Summary
Her gir vi en reproduserbar metode for å undersøke voksen neurogenesis bruker en neurosfære analyse avledet fra hele hjernen eller fra enten telencephalic, tectal eller lillehjernen regioner av den voksne sebrafisk hjernen. I tillegg beskriver vi fremgangsmåten for å manipulere genekspresjon i sebrafisk neurosfærer.
Introduction
Pattedyr nevrale stamceller (NSC) er blitt karakterisert in vitro ved deres evne til å vokse i frittflytende kulturer som klynger av delende celler betegnet neurosfærer 1. I nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF), NSCs dele enten symmetrisk for å generere selv-fornyende NSCs, eller asymmetrisk for å generere to forskjellige datterceller, det vil si., En differensierende stamceller og en ny NSC. Neurosfære kulturer er derfor en blanding av nervestammen / stamceller og mer differensierte neuralceller 2-4 NSCs kan imidlertid skilles fra andre neurosfære celletyper ved to spesifikke egenskaper. De viser langtidsselvfornyelse i fritt flytende kulturer og de kan differensiere til alle nervecelle linjene (dvs. neuroner, astrocytter og oligodendrocytter) etter seponering av vekstfaktorer og adhesjon til ekstracellulære matrise underlag. i mammals, neurosfærene kultursystemet var det første system anvendes for å demonstrere nærværet av NSCs i den voksne hjernen in vitro og er fortsatt den mest brukte verktøy for å analysere proliferasjon, selvfornyelse kapasitet og multipotency av nevrale stamceller og forløperceller. Derfor, selv om kule dannende analyser lider av noen ulemper og begrensninger 4, er denne kulturen systemet verdifullt for å vurdere potensialet for en celle til å oppføre seg som en stamcelle når fjernet fra sin in vivo nisje 4 og har vært medvirkende til å identifisere viktige regulatorer av NSC selvfornyelse og celle skjebne besluttsomhet 5-7.
I motsetning til pattedyr som har begrenset voksen neurogenesis, sebrafisk konstitutivt produsere nye nerveceller langs hele hjernen akse gjennom hele sitt liv. Sebrafisk voksne hjernen viser flere nevrogene nisjer husing nevrale stamceller / stamceller gjør sebrafisk en kraftig modellorganisme for å forstå than stamcelle aktivitet i hjernen, så vel som de molekylære programmer som kreves for sentralnervesystemet regenerering. I løpet av de siste 17 årene, flere forskningsgrupper utviklet metoder for å isolere og dyrking sebrafisk nerveceller 8,9. Disse studiene var rettet mot å produsere embryonale nevronale og gliaceller in vitro, men ikke på å opprettholde NSCs og undersøke deres egenskaper. Selv Neurosfærene har blitt generert i den voksne Apteronotus leptorhynchus (Brown Ghost Knifefish) 10, en neurosfære dannende analyse i sebrafisk gjensto å bli etablert.
Her beskriver vi en neurosfære dannende analyse for å demonstrere hvilken rolle MIR-107 i løpet av sebrafisk nevrogenese 11. Protokollen gjør det mulig: 1) innsamling av voksne nevrale stilk / stamceller enten fra sebrafisk hele hjernen eller fra flere dissekert områder av hjernen som telencephalon den Tectum, og lillehjernen; 2) generering av flytende og selvfornyende Neurosfærene fra voksne nevrale stilk / stamceller; 3) den ned- og opp-regulering av ekspresjonen av gener eller små ikke-kodende RNA 11 i neurosfærer, for å undersøke deres roller i proliferasjon og differensiering av nevrale stilk / stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk av WT CF belastningen ble reist og vedlikeholdes i henhold til protokoller godkjent av Yale University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC protokollen antall 2012-11473). Alle forsøkene bør først bli godkjent av alle relevante statlige og institusjonelle etikk regulerer organer om bruk av dyr til forskningsformål.
1. Forberedelser
- Forbered 10 ml disseksjon medium, legge 200 mL av 100x penicillin-streptomycin inn 9,8 ml DMEM / F12.
- Forbered L-Cysteine løsning: 10 ml vann til vev kultur, legge til 120 mg av L-cystein. Oppbevar L-cystein-løsning ved 4 ° C i opptil 2 uker, eller i alikvoter ved -20 ° C i opp til ett år.
- Fremstille DNase I-løsningen: til 1 ml vann i vevskultur, tilsett 10 mg DNase I. Oppbevar DNase I-løsningen ved 4 ° C i opp til 2 måneder.
- Forbered papain løsning: å forberede papain solution, tilsett 100 ul papain (ca. 140 enheter), 100 ul DNase I (1%) og 200 ul L-cystein (12 mg / ml) i 5 ml DMEM / F12. Fersk forberede papain løsning hver gang, og sterilisere med en 0,22 mikrometer porestørrelse filter før bruk.
- Forbered vaskeløsning: å forberede 100 ml vaskeløsning, tilsett 650 mL glukose 45%, 500 mL HEPES 1 M og 5 ml FBS inn 93,85 ml DPBS 1x. Sterilvaskeløsningen med et 0,22 um porestørrelse filter før bruk. Oppbevar vaskeløsning ved 4 ° C i opp til 2 måneder.
- Fremstille insulin løsning: for å fremstille 2 ml insulinløsning, tilsett 25 ul dråpe av 10 N NaOH og 100 mg insulin i 2 ml vann for vevskultur.
- Forbered EGF og FGF løsninger: Løs opp begge mitogener i DMEM / F12 på 100 mikrogram / ml konsentrasjon. Lagre som 10 pl prøver ved -20 ° C.
- Forbered B-27 og N-2 media: lagre B-27 og N-2 tilskudd ved -20 ° C som 500 mikroliter og 1 ml porsjoner, respectivEly.
- Fremstille Z-differensiering tilstand medium: for å fremstille 100 ml Z-differensiering tilstand medium, tilsett 40 ul insulin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 ml N-2, 650 ul glukose 45% og 1 ml av 100 x penicillin-streptomycin til 97,81 ml DMEM / F12. Steriliser Z-differensiering tilstand medium med en 0,22 um porestørrelse filter før bruk. Oppbevar Z-differensiering tilstand medium ved 4 ° C i opptil en uke.
- Fremstille Z-tilstand medium: for å fremstille 50 ml Z-tilstand media, tilsett 10 ul av EGF og 10 ul av FGF i 50 ml steril Z-differensiering tilstand medium (20 ng / ml). Oppbevar Z-tilstand medium ved 4 ° C i opptil en uke.
- Fremstille beleggende løsning for differensiering kultur: i 5 ml ekstracellulær beleggsløsning, tilsett 100 ul av den ekstracellulære matriks oppløsningen inn i 4,9 ml DMEM / F12 (f.eks Matrigel.). Tine ekstracellulære matriks-løsning ved 4 ° C på is. Når tint, holde ved 4 ° C for up til 2 uker.
2. Disseksjon av Adult Sebrafisk Brain
- Forbered en disseksjon seng ved å fylle en 100 mm x 15 mm petriskål med gel isposer. Deretter plasserer lokket på petriskålen og inkuberes ved -20 ° C inntil gel fryser. På toppen av lokket sted en firkant av ren filterpapir og pakk både filterpapiret og petriskål med plastfolie.
- Rengjør og steriliser alle mikrodisseksjon instrumenter etter 70% etanol eller varme før hver bruk. Legg alle steriliserte disseksjon instrumenter nær dissekere mikroskop, og rett før dødshjelp, plasser disseksjon seng under mikroskop med optisk fiber belysning.
- Samle to voksne sebrafisk for en hel hjerne neurosfære forberedelse; og 3 til 4 sebrafisk for å generere Neurosfærene fra dissekert hjerneregioner.
- Avlive voksen sebrafisk (8-12 måneder gamle) ved hjelp av en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. Deretter dyppe fisken i 75% etanol i 5-10 sek og raskt sted i disseksjon seng etterfulgt av halshugging på nivået av gjellene ved hjelp av en kirurgisk kniv.
- For å avlive dyr, administrere en overdose (300 mg / L) av Tricaine metansulfonat til dyrets hjerteslag gradvis bremser ned og sirkulasjon stopper, deretter dyppe i isvann.
- Snu hodet ryggsiden ned, og bruke saks lage en langsgående kutt fra cut side til munnen. Ved hjelp av pinsett eksponere undersiden av hodeskallen og fjerne all omkringliggende vev. Skjær sideveggene i skallen fra begynnelsen av ryggmargen mot Tectum.
- Ved hjelp av saks, kutte og fjerne de optiske nerver og deretter fjerne begge sider av den laterale delen av hodet på nivå med den Tectum. Snu hodet ventral siden opp. Bruk pinsett, skrelle av resten av den mest apikale delen av skallen.
- Overfør hjernen sammen med den resterende del av hodeskallen til en ny tallerken with disseksjon medium (1,1). Rengjør hjernevev i disseksjon medium med micro kniven plast håndtak, holder alle strukturer i hjernen intakt.
- Fra dette punktet, fortsetter protokollen bruker hele sebrafisk hjernen.
- Alternativt tilpasse denne protokollen til bestemte områder av hjernen til å generere Neurosfærene fra hele sebrafisk hjernen eller fra telencephalon, Tectum / diencephalon eller lillehjernen dissekert med en frisk skalpell. Bruk en neural bestemt fluorescerende sebrafisk nevrale transgen linje for å dissekere hjernen regionen av interesse i henhold til figur 3 og referere 11.
3. Enkelt celledissosiasjon of Adult Brain
- Utføre alle etterfølgende arbeid i et biologisk sikkerhetskabinett. Overfør hjernevevet inn i et 1,5 ml rør inneholdende 800 ul av disseksjon medium (fremstilt i trinn 1.1). Fjern disseksjon medium ved pipettering, uten å berøre hjernevev.
- Legg 500 mL av papain oppløsning (trinn 1.4) og fordøye hjernevevet ved 37 ° C i 10 min. Ikke inkuber lenger enn 15 minutter som det kunne redusere celle levedyktighet.
- Etter inkubering, overføres i hjernevevet med 500 ul av papain oppløsningen inn i et 15 ml konisk rør ved hjelp av en 1000 ul pipettespiss snitt på ~ 0,25 inches fra bunnen. Forsiktig dissosiere hjernevevet ved sakte å pipettere opp og ned 10 ganger med den samme spiss. Ikke pipettér opp og ned mer enn 15 ganger, og genererer ikke luftbobler under dette trinnet, som det kunne endre celle levedyktighet.
- Inkuber hjernevevet på nytt ved 37 ° C i 10 minutter etterfulgt av pipettering opp og ned 10-13 ganger med en ukuttet 1,000 mL vanlig spiss. Ikke pipettér opp og ned mer enn 15 ganger, for å unngå celledød.
- Stoppe den enzymatiske fordøyelse ved tilsetning av 2 ml vaskeløsning (trinn 1,5), sentrifuger og cellesuspensjonen ved 800 xg i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Nøye dekanter supernatant og resuspender pelleten i den gjenværende oppløsning ved å trykke røret kraftig med en finger og deretter ved å pipettere opp og ned med en 1000 mL vanlig spiss. Deretter tilsett 2 ml vaskeløsning.
- På dette stadium, sjekk under mikroskopet som en enkelt cellesuspensjon er blitt oppnådd. Sentrifuger cellesuspensjonen på nytt ved 800 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten og re-suspendere pelleten ved hjelp av 1 ml friskt medium Z-tilstand (trinn 1.10).
- Flekke celler ved hjelp av trypanblått 12 og telle levende celler ved hjelp av en hemocytometer ved å ekskludere blå døde celler. Fremstille en 24-brønns plate med 200 ul av cellesuspensjonen og 300 ul av frisk Z-tilstand medium i hver brønn. Frø-celler ved en tetthet på ~ 500 celler / mL. Opprettholde dyrkede celler i en inkubator ved 30 ° C i 5% CO2, ettersom sebrafisk hjerne-avledet neurosfærer ikke vokser godt ved 37 ° C.
4. generasjon Primær Neurosfærer </ P>
- Etter 1 dag in vitro (DiV1), observere enkel cellesuspensjon erholdt fra den voksne hele hjernen under mikroskopet og merke om avfall har samlet seg i sentrum av brønnen. Fjern forsiktig eventuelle rester ved å pipettere omtrent 100 ul av medium (mindre hvis mulig). Neste tilsett 100 mL av fersk Z-tilstand medium. Enkeltcellesuspensjoner bør observeres på dette tidspunktet (figur 2A DiV1).
- Etter 2 dager in vitro (DIV2), utvider de dyrkede celler. Ved hjelp av en 1000 ul pipette med spissen snitt, samle og overføre 250 ul av cellesuspensjonen fra hver brønn inn i en ny brønn. Tilsett 250 ul av frisk Z-tilstand medium i alle brønner. Før utvide de dyrkede celler, homogenisere suspensjonen meget forsiktig ved å pipettere opp og ned gjennom brønnen.
- Gjenta trinn 4.1 og 4.2 for følgende 4 dager in vitro (DiV4). En progressiv økning i størrelsen av neurosfærer bør være vilig i midten og kantene av brønnen ved DIV3 og DiV4 (figur 2B og C).
Merk: Primær Neurosfærene kan behandles for passasje eller differensiering for å vurdere multipotency. Alternativt kan de bli behandlet for nucleofection eller lipo-transfeksjon 11 for å karakterisere rollen til spesifikke gener under differensieringsprosessen.
5. aging av Primary Neurosfærer
- Fjerne 250 pl av vevskultur fra hver brønn og mekanisk dissosierer DiV4 neurosfærer med en 1 ml pipette. Ikke pipettér opp og ned for fort som luft bobledannelse kan økt celledød.
- Tell cellene med et hemocytometer og fordele 800 celler / mL i 250 ul av primær kultur supernatanten i hver brønn av en 24-brønns plate.
- Tilsett 250 ul Z-tilstand medium til hver brønn.
- Etter 2 dager in vitro (DIV2), utvider de dyrkede celler som rapportert i trinn 4.2 end 4.3.
6. Differensiering av Primary Neurosfærer
- Steriliser dekkglass ved nedsenking i 70% etanol i 10 min, deretter tørre dekkglass ved RT ved å plassere dem i hver brønn av en 12-brønns plate.
- Tilsett 300 ul av ekstracellulær beleggoppløsningen (trinn 1.11) ved midten av dekkglasset på en slik måte at den kan ekspandere i stor grad og dekker hele dekkglasset. Deretter inkuberes ved 37 ° C i 1 time (ved hjelp av den fuktede cellekulturinkubator).
- Fjern det ekstracellulære beleggoppløsning etter inkubering, og tørk dekkglasset i 2 timer ved 37 ° C.
- Fjerne 250 pl av vevskultur fra hver brønn. Mekanisk distansere alle DiV4 primære Neurosfærene per brønn med en 1 ml pipette (med bredere-end tip) ved pipettering opp og ned.
- Seed dissosierte neurosfærer cellesuspensjoner ved en celletetthet på 4 x 10 celler / ml 3 på tidligere fremstilte ekstracellulære matriks-belagte dekkglass (trinn 6,1 til 6.3) og holder i minst 30 min, ved 30 ° C i 5% CO2, inntil festet til substratet. Deretter fjernes kulturmediet og hurtig tilsett 1 ml forvarmet frisk Z-differensiering tilstand medium (trinn 1.9) før dyrking av cellene i 24 timer ved 30 ° C i 5% CO2.
- Annenhver dag, erstatte halvparten av Z-differensiering tilstand medium i den tiden av celle differensiering.
7. genmanipulering av Primary Neurosfærer
- Samle DiV3-4 primære neurosfærer (trinn 4.3) ved sentrifugering i 8 minutter ved 80 x g ved 4 ° C. Forbered liposom transfeksjon av kommersielle oligonucleoatides som previouly beskrevet 11 eller nucleo-transfeksjon av DNA plasmid vektorer.
- Resuspender pellet neurosfære ved en celletetthet på 4 x 10 3 celler / mL i 100 ul av en reaksjonsblanding (82 ul nucleofactor oppløsning og 18 ul av supplement).
- Bland neurosfærene opphengningspå med 5 mL av DNA plasmid vektorer av valg (plasmid aksjer på 1 mikrogram / mikroliter). Overfør neurosfærene / DNA blandingen i en Nucleofector kyvette for nucleotransfection og velg Nucleofector program i henhold til produsentens instruksjoner gitt av Nucleofector kit.
- Umiddelbart etter nucleofection, legge til et volum på 500 ml forvarmet Z-tilstand media (1,10) til cellene og plate transfekterte neurosfærene for å studere deres cellefornyelse og / eller differensiering egenskaper, som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelt Scheme av Adult Sebrafisk neurosfærer Culture
Her beskriver vi alle trinnene i protokollen for en neurosfære dannende analyse utført fra den voksne sebrafisk hjernen. Først har voksne nevrale stilk / stamceller er hentet enten fra sebrafisk hele hjernen eller fra flere dissekert områder av hjernen som telencephalon, den Tectum og lillehjernen (figur 1A-C). Enkelt celle suspensjon av voksne nevrale stilk / stamceller har deretter blitt brukt til å generere flytende og selvfornyende Neurosfærene (Tall 1D, E). Endelig har neurosfærer vært medvirkende i å studere den ned- og opp-regulering av ekspresjonen av gener eller små ikke-kodende RNA 11 for å undersøke deres roller i proliferasjon og differensiering av nevrale sebrafisk stilk / stamceller.
Sebrafisk primære Neurosfærene kan fornye seg selv etter flere passasjer. For å generere Neurosfærene på Passage 1 og 2, trinn 05.01 til 05.04 ble gjentatt to ganger, i totalt 6-8 dager. Fra DiV2-4, størrelsen av neurosfærene økes opp til omkring 50 pm i diameter. Sekundære og tertiære neurosfærer ble også oppnådd etter passasjen 1 og 2, henholdsvis (figur 2D). På passasjen 3, sebrafisk neurosfærer var imidlertid ute av stand til å vokse opp ved det kritiske størrelse på 50 um diameter og mislyktes i å fornye seg selv, hvilket antyder at kulturen tilstand i stedet velger en pool av stammen / stamceller enn en ren populasjon av nevrale stamceller 4 .
neurosfære Differensiering
Primære, sekundære eller tertiære Neurosfærene avledet fra enten whole hjerne eller fra telencephalic, cerebellar og tectal område av voksne sebrafisk ble testet for deres differensierings potensialer. Mellom 1 og 3 dager in vitro i differensierings forhold (DiVd1-DiVd3), ble et monolag av adherente celler observert (figurene 3A, B). Som illustrert i figur 3C, ved DiVd4, aksonal lignende fremspring samt gliaceller var synlige og skilles ved immunhistokjemi eller genekspresjon analyser 11, vurdere det nevrale stamceller / progenitorceller hadde differensieres. Tilsvarende neuroner og gliaceller differensieres fra neuralstamceller / stamceller isolert fra forskjellige områder av hjernen (fig 3D, E).
Gene Expression Manipulasjon i Sebrafisk Neurosfærer
Vi har testet den rollen MIR-107 på nevronale og gliaceller differensiering av hele sebrafisk hjerne-de skriver seg nevrale stilk / stamceller (figur 4). Vi viste at nedregulering av MIR-107 ved hjelp av anti-MIR-107 ikke påvirker neurosfære formasjon, men endrede neuronal differensiering, som angitt av den unormale vekst av aksonal-prosesser (figurene 4A, B). RT-PCR-genekspresjon-analyser bekreftet at inhibering av MIR-107 fører til en økt ekspresjon av både neuroblast markør Neurogenin-1 (NGN-1) og axon-spesifikke molekyler, såsom Kart-2 og α-tubulin, uten å påvirke glial cellemarkør uttrykket (S-100, GFAP, Olig2) (figur 4C). Følgelig gevinsten av MIR-107 uttrykk ved MIR-107-ligne induserte en nedgang på neuroblast- og axon-spesifikk markør uttrykk (figur 4D), vurdere det, in vitro, MIR-107 fungerer som en neuronal differensiering regulator i løpet av sebrafisk neurogenesis 11.
/53617/53617fig1.jpg "/>
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av fremgangsmåte trinn Prosedyrene og tilhørende tids omfatte disseksjon av enten hele hjernen eller telencephalic, tectal og lillehjernen regioner av den voksne sebrafisk hjerne (A, B), oppnåelse av en enkelt cellesuspensjon (C ), generering av flytende neurosfærer (D) og differensieringen av neurosfærer (E).
Figur 2: Forming Sebrafisk Brain-derived Neurosfærer. (A - C) Representative fasekontrastbilder av hele hjerne-avledet primære flytende neurosfærer observert på dag 1 (DiV1, A), dag 3 (DIV3, B) og dag 4 (DiV4, C). (D) figur som representerer det relative antall neurospheres på Passages 1 og 2 i forhold til neurosfærer nummeret på Passage 0. Etter Passage to, neurosfærer formasjonen ble drastisk redusert. Skala: 25 mikrometer.
Fig. 3: Differensiering av Sebrafisk hjerne-avledet Neurosfærer (A - C, E) fasekontrastbilder av hele hjerne-avledet neurosfærer dyrket i Z-differensieringsmedium i løpet av en (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) og 4 (C og D, DiVd4) dager. (E) Dorsal utsikt over hele hjernen til en 12 måneder gammel Tg (GFAP: DsRed) sebrafisk. Den telencephalon (Tel), Tectum (TEC) og lillehjernen (Cer) ble dissekert og samlet som vist. (D) Bilder av DiVd4 Neurosfærene avledet fra Tectum, telencephalon og cerebellum på Passage 0 (P0), 1 (P1) Og 2 (P2). Skala: 25 mikrometer.
Figur 4:. Analyse av Neurosfærer Dannet etter MiR107 Manipulation (A) Phase kontrast viser Div4d Neurosfærene behandlet på Div4 med de indikerte oligonukleotider. Svarte bokser i toppfeltene indikerer området forstørret i bunnplatene. (B) Top figurene representerer kvantifisering av antall neurosfærer dannet med eller uten, miR107. Neurosfærer er subgrouped av deres størrelse (20-30 um, 31-50 um,> 51 um i diameter). Bottom diagrammet viser kvantifisering av aksonal anslag fra Neurosfærene behandlet og sub gruppert som ovenfor. (C, D) QRT-PCR uttrykk analyse av indikert gener ved Div4d Neurosfærene tidligere er behandlet med angitt oligonukleotider på Div4. Data representerergjennomsnitt ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: krafse. Skala: 25 mikrometer.
| Problem | mulig årsak | Løsning |
| Gjenoppretting av altfor mange døde celler | Forsinkelse i å forberede hjernen før enzymatisk behandling | Kontroller at disseksjon satt opp og media er klar før ofre fisken (også sjekke sterilitet, temperatur) |
| Streng papain behandling | Mekanisk dissosiasjon må være delikat nok til å generere en direkte enkeltcellesuspensjon, men sterk nok til å unngå å etterlate for mange klumper av vev. Respekter de anbefalte tider og temperaturer for ruge / sentrifugeringsperioder | |
| Neurosfærer vises ikke eller vokser dårlig | feil temperatur | Kontroller at inkubator innstilt på 30 ° C er å gi correct temperatur. |
| Økende kuler fjernes med rusk | For hver brønn, har aspirasjon av avfall som skal utføres vel på toppen av mediet. Unngå å inngå mediet med pipette | |
| Integriteten til noen reagenser (B27 supplement, EGF, FGF) er svekket | Dette integritet utgjør begrensende faktorer i cellevekst. Sjekk batchnummer, og måten prøvene ble bevart. Unngå tine / frys sykluser av alle samplet reagens brukes på kultur | |
| Tilstedeværelse av enkeltceller | Modus for overføring / utvidelse av neurosfærer er for tøffe | Dette trinnet er en utvidelse / fortynning trinnet fordi altfor mange områder er dannet i brønnen. Unngå harde sfære samling under overføring for å hindre neurosfære dissosiasjon i enkeltceller |
| Fravær av celler på matrigel | Matrigel var ikke ordentlig tint / utvannet | Matrigel fra -20 ° C trenger minst 30 minutter ved 4 ° C for å smelte og forblir viskøs Pipetter forsiktig |
| Ingen vedheft på matrigel | Volumet av cellesuspensjonen må være liten nok til å tillate cellen avsetning på matrigel belegge | |
| Gir mer tid for celleavsetning (opp til 2 timer når større mengder anvendes) | ||
| Fersk differensiering medium for kaldt | Ved bytte av celle-feste medium, må differensiering medium for å bli varmet opp ved 30 ° C for å forhindre termisk sjokk på de deponerte cellene | |
| dårlig nucleofection | døde celler | Pass på at du ikke genererer luftbobler mens du utfører nucleofection. Bruk høy kvalitet DNA vektorer ved hjelp av Maxi-preparater. Minst 1-2 timer etter nucleofection, erstatte kulturmedium ved å bruke enten fersk Z-differensiering tilstand medium eller Z-tilstand medium. |
| Få positive Neurosfærene | Neurosfærer av varierende størrelse kan føre til dårlig nucleofection. Bruke Neurosfærene på DIV2 og DIV3 er ideelle for nucleofection. Tettheten av cellene bør ikke overskride 4 x 10 3 neurosfærer ml -1 i en 100 ml reaksjons. |
Tabell 1: Feilsøking Råd Oppføring, for hvert trinn i protokollen, Mulige problemer og løsninger for å overvinne dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedformålet med denne protokollen er å isolere og kultur voksne sebrafisk hjerne-avledet Neurosfærene for å studere cellulære og molekylære funksjoner i nevrale stilk / stamceller. Her rapporterer vi hvordan du velger multipotente nerveceller og generere de tre nevrale celletyper, dvs. astrocytter, nevroner og oligodendrocytter, fra den voksne sebrafisk hjernen. Protokollen er av stor betydning ettersom en reproduserbar neurosfære dannende analysen ikke hadde blitt etablert i sebrafisk så langt.
Noen få kritiske trinn i protokollen må respekteres og har vært recapitutaled i feilsøking råd (tabell 1). For det første forekommer celledød både under disseksjon av den voksne sebrafisk hjernen og enkelt cellesuspensjon prosedyre. For å begrense forlenge av celledød, er det viktig å bruke rene og skarpe redskaper samt å strengt respektere timing og temperatur på inkubasjon anbefalt i dagens proprotokollen. Dernest bør neurosfære kultur utføres med nylagde medier, og med en forsiktig pipetteringsteknikk. Tredje, celle tetthet anbefalinger bør følges for å oppnå pålitelig fornyelse eller differensiering av neurosfærer celler. Med dette i tankene, bør enhver fagmann i celle-kulturteknikker være i stand til å bruke protokollen og utføre isolasjon, kulturen og genmanipulering av voksne sebrafisk hjerne-avledet neurosfærer.
Sfæren dannende analyser i sebrafisk lider av de samme begrensninger som tidligere er beskrevet i pattedyrarter 4: 1) oppførselen til nevrale stilk / stamceller forandres etter deres isolering fra sitt naturlige hjerne nisje; 2) Neurosfærene er ikke en homogen befolkning på stamceller, men inkluderer stamceller, stamceller samt post-mitotiske differensierte celler. Det er dessuten verdt å merke seg at vår protokoll genererer aclonal neurosfære kulturer. Den celletetthet på kulturer eren kritisk parameter i sfæren dannende analyser fordi den bestemmer klonalitet, dvs. om kulturen er klonale, semi-klonale eller aclonal. Klonale forholdene tillater å nøyaktig karakterisere og kvantifisere de ulike bassenger av stilk og stamceller som finnes i kulturen. Vi har ikke vært i stand til å utføre celle klonalitet analyser så langt, og våre dyrkningsforholdene fortsatt trenger mer optimalisering før vi kan diskriminere nevrale stamceller fra andre stamcelle bassenger.
Sebrafisk neurosfære kulturer kan brukes for et stort spekter av eksperimenter. De lar genekspresjonsanalyser samt manipulering av genuttrykk under nevrogenese som illustrert ved vår studie MIR-107 funksjon i vevet spesifikk bestemmelse av nevrale celle skjebne (figur 4 og 11). Andre bruksområder er genom redigering strategier, for eksempel CRISPR / Cas9 system, for å teste rolle nevrale stilk / progenitor gener i neurogeNesis og hjernen reparasjon 13. Til slutt viser vår protokoll som sebrafisk neurosfærer kan være avledet fra forskjellige områder av hjernen åpner mulighet for å studere regionspesifikke funksjoner av nerveceller og gliaceller og for å utforske den cellulære og molekylære basis av nevral celle heterogenitet i forskjellige ventrikulære domener av sebrafisk hjernen 14 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J.
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
