Summary
在这里，我们提供一个可重复的方法，使用从整个脑或从任一端脑，顶盖或成年斑马鱼脑的小脑区域衍生的神经球测定以检查成人神经发生。此外，我们描述来操纵在斑马鱼神经球的基因表达的步骤。
Introduction
哺乳动物神经干细胞（NSCs）都被他们在自由浮动的文化成长为划分称为神经球1细胞群的能力，其特征体外 。在表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的存在下，神经干细胞分化或对称，产生自我更新的神经干细胞，或不对称，以产生两个不同的子细胞， 即 ，微分祖细胞和新颖NSC。因此，神经干文化是神经干/祖细胞多分化的神经细胞2-4的混合物的神经干细胞可以，但是，从其他神经干细胞类型由两个特定的属性区别：他们自由显示屏长期自我更新浮培养物，它们可以分化成以下的生长因子撤出和粘附到细胞外基质底物的所有神经细胞谱系（ 即 ，神经元，星形胶质细胞和少突胶质）。在mammALS的神经球培养系统是用来证明神经干细胞在成人大脑中存在的第一个体外系统和保持来分析增殖，自我更新能力和神经干细胞和祖细胞的多能的最常用的工具。因此，即使球形成测定法从一些缺点和局限性4苦，该培养系统，是从它的体内利基4中取出时，并一直工具在确定关键调节评估细胞的表现为干细胞的潜在有价值NSC的自我更新和细胞命运决定5-7。
相较于哺乳动物谁限制了成年神经，斑马鱼组成产生沿着整个生命全脑轴新的神经细胞。斑马鱼的成人脑显示多个神经源性龛窝藏神经干/祖细胞使斑马鱼强大的模式生物的的理解了他干在脑细胞活动，以及中枢神经系统的再生所需要的分子的程序。在过去的17年里，几个研究小组开发的方法进行分离和培养斑马鱼的神经细胞8,9。这些研究的目的是生产胚胎神经元和在体外神经胶质细胞，而不是在保持NSCs的并调查它们的属性。虽然神经球已在成年Apteronotus leptorhynchus（布朗鬼西刀鱼）10产生的，在斑马鱼神经球形成测定法仍有待建立。
这里，我们描述一个神经球形成测定法来证明斑马鱼神经11中的miR-107的作用。该协议使得：1）无论是从斑马鱼全脑或从几个解剖大脑区域，如端脑，所述顶盖和小脑成人神经干/祖细胞的收集; 2）FL的代浮动和成人神经干/祖细胞的自我更新的神经球; 3）向下和上调编码基因或小的非编码RNA 11在神经球，的表达为了研究它们在神经干/祖细胞的增殖和分化的作用。
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Protocol
野生 CF株斑马鱼根据由耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC协议号2012-11473）批准的方案提出并保持。所有实验应先通过所有相关的政府和机构伦理规范有关动物用于研究目的机构的批准。
1.准备
- 准备10毫升夹层介质中，加入200微升100X青链霉素成9.8毫升DMEM / F12的。
- 准备L-半胱氨酸溶液：10毫升水进行组织培养，添加120毫克的L-半胱氨酸。储存在4℃的L-半胱氨酸溶液长达2周，或在-20℃下长达1年等分试样。
- 准备DNA酶I溶液：1毫升水进行组织培养，加入10毫克的DNase I.保存在4℃的DNA酶I溶液长达2个月。
- 准备好木瓜蛋白酶溶液：准备木瓜蛋白酶SOLUT离子，添加100μl的木瓜蛋白酶（约140单位），将100μlDNA酶I（1％）和200微升L-半胱氨酸（12毫克/毫升）到5毫升的DMEM / F12的。刚准备木瓜蛋白酶溶液每次和在使用前用0.22微米孔径过滤消毒。
- 制备洗涤溶液：以制备100ml的洗涤溶液中，添加650微升葡萄糖45％，500微升的HEPES的1M和5ml FBS的成93.85毫升DPBS 1倍。消毒在使用前用0.22微米孔径的过滤器的洗涤液。储存在4℃下长达2个月的洗涤溶液。
- 制备胰岛素溶液：以制备加入2ml胰岛素溶液，加10的1N NaOH和100mg胰岛素的25微升落入2ml水进行组织培养。
- 制备EGF和FGF的解决方案：在100微克/毫升浓度溶解在DMEM / F12两者有丝分裂原。存储为在-20℃下10微升等分试样。
- 在-20℃下为500微升和1ml等份，respectiv存储器B-27和N-2补充剂：制备B-27和N-2个媒体伊利。
- 制备的Z-分化条件培养基：向制备100毫升的Z-分化条件培养基中，添加40微升的胰岛素（50毫克/毫升），加入500μl的B-27，将1ml N-2，650微升葡萄糖45％和1毫升100×青链霉素成97.81毫升DMEM / F12的。消毒使用前先用0.22微米孔径过滤器Z-分化状态中。储存在4℃的Z分化条件培养基长达1周。
- 准备Z-条件培养基：准备50毫升Z-条件介质，加入EGF的10微升和10微升的FGF到50ml无菌Z-分化条件介质（20毫微克/毫升）。储存在4℃的Z条件培养基长达1周。
- 准备涂布液分化培养：对5毫升外涂料溶液，加100微升细胞外基质溶液加入到4.9毫升DMEM / F12（ 如基质胶）。在冰上4℃解冻的细胞外基质的解决方案。一旦解冻，保持在4℃下üp来2周。
2.成年斑马鱼脑解剖
- 准备通过填写100毫米×15毫米的培养皿凝胶冰袋床的夹层。然后放置在培养皿的盖子，并在-20℃下孵育直至凝胶冻结。在盖处的顶部干净滤纸的平方和包裹都滤纸和陪替氏培养皿用塑料薄膜。
- 清洁和每次使用前消毒用70％乙醇或热的所有显微切割仪器。将所有消毒清扫工具解剖显微镜附近，安乐死前右方，放置解剖床上光纤照明显微镜下。
- 收集2的全脑神经球准备成年斑马鱼;和3至4斑马鱼产生从解剖脑区的神经球。
- 使用安乐死的机构动物护理和使用委员会批准的方案成年斑马鱼（8-12个月）。接下来，浸泡的鱼7为5-10秒5％的乙醇和快速地放置在解剖床随后断头在使用手术刀鳃的水平。
- 安乐死的动物，施用过量三卡因甲磺酸（300毫克/升），直到动物的心脏搏动逐渐减慢和循环停止，然后浸入冰水。
- 转动头部背面向下，并用剪刀从做切口侧到嘴的纵向切割。使用镊子暴露颅底并删除所有邻近组织。从朝向顶盖脊髓的开头削减头骨的侧壁。
- 使用剪刀，切割并除去视神经，然后在顶盖的水平除去头骨的最外侧的部分的两侧上。转动头部腹面朝上。使用镊子，剥离头骨的最前端部的其余部分。
- 与颅骨剩余部分转移大脑一起到一个新菜的WiTH的夹层介质（1.1）。使用微刀塑料处理干净的夹层介质脑组织，保持所有大脑结构完好。
- 从这一点来说，使用全斑马鱼脑继续的协议。
- 或者适应此协议特定脑区产生从整个斑马鱼大脑或从一个新鲜的手术刀解剖端脑，顶盖/间脑小脑或神经球。使用神经特异性荧光斑马鱼神经转基因系解剖根据感兴趣的大脑区域图3和附图11。
成人脑3.单细胞分离
- 在生物安全柜进行所有的后续工作。转移的脑组织成含有800微升夹层介质的1.5ml试管（在步骤1.1中制备）。通过移液除去夹层介质，而不触及脑组织。
- 加入500微升的木瓜蛋白酶溶液（步骤1.4）和消化在37℃下脑组织10分钟。不要孵育时间超过15分钟，因为它可以降低细胞活力。
- 温育后，用1000微升吸管尖切从底部〜0.25英寸转移用500μl的木瓜蛋白酶溶液的脑组织入15ml锥形管中。通过用相同的尖端缓慢地上下吹打10倍轻轻解离脑组织。不吸管上下15倍以上，并在此步骤中不产生气泡，因为它可能改变细胞生存力。
- 在37℃下再孵育脑组织10分钟，随后吹吸，并使用未切割1000微升定期尖端向下10-13倍。不吸管上下15倍以上，以避免细胞死亡。
- 通过加入2ml洗涤液（步骤1.5），并离心细胞悬浮液以800×g离心，在室温（RT）下5分钟，停止酶消化。小心倒出标upernatant并通过与1000微升定期尖大力用手指，然后轻敲管通过上下吹打悬浮在剩余溶液中的沉淀。接着，加入2毫升的洗涤溶液。
- 在这个阶段，检查已经获得单细胞悬浮液，在显微镜下。在800 xg离心再次离心细胞悬浮液在室温下5分钟。去除上清，重新悬浮，用1毫升新鲜Z-条件培养基（步骤1.10）的颗粒。
- 染色细胞通过使用台盼蓝12和使用血球排除蓝死细胞计数的活细胞。制备与细胞悬浮液的200微升和300微升新鲜的Z-条件培养基在每个孔24孔板中。种子细胞以〜500个细胞/微升的密度。保持在培养箱中培养细胞在30℃下在5％CO 2中 ，由于斑马鱼脑源性神经球不在37℃下生长良好。
4.原代神经球</ P>
- 后第1天的体外 （DIV1），观察从显微镜下的成人全脑得到的单细胞悬浮液，并注意碎片是否已经在井的中心积累。仔细吹打约100微升介质的碎屑（少如果可能的话）。然后加入100微升新鲜Z-条件培养基。单细胞悬浮液应在此时（ 图2A DIV1）被观察到。
- 经过体外培养 2天（DIV2），扩大培养的细胞。使用带尖砍1000微升吸管，收集并从每孔转移250微升细胞悬液到一个新的好。加入250微升新鲜Z-条件培养基至所有孔。扩大培养细胞之前，在整个井轻轻地均质化悬浮液通过上下抽吸。
- 重复步骤体外以下4天（DIV4）4.1和4.2。在神经球的大小逐步增加应该是六sible在中心和阱的边缘在DIV3和DIV4（ 图2B和C）。
注：主神经球可通行或分化评估的多能性进行处理。可替代地，他们可以为核转染或脂转染11被加工在分化过程来表征特定基因的作用。
5.传代初级神经球
- 从每个孔中取出250μl的组织培养和机械解离DIV4神经球以1毫升吸管。不要吸管上下过快空气形成气泡可以增加细胞死亡。
- 计数与血球细胞和250μl的主培养物上清液的分发800细胞/微升到24孔板的每个孔中。
- 加入250微升的Z-条件培养基的各孔中。
- 经过体外培养 2天（DIV2），扩大培养的细胞在步骤4.2报告ð4.3。
6.主要分化的神经球
- 通过浸没消毒盖玻片在70％乙醇10分钟，然后干燥盖玻片在RT将它们放置在一个12孔板的每个孔中。
- 添加300μl的在玻璃盖的中心外涂布液（步骤1.11）以这样的方式，它可以广泛地扩展，并覆盖整个玻璃盖。然后，孵育在37℃1小时（使用加湿细胞培养孵育器）。
- 除去温育后的外涂层溶液，并在37℃下干燥该玻璃盖2小时。
- 从每个孔中取出250微升的组织文化。机械分离每孔吹打上下所有DIV4主要神经球用1毫升吸管（与更广泛的高端尖）。
- 种子在4×10 3个细胞/ ml在预先制备的外涂覆基质盖玻片的细胞密度（步骤6.1-6解离神经球细胞悬浮液。3）和在5％CO 2保持至少30分钟，在30℃下，直到附着到衬底。然后，除去培养基，并在5％CO 2在30℃下培养细胞24小时前迅速加入1ml预热新鲜的Z-分化条 件培养基（步骤1.9）的。
- 每隔两天，在细胞分化的时间更换一半的Z-分化的条件培养基。
7.初级神经球的基因操作
- 通过在4℃下在80×g下离心8分钟收集DiV3-4初级神经球（步骤4.3）。准备用于商业oligonucleoatides的脂质体转染如previouly描述11或DNA质粒载体的细胞核-转染。
- 在4×10 3个细胞/微升的在100μl的反应混合物（82微升nucleofactor溶液和18微升补充的）的细胞密度重悬神经球丸。
- 混合神经球suspensi与5微升（1微克/微升质粒股票）所选择的DNA质粒载体。神经球/ DNA混合物转移到一个nucleofector反应杯为nucleotransfection和根据由nucleofector试剂盒中提供的制造商的说明选择nucleofector程序。
- 核转染后，立即加入500ml的预热的Z-条件培养基（1.10）的体积至细胞和板转染的神经球为研究其细胞更新和/或分化特性，如上所述。
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Representative Results
在成年斑马鱼神经球文化的总体方案
在这里，我们描述了从成年斑马鱼脑进行神经球形成测定法的协议的所有步骤。首先，成人神经干/祖细胞已经或者从斑马鱼全脑或从几个解剖大脑区域，如端脑，所述顶盖和小脑（ 图1A-C）的收集。成人神经干/祖细胞的单细胞悬浮液已然后被用来产生浮动和自我更新的神经球（ 图1D，E）。最后，神经球人为了一直在研究向下和上调编码基因或小非编码RNA 11的表达的工具，以研究它们的增殖和斑马鱼的神经干/祖细胞的分化的作用。
斑马鱼的神经球主要可自我更新以下几个段落。以产生在通道1和2神经球，步骤重复5.1-5.4两次，共6-8天。从DiV2-4，神经球的大小在直径增大到约50微米。二级和三级神经球通道1和2，分别为（ 图2D）后也获得。 3代，斑马鱼的神经球均但是未能在直径为50微米的临界尺寸长大，没能自我更新，这表明我们的文化条件，而选择干/祖细胞比神经干细胞4的纯人口池。
神经球分化
无论从whol衍生一级，二级或三级神经球成年斑马鱼电子大脑或从端脑，小脑和顶盖面积其分化潜能进行了测试。之间在分化条 件（DiVd1-DiVd3） 体外 1和3天，贴壁细胞单层观察（ 图3A，B）。 如图3C所示，在DiVd4，像凸起以及神经胶质细胞轴突是可见的和可区分通过免疫组织学或基因表达分析11，评估神经干/祖细胞已分化。同样地，神经元和神经胶质细胞来自不同脑领土（ 图3D，E）的分离的神经干/祖细胞分化。
斑马鱼神经球的基因表达操纵
我们已经测试了整个斑马鱼大脑德的神经元和神经胶质分化的miR-107的作用源性神经干/祖细胞（ 图4）。我们发现，miR-107的抗的miR-107的下调并未影响神经球的形成而改变的神经元分化，由轴突过程（ 图4A，B）的异常生长所指示的。 RT-PCR的基因表达分析证实了miR-107的抑制导致两者成神经细胞的标记神经元素-1（NGN-1）和特定的轴突分子，如图2，α微管蛋白的表达增加，而不会影响神经胶质细胞标志物的表达（S-100，GFAP，Olig2的）（ 图4C）。因此，的miR-107表达的由增益的miR-107模拟物诱导特异性轴突neuroblast-和标志物表达（ 图4D）的减小，评估， 在体外中，miR-107用作神经元分化调节斑马鱼神经发生过程中11。
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图1：表示协议的步骤的示意图的程序和相关的定时包括要么全脑或端脑，顶盖和成年斑马鱼脑的小脑区域的解剖（A，B），一个单一的细胞悬浮液的获得方法（℃ ），浮神经球（D）和神经球的分化（E）的产生。
图2：斑马鱼形成脑源性神经球 。 （A - C）全脑源性初级神经球漂浮代表相衬图像1（DIV1，A）观察日，第3天（DIV3，B）和第4天（DIV4，C）。代表东北的相对数（D）图在传代1和2 urospheres相比神经球数在通道0通道2之后，神经球的形成是急剧下降。比例尺：25微米。
图3：斑马鱼脑源性神经球的分化 （A - C，E）在1在Z分化培养基培养全脑源性神经球的相衬图像（A，DiVd1），3（B，DiVd3）和4 （C和D，DiVd4）天。斑马鱼：12个月大的Tg（红色荧光蛋白GFAP）的全脑（E）背视图。端脑（电话），顶盖（TEC）和小脑（CER）进行了解剖，并收集，如图所示。 （D）从顶盖，端脑和小脑在0代（P0）衍生DiVd4神经球，1（P1的图像）和2（P2）。比例尺：25微米。
图4：形成以下MiR107操纵神经球分析 （ 一 ）第一阶段对比度的图像显示在DIV4与指示的寡核苷酸处理Div4d神经球。在顶部面板的黑盒子表明在底部面板放大的区域。 （B）的顶部图表示具有或不，miR107形成的神经球的数量的量化。神经球是由它们的大小（20-30微米，31-50微米，> 51微米直径）subgrouped。底部图表示从处理和子如上述分组神经球的轴突突起的定量。 （C，D）的qRT-PCR表达表明基因通过预先与DIV4指示寡核苷酸处理Div4d神经球分析 。数据代表的平均±SEM，* P <0.05，N = 3 SCR：争夺。比例尺：25微米。
| 问题 | 可能的原因 | 解 |
| 过多的死细胞恢复 | 在酶处理前准备大脑延时 | 确保夹层设置和媒体都牺牲鱼前准备好（同时检查无菌，温度） |
| 严格木瓜蛋白酶处理 | 机械解离需要足够微妙生成一个活单细胞悬浮液，但足够坚固，以避免留下组织过多团块。尊重孵化/离心周期建议时间和温度 | |
| 神经球不出现或生长不良 | 温度不正确 | 检查培养箱设定为30℃的提供的Correct温度。 |
| 不断增长的领域有杂物去除 | 对于每个孔，碎片的抽吸必须在介质的顶部表现良好。避免进入你的吸管介质 | |
| 一些试剂的完整性（B27添加剂，EGF，FGF）被削弱 | 这种完整性构成在细胞生长的限制因素。检查批号，并且将样品的方式被保存。避免解冻/重新冻结培养使用的任何试剂采样周期 | |
| 单细胞的存在 | 传输模式/神经球的扩张过于苛刻 | 这一步是一个扩展/稀释步骤，因为在井形成太多的球体。传输过程中避免恶劣的球体收集，防止神经球分离成单个细胞 |
| 在基质胶细胞的缺失 | 基质胶是不正确解冻/稀释 | 为-20℃的Matrigel至少需要30分钟，在4℃解冻，并仔细保持粘性吸取 |
| 基底膜上无粘连 | 细胞悬浮液的体积必须足够小以允许在基质胶涂层细胞沉积 | |
| 允许细胞沉积更多的时间（最多如果使用更大的卷2小时） | ||
| 新鲜分化培养基太冷 | 当更换细胞附着介质，所述分化培养基需要在30℃下被加热，以防止在沉积的细胞热休克 | |
| 可怜的核转 | 死细胞 | 确保在执行核转，你不会产生气泡。通过使用马克西准备使用高品质DNA载体。至少1 - 核转染后2小时，用新鲜的或者Z-分化条件培养基或Z-条件培养基更换培养基。 |
| 一些积极的神经球 | 大小不等的神经球可导致核转差。在DIV2和DIV3使用神经球是理想的核转。细胞密度应不超过4×10 3的神经球毫升-1在100毫升的反应。 |
表1： 故障排除建议清单，为协议， 可能存在的问题及解决方法的 每一步 克服这些困难。
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Discussion
该协议的主要目的是分离和培养成年斑马鱼脑源性神经球用于研究神经干/祖细胞的细胞和分子的特性。在这里，我们报告如何选择多能神经细胞并产生三个神经细胞类型， 即 ，星形胶质细胞，神经元和少突胶质细胞，从成年斑马鱼大脑。因为可重现神经球形成测定法尚未在斑马鱼建立迄今为止协议是非常显著。
在协议中的几个关键步骤，需要得到尊重，并在故障排除建议（ 表1）已recapitutaled。首先，将成年斑马鱼大脑的两个解剖和单细胞悬浮液过程中发生的细胞死亡。为了限制延长细胞死亡，使用清洁和锋利的工具以及严格遵守在本亲建议的时间和孵育的温度是必要母育。其次，神经球文化应以新鲜烹制的媒体和谨慎移液技术来完成。三，细胞密度建议应遵循以获得可靠的续约或神经干细胞的分化。考虑到这一点，任何本领域技术人员在细胞培养技术应该能够使用的协议，并进行成年斑马鱼脑源性神经球的分离，培养和基因操作。
在斑马鱼球体形成测定法是从先前在哺乳动物物种4中描述的相同的限制患：1）被改变如下从其天然脑利基其隔离神经干/祖细胞的行为; 2）神经球不是干细胞的均质群体，但包括干细胞，祖细胞以及有丝分裂后分化的细胞。此外，它也值得注意的是，我们的协议产生aclonal神经球文化。培养物的细胞密度是在球形成测定法的一个关键参数，因为它决定了克隆， 即培养物是否是克隆的，半克隆或aclonal。克隆条件允许精确表征和量化存在于培养干细胞和祖细胞的不同池。我们一直没能进行细胞克隆实验，到目前为止，我们的培养条件还需要更多的优化之前，我们可以从其他祖细胞库区分神经干细胞。
斑马鱼神经球培养物可用于大范围的实验。它们允许神经发生过程中的基因表达分析以及基因表达的操纵通过我们的研究中的神经细胞的命运（ 图4和11）的组织特异性测定评估的miR-107的功能，如图所示。附加应用包括基因组编辑策略，如CRISPR / Cas9系统，以测试在neuroge神经干/祖基因的作用NESIS和大脑修复13。最后，我们的协议表明，斑马鱼神经球可以从不同的脑区域中打开的可能性，研究神经元和神经胶质细胞的特定区域的特征，并在斑马鱼脑14的不同心室域探索神经细胞异质性的细胞和分子基础衍生。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
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