Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
Геном-редактирование человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) обеспечивает управляемый и генетически клинически значимых платформу, с которой, чтобы понять человеческое развитие и расследовать патофизиологии заболевания. Используя нуклеаз сайт-специфические (ПЛА) для редактирования генома, быстрый вывод новых линий HPSC укрывательство специфических генетических изменений в противном случае изогенной обстановке становится возможным. Цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / Cas9 являются наиболее часто используемые ПЛА. Все эти нуклеаз функционировать путем введения двухцепочечной ДНК перерыв в указанном сайте, тем самым способствуя точное редактирование генов на геномного локуса. SSN-медитировал редактирования генома эксплуатирует два эндогенных механизмов клеточных ДНК, ремонт негомологичными конец, соединяющих (NHEJ) и гомологии направленного ремонта (HDR), либо ввести вставки / удаления мутации или Altэр геном с использованием гомологичной шаблон ремонта на месте двухцепочечной перерыва. Электропорация hPSCs является эффективным средством трансфекции ПЛА и шаблоны, которые включают ремонт трансгенов, например, люминесцентных журналистами и антибиотиков кассет сопротивления. После электропорации, можно выделить только те, что включены hPSCs ремонта конструкции путем выбора для устойчивости к антибиотикам. Механического отделения HPSC колонии и подтверждения правильного интеграции в сайте-мишени путем генотипирования позволяет для выделения целевых правильно и генетически однородных клеточных линий. Срок действия данного протокола свидетельствует здесь, используя все три платформы SSN включать EGFP и сопротивление пуромицину построить в AAVS1 безопасной гавани локуса в человека плюрипотентных стволовых клеток.
Редактирования Геном технологии стремительно развиваются в стандартные инструменты для молекулярной и клеточной биологии 1. Генной инженерии из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) представляет особый интерес, так как hPSCs представляют самообновлению источник генетически интактных клеток первичных человеческих. hPSCs могут быть дифференцированы в различные типы клеток для моделирования заболевания или в качестве источника для трансплантации лечения 2,3. Доказанная здесь является протокол, который использует три различных типа сайт-специфических нуклеаз (ПЛА) в сочетании с эндогенными механизмами для целевого интеграции репортерной конструкции в локусе AAVS1 репарации ДНК. После трансфекции ПЛА в hPSCs, мы демонстрируем, как изолировать изогенные клеточных популяций укрывательство репортер.
Возможность манипулировать геномы, в частности, плюрипотентных стволовых клеток геномы, используя ПЛА не новое явление как полезность пальцев цинка нуклеаз (ZFNs) и транскрипции activatили как-нуклеазы эффекторные (Таленс) для редактирования генов была продемонстрирована несколько лет назад 4-10. Тем не менее, с появлением С. Пирролидонилпептидаза CRISPR / технологии Cas9 11-13, редактирование ген стал широко доступен 14. Все ПЛА ввести двухцепочечной ДНК брейк (DSB) в указанном целевом сайте 1,4,5,11, что отремонтированной эндогенными клеточными механизмами, используя либо негомологичную конец-присоединения (NHEJ) или гомологии направлены ремонт (HDR) 15. NHEJ подвержен ошибкам и может ввести сдвиг мутации кадров приводит к потере функции гена, в то время как HDR позволяет новые элементы вводится через котрансфекции шаблона с SSN ремонта. В то время как основные принципы ремонта ДНК, которые облегчают редактирование гена, как полагают, в значительной степени то же самое для каждого SSN, можно отметить некоторые различия между платформами. De Novo дизайн ZFNs позволяет гибкость и нуклеазы оптимизации 16, однако использование публичнодоступные библиотеки монтажные и скрининга инструменты для разработки индивидуальных ZFNs может занять много времени. После того, как нужный локус ZFN-опосредованной адресности определяется, ZFn пары могут быть разработаны с онлайн-инструмент ZiFit 17. После проектирования, ZFNs можно модульно собраны через несколько раундов плазмиды клонирования 18. Кроме того, существует много коммерчески доступных, предварительно проверены ZFNs 19. СКАЗКА нуклеазы также могут быть разработаны с помощью онлайн-инструментов и публично доступных компонентов 17,20. Например, Talens можно быстро собрать из блоков пяти сказка повторяется через FLASH сборки 21 или с помощью ПЦР на основе иерархической сборку Golden Gate 22. Простота конструкции и SSN скорости строительства с использованием CRISPR / Cas9 сделали геном редактирования широко доступной инструмент. Короткий руководство РНК-опосредованного нападения на CRISPR / Cas9 также позволяет мультиплексирование направляющих РНК целевых несколько локусов с одной конструкции 14. Дизайниз Cas9 для редактирования гена требует только идентификацию protospacer прилегающей мотива (PAM; A тринуклеотид NGG для S. pyrogenes Cas9) проксимально по отношению к локусу-мишени. Вставив олигонуклеотид, соответствующий 20 пар оснований 5'-PAM в px330 плазмиды 14, конструкция может быть собрана в одном шаге клонирования. В дополнение к S. Пирролидонилпептидаза Cas9, Cas9 от N. менингита (NmCas9), который распознает 5'-NNNNGATT-3 '(PAM), как было показано, чтобы обеспечить эффективное гена-редактирования в hPSCs 23.
В дополнение к различиям в простоте конструкции ПКР, каждая платформа имеет конкретные свойства. Например, ZFNs и Talens использовать нуклеазы домен Фоки, который генерирует четыре нуклеотида 5 'выступ 24, а Cas9, как полагают, генерировать основном тупыми DSBs. ZFNs, Talens и Cas9 отличаются стабильностью их белковых, включения-выключения ставка по ДНК-мишени, и режим сканирования ДНК, все из которых сульд теоретически привести к небольшим различиям в результатах редактирования 1. В то время как дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы полностью понять последствия этих различий, мы опишем здесь протокол, который высоко надежной во всех трех платформ и могут быть использованы для генерации легко генетически модифицированных hPSCs.
Независимо от выбора SSN, электропорации является надежным процедура трансфекции ПЛА и шаблоны гомологии ремонт в hPSCs 25. Число выживших колоний после отбора устойчивости к антибиотикам зависит локус-специфических параметров и стратегии редактирования (например, размер трансгенной вставки и режим выбора). Протокол, описанный здесь, как правило, приводит к примерно 150-400 одноклеточного полученных колоний.
Джин-редактирование в AAVS1 локуса, используя этот протокол был ранее использован для демонстрации эффективности ПЛА 4,5. Шаблон ремонт AAV-EGFP-CAGGS использует ген ловушки улategy для придания устойчивости пуромицину в локусе определенным образом. Вкратце, шаблон ремонта содержит сплайс акцепторный сайт в обратном направлении от промотора кассеты устойчивости к пуромицин. После правильного интеграции в первом интроне гена PPP1R12C в локусе AAVS1, кассета сопротивление экспрессируется из промотора отредактированный гена. Надежность этой конкретной AAVS1 анализа позволяет сравнивать эффективность каждой платформы SSN.
Редактирование с помощью генной ПЛА является мощным учитывая способность, чтобы сорвать и / или изменять теоретически любой ген. Применяя эту стратегию, чтобы hPSCs обеспечивает универсальность в hPSCs может быть впоследствии дифференцируются на множество типов клеток человека, таких как нейроны 26, гепатоциты 27 и 28 кардиомиоцитов. Кроме того, применение пациентом происходит индуцированных плюрипотентных стволовых клеток позволяет ремонта или введение известных мутаций болезнетворных у пациента конкретных генетического фона 29 </sup>, Обеспечивая платформу для изучения механизмов болезни и испытания терапии с использованием собственных клеток 30 пациента. В итоге, редактирование ген hPSCs является эффективным и универсальным подходом к исследованию фундаментальной биологии человеческого развития и болезней 31.
Метод, представленный здесь, для выделения однородных популяций генетически отредактировал человека плюрипотентных стволовых клеток является мощным подход для создания изогенные HPSC линии, которые отличаются только в целевой локуса. Эти клетки идеальной системой для исследования механизмов клеточной дифференцировки и развития человека, а также для понимания патофизиологии моногенных заболеваний в контролируемой генной обстановке. Как показано здесь, можно использовать три независимых АПЛ разработки стратегий (ZFNs, Talens и CRISPR / Cas9), чтобы достичь целевой интеграции в локусе AAVS1. Каждый из этих методик имеет свои преимущества и недостатки. Потенциальное преимущество ZFNs и, в некоторой степени, Talens их гибкость конструкции, которая позволяет итеративный инженерии с целью улучшения ДНК-связывающие домены отдельных нуклеаз 42. Эта оптимизация нуклеазы может увеличить специфичность ZFNs и Talens сверх того, что достижимо с ЧРИСистема ППР / Cas9. Такая избирательность может быть важным для клинических применений, требующих высокой степени специфичности мишени. Основное преимущество в CRISPR системы / Cas9 является его простота в использовании. Хотя Тален и ZFn строительные наборы были доступны для общественности (т.е., через Addgene 21), CRISPR / ПЛА Cas9 основе значительно легче построить, как только нужно изготовление на заказ 20 пар оснований олигонуклеотидов (при использовании px330 плазмиды дизайн 14). Эта простота оказывается выгодным для научно-исследовательских лабораторий, стремящихся включают редактирование генома в учебе.
Есть альтернативные способы трансфекции, в том числе nucleofection 43, чтобы создать генные отредактированы HPSC линии; Однако электропорации было показано, быть последовательным и экономически эффективным 4,5,25. Nucleofection может быть использован непосредственно трансфекции Cas9-Гид РНК рибонуклеопротеидные комплексы в ядро, увеличивая эффективность ап SSNд верность 44. Растущая hPSCs на MEFs это надежный и недорогой способ поддержания hPSCs в плюрипотентных государства без чрезмерного дифференциации. Кроме того, это позволяет для легкой изоляции генетически идентичных колоний. В качестве альтернативы, можно культуры hPSCs без MEFs, однако эти условия культивирования может быть более дорогим, чем культур, основанных подачи. Кроме того, весь процесс является масштабируемым, что позволяет для выделения очень редких событий редактирования или генерации многих различных клеточных линий в параллельных экспериментах редактирования.
Протокол, описанный здесь, является надежной; Однако есть несколько ключевых шагов, которые влияют на эффективность, с которой правильно редактировалось клонов могут быть получены. Наиболее важным компонентом этого метода является имеющих высокие MEFs качества и резистентных MEFs DR4. Выживание отдельных hPSCs является неопределенным, и низкого качества МЭФ будет препятствовать изоляции недифференцированных линий HPSC. Во-вторых, использование Y-27632 такжеКлюч к выживанию позволяют одной клетки без генерации селективное давление, клетки с аномальным кариотипом в 45. В-третьих, выбирая хорошо расположенные колонии обеспечивает генетическую однородность полученных клеточных линий. Наконец, важно, чтобы подготовить стеклянные пипетки так, чтобы отверстие достаточно мал, чтобы разорвать колонии на множество мелких частей, гарантируя, что несколько колоний будет расти в новой скважины. Это позволяет комплектование хорошо расположенных субклонами для реплики пластины, чтобы в культуре, оставляя исходный тарелку изолированных колоний для генотипирования. Сложная часть в этом протоколе является руководство вытягивания стеклянных пипеток; это должно быть осуществлено заранее. Следует отметить, что существует несколько методик клона сбора, которые не требуют стеклянной пипетки. Экспериментаторы рекомендуется, чтобы найти тот, который лучше всего подходит для них.
Есть ограничения к этому протоколу, который можно преодолеть с помощью простых изменений. Эксперимент предназначен для выводаолько нарушить локус интерес, без ремонта или один, чья ремонт шаблон не содержит кассету выбора, необходимо использовать другой метод обогащения для клеток, которые были отредактированы. Следует отметить, что число колоний, которые должны быть выбраны, чтобы найти позитивный клон значительно увеличивает в отсутствие селекции. Одна из стратегий для повышения эффективности заключается в совместном трансфекции неинтегрирующих плазмиду, которая экспрессирует флуоресцентный белок. После позволяя клеткам восстановиться в течение двух дней, клетки-мишени могут быть отсортированы по положительной флуоресценции с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток и пересевали 29. Этот процесс обогащает клеток, которые были трансфицированы были плазмидами посредством электропорации, и тем самым увеличивает вероятность одновременной случае редактирования в клетке.
Методы, описанные здесь, могут быть распространены на несколько направляющих использовать РНК, чтобы одновременно нацелены нескольких локусов 14,46,47. Многие протоколы были созданы, чтобы дифференцировать hPSCsв различных типах клеток, позволяя различные генетические манипуляции в типах клеток, представляющих интерес 30. В целом, мы продемонстрировали потенциал для эффективного редактирования генома в hPSCs независимо от SSN выбора. Мы полагаем, что эта методика может быть адаптирована для создания изогенных линий HPSC, которые были гена-отредактированные в любое геномного локуса.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Brain Research Foundation семян Грант (BRFSG-2014-02) к Хелен Bateup. Дирк Hockemeyer является Нью ученый в старения Эллисона Медицинский фонд и поддерживается Гленн Фонда, а также в The Shurl и Кей Курчи фонда. DH также поддерживается NIH грант 1R01CA196884-01.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |