicas que diferem apenas no locus alvo. Estas células são um sistema ideal para sondar os mecanismos da diferenciação celular e desenvolvimento humano, bem como para compreender a patofisiologia de doenças monogénicas, num ambiente controlado genética. Como demonstrado aqui, é possível usar três estratégias de desenho independentes SSN (ZFNs, TALENS, CRISPR e / Cas9) para conseguir a integração alvo no locus AAVS1. Cada um destes métodos tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Uma vantagem potencial da ZFNs e, em certa medida, é TALENS sua flexibilidade de desenho, o que permite a engenharia iterativo, a fim de melhorar a domínios de nucleases individuais 42 de ligação do ADN. Essa otimização nuclease poderia aumentar a especificidade do ZFNs e TALENS além do que é possível com a CRISistema SPR / Cas9. Tal selectividade pode ser importante para aplicações clínicas requerem um alto grau de especificidade alvo. A principal vantagem do sistema CRISPR / Cas9 é a sua facilidade de uso. Embora TALEN e ZFN kits de construção têm sido postos à disposição do público (ou seja, através de Addgene 21), CRISPR / SSN baseados em Cas9 são significativamente mais fáceis de construir, como o único personalização necessário é um par oligonucleótido de 20 bases (quando se utiliza o plasmídeo px330 projeto 14). Esta simplicidade revela-se vantajosa para os laboratórios de pesquisa que procuram incluem edição genoma em seus estudos.
Existem técnicas de transfecção alternativos, incluindo nucleofection 43, para criar linhas HPSC editada por genes; No entanto electroporação foi demonstrado ser eficaz 4,5,25 consistente e custo. Nucleofection pode ser utilizado para transfectar directamente Cas9-guia complexos de ARN no núcleo de ribonucleoproteína, aumentando a eficiência de um SSNd fidelidade 44. Crescer hPSCs em MEFs é um método robusto e baixo custo de manutenção hPSCs em um estado pluripotente sem diferenciação excessiva. Além disso, permite o isolamento fácil das colónias geneticamente idênticos. Em alternativa, é possível hPSCs cultura sem MEFs, no entanto, estas condições de cultura podem ser mais caros do que as culturas baseadas alimentadoras. Além disso, todo o processo é escalável, permitindo o isolamento de edição de eventos muito raros ou a geração de muitas linhas de células diferentes em experiências paralelas de edição.
O protocolo aqui descrito é robusta; no entanto, existem vários passos-chave que afetam a eficiência com que os clones corretamente editados podem ser obtidos. O componente mais importante para este método é que tem MEFs de alta qualidade e MEFs DR4 resistentes aos medicamentos. A sobrevivência de hPSCs individuais é tênue, e MEFs de baixa qualidade vai impedir o isolamento das linhas HPSC indiferenciadas. Em segundo lugar, o uso de Y-27632 é tambémchave para permitir a sobrevivência da célula única, sem gerar uma pressão seletiva para as células com um cariótipo anormal 45. Em terceiro lugar, escolher colónias bem espaçadas garante a homogeneidade genética das linhas celulares derivadas. Finalmente, é importante preparar pipetas de vidro de modo que a abertura é suficientemente pequena para quebrar a colónia em muitos pedaços menores, assegurando que várias colónias irão crescer no novo poço. Isto permite a colheita de subclones bem espaçados para uma placa de réplica para ter na cultura, deixando a chapa original de colônias isoladas para genotipagem. A parte difícil neste protocolo é o manual puxando das pipetas de vidro; esta deve ser praticada de antemão. Deve notar-se que existem várias técnicas de separação clone que não necessitam de uma pipeta de vidro. Experimentadores são incentivados a encontrar o que funciona melhor para eles.
Existem limitações para este protocolo que pode ser superado por modificações simples. Um experimento destina-se a óomente perturbar o locus de interesse, sem reparação ou uma reparação cujo modelo não contém uma cassete de selecção, deve usar outro método de enriquecimento de células que foram editados. Note-se que o número de colónias que deve ser escolhido para encontrar um clone positivo aumenta grandemente na ausência de selecção. Uma estratégia para melhorar a eficiência é a co-transfecção de um plasmídeo não integrando que expressa uma proteína fluorescente. Depois de permitir que as células recuperar durante dois dias, as células visadas podem ser classificados em fluorescência positiva utilizando separação de células activada por fluorescência e replaqueadas 29. Este processo enriquece para as células que foram transfectadas com os plasmídeos por electroporação e, assim, aumenta a probabilidade de um evento edição concorrente na célula.
As técnicas descritas aqui pode ser estendido para usar vários RNAs guia para atingir simultaneamente vários 14,46,47 loci. Muitos protocolos foram criados para diferenciar hPSCsem tipos de células distintos, permitindo várias manipulações genéticas em tipos de células de interesse 30. No geral, temos demonstrado o potencial para edição genoma eficiente em hPSCs independentemente da escolha SSN. Propomos que esta técnica pode ser adaptada para criar linhas isogénicas HPSC que foram gene editado em qualquer local genómico.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Cérebro Research Grant Semente (BRFSG-2014-02) para Helen Bateup. Dirk Hockemeyer é um New Scholar em Envelhecimento da Fundação Médica Ellison e é apoiado pela Fundação Glenn, bem como o The Shurl e Kay Foundation Curci. DH também é suportado pelo NIH conceder 1R01CA196884-01.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |