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Developmental Biology

अलगाव और वयस्क Zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न Neurospheres की संस्कृति

Published: February 29, 2016 doi: 10.3791/53617
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1,3, 1
1Yale Cardiovascular Research Center, Internal Medicine, Yale University, 2Department of Medicine, University of California, San Diego, 3APHP Groupe Hospitalier Pitié-Salpètrière, Université Pierre and Marie Curie
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम एक neurosphere परख पूरे दिमाग से या तो telencephalic, tectal या वयस्क zebrafish मस्तिष्क के अनुमस्तिष्कीय क्षेत्रों से निकाली गई वयस्क न्यूरोजेनेसिस का उपयोग कर जांच करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम प्रक्रिया zebrafish neurospheres में जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने का वर्णन है।

Introduction

स्तनधारी तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) इन विट्रो में अपने करार दिया neurospheres 1 कोशिकाओं को विभाजित करने के समूहों के रूप में मुक्त अस्थायी संस्कृतियों में विकसित करने की क्षमता की विशेषता की है। Epidermal वृद्धि कारक (EGF) और fibroblast वृद्धि कारक (FGF) की उपस्थिति में, एनएससी या तो संतुलित रूप से विभाजित स्वयं renewing एनएससी उत्पन्न करने के लिए, या asymmetrically, दो अलग अलग बेटी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अर्थात्।, एक फर्क पूर्वज सेल और एक उपन्यास एनएससी। Neurosphere संस्कृतियों इसलिए तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं और अधिक विभेदित तंत्रिका कोशिकाओं 2-4 का मिश्रण हैं एनएससी, हालांकि, दो विशिष्ट गुण के आधार पर अन्य neurosphere सेल प्रकार से प्रतिष्ठित किया जा सकता है:। वे फ्री- में लंबी अवधि के आत्म नवीकरण प्रदर्शित चल संस्कृतियों और वे सभी तंत्रिका सेल प्रजातियों (यानी, न्यूरॉन्स, astrocytes, और oligodendrocytes) बाह्य मैट्रिक्स substrates के लिए वृद्धि कारकों की वापसी और आसंजन निम्नलिखित में अंतर कर सकते। MAMM मेंए एल एस, neurosphere संस्कृति प्रणाली वयस्क मस्तिष्क में एनएससी की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल पहले इन विट्रो व्यवस्था थी और प्रसार, आत्म नवीकरण क्षमता और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के पूर्वज और multipotency विश्लेषण करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया उपकरण है। इसलिए, भले ही क्षेत्र के गठन assays के कुछ नुकसान और सीमाओं 4 से ग्रस्त हैं, इस संस्कृति प्रणाली एक सेल की क्षमता का एक स्टेम सेल के रूप में व्यवहार करने के लिए मूल्यांकन कर जब अपनी इन विवो आला 4 से हटा दिया है और प्रमुख नियामकों की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है के लिए मूल्यवान है एनएससी आत्म नवीकरण और सेल भाग्य दृढ़ संकल्प 5-7 की।

स्तनधारियों जो वयस्क न्यूरोजेनेसिस सीमित है के विपरीत, zebrafish अनिवार्यता से उनके जीवन भर पूरे दिमाग अक्ष के साथ नए न्यूरॉन्स का उत्पादन। zebrafish वयस्क मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम / पूर्वज टी को समझने के लिए zebrafish एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाने की कोशिकाओं को शरण देने के लिए कई तंत्रिकाजन्य आलों को प्रदर्शित करता हैवह मस्तिष्क में सेल गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से आणविक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान के लिए आवश्यक कार्यक्रमों स्टेम। पिछले 17 वर्षों में, कई अनुसंधान समूहों को अलग-थलग और zebrafish तंत्रिका कोशिकाओं 8,9 संवर्धन के लिए तरीके विकसित की है। इन अध्ययनों से भ्रूण neuronal और इन विट्रो में glial कोशिकाओं के उत्पादन के उद्देश्य से किया गया है, लेकिन नहीं एनएससी को बनाए रखने और उनके गुणों की जांच कर रही है। हालांकि neurospheres वयस्क Apteronotus leptorhynchus (ब्राउन भूत Knifefish) 10 में उत्पन्न किया गया है, zebrafish में एक neurosphere के गठन परख स्थापित किया जाना बना रहा।

यहाँ हम zebrafish न्यूरोजेनेसिस 11 के दौरान मीर 107 की भूमिका को प्रदर्शित करने के लिए एक neurosphere के गठन परख का वर्णन है। प्रोटोकॉल सक्षम बनाता है: 1) या तो zebrafish पूरे दिमाग से या ऐसे telencephalon, Tectum, और सेरिबैलम के रूप में कई विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों से वयस्क तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं का संग्रह; 2) फ्लोरिडा की पीढ़ीoating और वयस्क तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं से स्वयं renewing neurospheres; 3) डाउन और अप-विनियमन जीन कोडिंग या छोटे गैर-कोडिंग RNAs neurospheres में 11, की अभिव्यक्ति के क्रम में प्रसार और तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए।

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Protocol

गुम्मट सीएफ तनाव के Zebrafish उठाया और येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC प्रोटोकॉल संख्या 2,012-11,473) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार बनाए रखा गया। सभी प्रयोगों पहले अनुसंधान प्रयोजनों के लिए जानवरों के इस्तेमाल के बारे में शव को विनियमित करने के लिए सभी संबंधित सरकारी और संस्थागत नैतिकता द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए।

1. तैयारी

  1. विच्छेदन के माध्यम के 10 मिलीलीटर की तैयारी के 200 μl जोड़ने 100x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन DMEM / F12 के 9.8 मिलीलीटर में।
  2. , टिशू कल्चर के लिए पानी की 10 मिलीलीटर एल सिस्टीन की 120 मिलीग्राम जोड़ें: एल सिस्टीन समाधान तैयार है। अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एल सिस्टीन समाधान की दुकान, या अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में।
  3. DNase मैं समाधान तैयार: टिशू कल्चर के लिए पानी की 1 मिलीलीटर, DNase मैं स्टोर DNase मैं 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान के 10 मिलीग्राम जोड़ें।
  4. papain समाधान तैयार: papain solut तैयार करने के लिएआयन, DMEM / F12 के 5 एमएल में 100 μl papain (लगभग 140 इकाइयों), 100 μl DNase मैं (1%) और 200 μl एल सिस्टीन (12 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें। हौसले papain समाधान के लिए हर समय तैयार है और उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के साथ बाँझ।
  5. धोने के समाधान तैयार:, समाधान धोने के 100 मिलीलीटर तैयार करने के लिए 93.85 मिलीलीटर DPBS 1x में ग्लूकोज 650 μl जोड़ने के लिए 45%, 500 μL HEPES 1 एम और 5 मिलीलीटर FBS। उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के साथ धोने के समाधान जीवाणुरहित। अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धोने के समाधान स्टोर।
  6. , इंसुलिन समाधान के 2 मिलीलीटर तैयार करने के लिए टिशू कल्चर के लिए पानी के 2 मिलीलीटर में 10 एन NaOH और 100 मिलीग्राम इंसुलिन की एक 25 μl बूंद जोड़ें: इंसुलिन समाधान तैयार है।
  7. EGF और FGF समाधान तैयार: 100 माइक्रोग्राम / एमएल एकाग्रता में DMEM / F12 में दोनों mitogens भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 μl aliquots के रूप में स्टोर।
  8. 500 μl के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस और 1 मिलीलीटर aliquots, respectiv पर दुकान बी -27 और एन 2 की खुराक: बी -27 और एन 2 मीडिया तैयारइली।
  9. जेड भेदभाव हालत मध्यम तैयार: जेड भेदभाव हालत माध्यम के 100 मिलीलीटर तैयार करने के लिए 40 μl इंसुलिन (50 मिलीग्राम / एमएल), 500 μl बी -27, 1 मिलीलीटर एन 2, 650 μl ग्लूकोज 45% और के 1 मिलीलीटर जोड़ें 100 x पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन DMEM / F12 के ९७.८१ मिलीलीटर में। उपयोग करने से पहले एक 0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार फिल्टर के साथ जेड भेदभाव हालत मध्यम जीवाणुरहित। अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जेड भेदभाव हालत मध्यम स्टोर।
  10. जेड हालत मध्यम तैयार: जेड हालत मीडिया के 50 मिलीलीटर तैयार करने के लिए EGF के 10 μl और बाँझ जेड भेदभाव हालत मध्यम (20 एनजी / एमएल) के 50 मिलीलीटर में FGF के 10 μl जोड़ें। अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जेड हालत मध्यम स्टोर।
  11. DMEM / F12 का 4.9 मिलीलीटर में 5 मिलीलीटर बाह्य कोटिंग समाधान के लिए, बाह्य मैट्रिक्स समाधान के 100 μl जोड़ें: भेदभाव संस्कृति के लिए कोटिंग समाधान तैयार है (जैसे, Matrigel।)। बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना बाह्य मैट्रिक्स समाधान। एक बार जब डीफ़्रॉस्ट, यू के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रख2 सप्ताह के लिए पी।

2. वयस्क Zebrafish मस्तिष्क के विच्छेदन

  1. एक विच्छेदन जेल आइस पैक के साथ एक 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश भरने से बिस्तर तैयार करें। फिर पेट्री डिश पर ढक्कन जगह और जेल जमा देता है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ढक्कन जगह के शीर्ष पर साफ फिल्टर पेपर के एक वर्ग और रैप दोनों फिल्टर कागज और प्लास्टिक की फिल्म के साथ पेट्री डिश।
  2. स्वच्छ और प्रत्येक उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल या गर्मी से सभी microdissection उपकरणों बाँझ। सभी निष्फल विच्छेदन उपकरणों विदारक माइक्रोस्कोप के पास जगह और सही इच्छामृत्यु से पहले, ऑप्टिकल फाइबर रोशनी के साथ खुर्दबीन के नीचे विच्छेदन बिस्तर जगह है।
  3. एक पूरे मस्तिष्क neurosphere तैयारी के लिए 2 वयस्क zebrafish लीजिए; और 3 से 4 zebrafish विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों से neurospheres उत्पन्न करते हैं।
  4. वयस्क zebrafish (8-12 महीने पुरानी है) एक प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित का उपयोग कर euthanize। अगले, 7 में मछली विसर्जितऔर 5-10 सेकंड के लिए 5% इथेनॉल जल्दी विच्छेदन बिस्तर एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर गहरे नाले के स्तर पर कत्ल के द्वारा पीछा में जगह है।
    1. जानवरों euthanize करने के लिए, एक ज्यादा tricaine methanesulfonate की (300 मिलीग्राम / एल) प्रशासन जब तक जानवर के दिल की धड़कन को धीरे-धीरे नीचे धीमा कर देती है और रक्त परिसंचरण में बंद हो जाता है, तो आइस्ड पानी में विसर्जित कर दिया।
  5. नीचे बारी सिर पृष्ठीय पक्ष, और कैंची का उपयोग करने के लिए मुंह में कटौती की ओर से एक अनुदैर्ध्य काट कर। संदंश का प्रयोग खोपड़ी के आधार बेनकाब और सभी आसन्न ऊतक को हटा दें। Tectum की ओर रीढ़ की हड्डी की शुरुआत से खोपड़ी के पार्श्व दीवारों कट।
  6. कैंची का प्रयोग, कट और ऑप्टिक नसों को हटाने और फिर Tectum के स्तर पर खोपड़ी के सबसे पार्श्व भाग के दोनों पक्षों को हटा दें। सिर उदर की ओर बढ़ाएं। संदंश का प्रयोग, खोपड़ी के सबसे शिखर भाग के बाकी बंद छील।
  7. एक नए पकवान वाई में खोपड़ी के शेष भाग के साथ-साथ मस्तिष्क हस्तांतरणविच्छेदन मध्यम (1.1) वें। विच्छेदन मध्यम में मस्तिष्क के ऊतकों को साफ सूक्ष्म चाकू की प्लास्टिक संभाल का उपयोग कर, सभी मस्तिष्क संरचना बरकरार रखे हुए हैं।
  8. इस बिंदु से, पूरे zebrafish मस्तिष्क का उपयोग कर प्रोटोकॉल जारी है।
    1. वैकल्पिक रूप से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल पूरे zebrafish मस्तिष्क से या telencephalon, Tectum / diencephalon या सेरिबैलम एक ताजा छुरी के साथ विच्छेदित से neurospheres उत्पन्न करते हैं। ब्याज अनुसार मस्तिष्क क्षेत्र को काटना 3 चित्रा और संदर्भ के लिए 11 एक तंत्रिका विशिष्ट फ्लोरोसेंट zebrafish तंत्रिका ट्रांसजेनिक लाइन का प्रयोग करें।

3. वयस्क मस्तिष्क की एकल सेल हदबंदी

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाद के सभी काम करते हैं। विच्छेदन के माध्यम से 800 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मस्तिष्क ऊतक स्थानांतरण (1.1 चरण में तैयार)। pipetting द्वारा विच्छेदन के माध्यम से निकालें, मस्तिष्क के ऊतकों को बिना छुए।
  2. papain समाधान (1.4 कदम) के 500 μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क के ऊतकों को पचाने। अब से 15 मिनट सेते के रूप में यह सेल व्यवहार्यता कम हो सकता है मत करो।
  3. ऊष्मायन के बाद, नीचे से ~ 0.25 इंच पर एक 1000 μl pipet टिप कटौती का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में papain समाधान के 500 μl के साथ मस्तिष्क के ऊतकों हस्तांतरण। धीरे धीरे धीरे ही टिप के साथ ऊपर और नीचे 10 बार pipetting द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों को अलग कर देना। ऊपर pipet नहीं करते हैं और अधिक से अधिक 15 बार नीचे और इस कदम के दौरान हवा के बुलबुले नहीं पैदा करते हैं, के रूप में यह सेल व्यवहार्यता को बदल सकता है।
  4. ऊपर pipetting द्वारा पीछा किया और 10 मिनट के नीचे 10-13 बार एक काटा हुआ 1,000 μl नियमित टिप का उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से मस्तिष्क के ऊतकों को सेते हैं। ऊपर pipet नहीं है और नीचे से अधिक 15 बार, कोशिका मृत्यु से बचने के लिए।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट (आरटी) के लिए 800 XG पर सेल निलंबन धोने के समाधान (1.5 कदम), और सेंट्रीफ्यूज के 2 मिलीलीटर जोड़कर enzymatic पाचन बंद करो। ध्यान से रों छाननाupernatant और एक 1000 μl नियमित टिप के साथ और नीचे pipetting द्वारा एक उंगली से सख्ती और फिर ट्यूब दोहन से शेष समाधान में गोली resuspend। अगले, समाधान धोने के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. इस स्तर पर, माइक्रोस्कोप है कि एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त किया गया है के तहत की जाँच करें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 800 XG पर फिर से सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला निकालें और गोली ताजा जेड हालत मध्यम (1.10 कदम) के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर फिर से निलंबित।
  7. Trypan नीले और 12 का उपयोग करके कोशिकाओं दाग नीले मृत कोशिकाओं को छोड़कर द्वारा एक hemocytometer का उपयोग जीवित कोशिकाओं गिनती। प्रत्येक कुएं में ताजा जेड हालत माध्यम के 300 μl सेल निलंबन के 200 μl और के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली तैयार करें। ~ 500 कोशिकाओं / μl के घनत्व पर बीज कोशिकाओं। , 5% सीओ 2 में 30 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में संवर्धित कोशिकाओं को बनाए रखने के बाद से zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न neurospheres 37 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से जाना नहीं है।

4. प्राथमिक Neurospheres की पीढ़ी </ P>

  1. इन विट्रो (DiV1) में 1 दिन के बाद, एकल कोशिका निलंबन खुर्दबीन के नीचे वयस्क पूरे दिमाग से प्राप्त पालन और ध्यान रखें कि क्या मलबे अच्छी तरह से केंद्र में जमा किया है। ध्यान से मध्यम के लगभग 100 μl pipetting द्वारा किसी भी मलबे को हटाने (कम संभव हो तो)। अगले ताजा जेड हालत माध्यम के 100 μl जोड़ें। एकल कक्ष निलंबन इस समय (2A चित्रा DiV1) में मनाया जाना चाहिए।
  2. (DIV2) इन विट्रो में 2 दिनों के बाद, संवर्धित कोशिकाओं का विस्तार। टिप कटौती के साथ एक 1000 μl पिपेट का उपयोग करना, इकट्ठा करने और अच्छी तरह से एक नया करने में प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 250 μl हस्तांतरण। सभी कुओं में ताजा जेड हालत माध्यम के 250 μl जोड़ें। संवर्धित कोशिकाओं के विस्तार से पहले, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा बहुत धीरे निलंबन homogenize अच्छी तरह से भर में।
  3. दोहराएँ 4.1 और 4.2 इन विट्रो में निम्नलिखित 4 दिन (Div4) के लिए कदम। neurospheres के आकार में एक प्रगतिशील वृद्धि छठी होना चाहिएकेंद्र और अच्छी तरह से किनारों Div3 और Div4 (चित्रा 2 बी और सी) में कम से असंभव।
    नोट: प्राथमिक neurospheres पारित होने या multipotency का आकलन करने के भेदभाव के लिए कार्रवाई की जा सकती। वैकल्पिक रूप से, वे भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट जीन की भूमिका को चिह्नित करने nucleofection या लाइपो अभिकर्मक 11 के लिए कार्रवाई की जा सकती।

5. प्राथमिक Neurospheres की Passaging

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से टिशू कल्चर के 250 μl निकालें और यंत्रवत् एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ Div4 neurospheres अलग कर देना। नीचे भी तेजी के रूप में हवा बुलबुला गठन कोशिका मृत्यु हो सकती है वृद्धि हुई pipet और मत करो।
  2. एक hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में प्राथमिक संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 250 μl में 800 कोशिकाओं / μl वितरित।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से जेड हालत माध्यम के 250 μl जोड़ें।
  4. (DIV2) इन विट्रो में 2 दिनों के बाद, के रूप में 4.2 कदम एक में सूचना दी संवर्धित कोशिकाओं का विस्तारडी 4.3।

6. प्राथमिक Neurospheres के भेदभाव

  1. 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जन के द्वारा कवर चश्मे जीवाणुरहित, उन्हें एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में रखकर आरटी पर तो सूखी कवर चश्मा।
  2. इस तरह है कि यह व्यापक रूप से विस्तार और पूरे कवर कांच कवर कर सकते हैं में बाह्य कोटिंग समाधान (कदम 1.11) कवर कांच के केंद्र में की 300 μl जोड़ें। फिर, 1 एच (humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर का उपयोग) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के बाद बाह्य कोटिंग समाधान निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए कवर कांच सूखी।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से टिशू कल्चर के 250 μl निकालें। यंत्रवत् एक 1 मिलीलीटर पिपेट (व्यापक अंत टिप के साथ) के साथ अच्छी तरह से प्रति सभी Div4 प्राथमिक neurospheres ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अलग कर देना।
  5. बीज एक सेल (पहले से तैयार बाह्य मैट्रिक्स लेपित coverglasses पर 4 x 10 3 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व 6.1-6 कदम पर neurosphere सेल निलंबन अलग।3) और कम से कम 30 मिनट के लिए, जब तक सब्सट्रेट से जुड़ी है, 5% सीओ 2 में 30 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं। फिर, संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए और तेजी से 5% सीओ 2 में 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संवर्धन कोशिकाओं से पहले पूर्व गर्म ताजा जेड भेदभाव हालत मध्यम (कदम 1.9) के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. हर दो दिन, सेल differentation के समय के दौरान जेड भेदभाव हालत मध्यम के आधे की जगह।

7. प्राथमिक Neurospheres के जीन में गड़बड़ी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 80 x जी 8 मिनट के लिए centrifuging द्वारा DiV3-4 प्राथमिक neurospheres (4.3 चरण) ले लीजिए। वाणिज्यिक oligonucleoatides की liposome अभिकर्मक के लिए तैयार के रूप में previouly 11 या डीएनए प्लाज्मिड वैक्टर Nucleo अभिकर्मक का वर्णन किया।
  2. एक प्रतिक्रिया मिश्रण के 100 μl (82 μl nucleofactor समाधान और पूरक के 18 μl) में 4 x 10 3 कोशिकाओं / μl के एक सेल घनत्व पर Resuspend neurosphere गोली।
  3. neurosphere suspensi मिक्सचुनाव के डीएनए प्लाज्मिड वैक्टर (1 माइक्रोग्राम / μl पर प्लाज्मिड स्टॉक) के 5 μl के साथ पर। nucleotransfection के लिए एक Nucleofector क्युवेट में neurosphere / डीएनए मिश्रण स्थानांतरण और कार्यक्रम Nucleofector चयन Nucleofector किट द्वारा प्रदान निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
  4. इसके तत्काल बाद nucleofection के बाद, कोशिकाओं के लिए पूर्व गर्म जेड हालत मीडिया (1.10) की 500 मिलीलीटर की एक मात्रा जोड़ सकते हैं और जैसा कि ऊपर वर्णित है, उनके सेल नवीकरण और / या भेदभाव गुण के अध्ययन के लिए ट्रांसफ़ेक्ट neurospheres थाली।

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Representative Results

वयस्क Zebrafish neurosphere संस्कृति की सामान्य योजना

यहाँ हम वयस्क zebrafish मस्तिष्क से प्रदर्शन किया neurosphere के गठन परख के प्रोटोकॉल के सभी चरणों का वर्णन है। सबसे पहले, वयस्क तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं या तो zebrafish पूरे दिमाग से या ऐसे telencephalon, Tectum और सेरिबैलम (आंकड़े 1 ए सी) के रूप में कई विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों से एकत्र किया गया है। वयस्क तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के एकल कक्ष निलंबन तो फ्लोटिंग और स्वयं renewing neurospheres (आंकड़े -1 डी, ई) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। अंत में, neurospheres क्रम में डाउन और अप-विनियमन अध्ययन में जीन कोडिंग या छोटे गैर-कोडिंग RNAs 11 की अभिव्यक्ति की भूमिका निभाई है प्रसार और zebrafish तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए।

Zebrafish प्राथमिक neurospheres कई मार्ग निम्नलिखित आत्म नवीनीकृत कर सकते हैं। मार्ग 1 और 2 में neurospheres उत्पन्न करने के लिए, कदम 5.1-5.4 दो बार, 6-8 दिनों के कुल में दोहराया गया। DiV2-4 से, neurospheres के आकार व्यास में लगभग 50 माइक्रोन तक की वृद्धि हुई है। द्वितीयक और तृतीयक neurospheres भी मार्ग 1 और 2, क्रमशः (चित्रा 2 डी) के बाद प्राप्त किया गया। पारित होने पर 3, zebrafish neurospheres हालांकि 50 माइक्रोन व्यास की महत्वपूर्ण आकार पर विकसित करने में असमर्थ थे और आत्म को नवीनीकृत करने में विफल रहा है, सुझाव है कि हमारी संस्कृति हालत बजाय तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 4 का एक शुद्ध आबादी की तुलना में स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं का एक पूल का चयन ।

neurosphere भेदभाव

प्राथमिक, माध्यमिक या तृतीयक neurospheres या तो Whol से निकाली गईई मस्तिष्क या telencephalic से, अनुमस्तिष्क और tectal क्षेत्र वयस्क zebrafish की उनकी योग्यता भेदभाव के लिए परीक्षण किया गया। के बीच भेदभाव की स्थिति (DiVd1-DiVd3) में इन विट्रो में 1 और 3 दिन, पक्षपाती कोशिकाओं की एक monolayer मनाया गया (आंकड़े 3 ए, बी)। जैसा कि चित्र में सचित्र -3 सी, DiVd4 पर, अनुमानों के साथ ही glia कोशिकाओं की तरह axonal दिखाई और अलग पहचाना immunohistological या जीन अभिव्यक्ति से थे 11 का विश्लेषण करती है, का आकलन है कि तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं भेदभाव कर दिया था। इसी तरह, न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम / पूर्वज अलग मस्तिष्क प्रदेशों (आंकड़े 3 डी, ई) से अलग कोशिकाओं से अलग करता है।

Zebrafish Neurospheres में जीन की अभिव्यक्ति हेरफेर

हम पूरे zebrafish मस्तिष्क-डी के neuronal और glial भेदभाव पर मीर 107 की भूमिका का परीक्षण किया rived न्यूरल स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं (चित्रा 4)। हम पता चला है कि विरोधी मीर 107 से 107 मीर के डाउनरेगुलेशन, के रूप में axonal प्रक्रियाओं (आंकड़े -4 ए, बी) की असामान्य वृद्धि से संकेत दिया neurosphere गठन लेकिन बदल neuronal भेदभाव को प्रभावित नहीं किया। आरटी पीसीआर जीन अभिव्यक्ति की पुष्टि की विश्लेषण करती है कि मीर 107 का निषेध, दोनों neuroblast मार्कर Neurogenin-1 (एन जी एन -1) और इस तरह के मानचित्र -2 और α ट्यूबिलिन के रूप में अक्षतंतु-विशिष्ट अणुओं की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति की ओर जाता है glial को प्रभावित किए बिना सेल मार्कर अभिव्यक्ति (S-100, GFAP, Olig2) (चित्रा 4C)। तदनुसार, द्वारा मीर 107 अभिव्यक्ति का लाभ मीर 107 नकल neuroblast- और अक्षतंतु विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति (चित्रा 4D) की कमी प्रेरित, का आकलन है कि, इन विट्रो में, zebrafish न्यूरोजेनेसिस के दौरान एक neuronal भेदभाव नियामक के रूप में मीर 107 कृत्यों 11।

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चित्रा 1:। प्रोटोकॉल कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रक्रियाओं और संबद्ध समय (बी ए), एक एकल कक्ष निलंबन की obtention (या तो पूरे दिमाग या telencephalic, tectal और वयस्क zebrafish मस्तिष्क के अनुमस्तिष्कीय क्षेत्रों के विच्छेदन शामिल सेल्सियस ), चल neurospheres (डी) और neurospheres के भेदभाव (ई) की पीढ़ी।

चित्र 2
चित्रा 2: बनाने Zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न Neurospheres। (ए - सी) पूरे मस्तिष्क व्युत्पन्न प्राथमिक चल neurospheres के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों, 1 (DiV1, ए) दिवस पर मनाया दिन 3 (Div3, बी) और दिन 4 (Div4, सी)। (डी) चार्ट पूर्वोत्तर के सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्वमार्ग 1 और 2 पर urospheres पारित 0 पर neurosphere संख्या की तुलना में पारित होने के बाद 2, neurospheres गठन के लिए काफी था कमी आई है। स्केल पट्टी: 25 माइक्रोन।

चित्र तीन
। चित्रा 3: Zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न Neurospheres के भेदभाव (ए - सी, ई) 1 के दौरान पूरे मस्तिष्क व्युत्पन्न जेड भेदभाव माध्यम में सुसंस्कृत neurospheres के चरण विपरीत छवियों (ए, DiVd1), 3 (बी, DiVd3) और 4 (सी और डी, DiVd4) दिन। Zebrafish: एक 12 महीने पुराने टीजी (DsRed GFAP) के पूरे मस्तिष्क का (ई) पृष्ठीय दृश्य। telencephalon (तेल), Tectum (टीईसी) और सेरिबैलम (सीईआर) विच्छेदित और रूप में दिखाया गया एकत्र किए गए थे। (डी) पारित 0 (P0) पर Tectum, telencephalon और सेरिबैलम से निकाली गई DiVd4 neurospheres, 1 (P1 की छवियाँ) और 2 (P2)। स्केल पट्टी: 25 माइक्रोन।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Neurospheres के विश्लेषण MiR107 हेरफेर के बाद गठित (ए) चरण विपरीत Div4d neurospheres संकेत दिया ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स साथ Div4 में इलाज दिखा छवियों। शीर्ष पैनल में काले बक्से क्षेत्र नीचे पैनलों में बढ़ाया संकेत मिलता है। (बी) के शीर्ष चार्ट के साथ, या बिना, miR107 गठन neurospheres की संख्या की मात्रा का ठहराव का प्रतिनिधित्व करता है। Neurospheres उनके आकार (20-30 माइक्रोन, 31-50 माइक्रोन,> व्यास में 51 माइक्रोन) द्वारा subgrouped रहे हैं। नीचे चार्ट neurospheres इलाज और उप ऊपर के रूप में वर्गीकृत किया है से axonal अनुमानों की मात्रा का ठहराव इंगित करता है। (सी, डी) QRT- पीसीआर अभिव्यक्ति संकेत दिया जीन की Div4d neurospheres पहले Div4 पर संकेत दिया ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के साथ इलाज से विश्लेषण। डेटा का प्रतिनिधित्वमतलब ± SEM, * पी ​​<0.05, एन = 3. Scr: हाथापाई। स्केल पट्टी: 25 माइक्रोन।

मुसीबत संभावित कारण उपाय
भी कई मृत कोशिकाओं की वसूली एंजाइमी इलाज से पहले मस्तिष्क तैयार करने में समय देरी विच्छेदन की स्थापना सुनिश्चित करें और मीडिया मछली त्याग से पहले तैयार कर रहे हैं (यह भी बाँझपन की जांच, तापमान)
कड़े papain उपचार यांत्रिक हदबंदी पर्याप्त नाजुक एक लाइव एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करने के लिए है, लेकिन काफी मजबूत ऊतक के भी कई झुरमुटों के पीछे छोड़ने से बचने के लिए की जरूरत है। सिफारिश के समय और ऊष्मायन / centrifugation अवधि के लिए तापमान का सम्मान
Neurospheres दिखाई देते हैं या खराब हो जाना नहीं है गलत तापमान कि इनक्यूबेटर 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट प्रदान कर रहा है ग चेकorrect तापमान।
बढ़ते मलबे के साथ हटाया क्षेत्रों प्रत्येक अच्छी तरह से, मलबे की आकांक्षा माध्यम के शीर्ष पर अच्छी तरह से प्रदर्शन किया जा रहा है। अपने pipet के साथ मध्यम में प्रवेश करने से बचें
कुछ अभिकर्मकों की अखंडता (B27 पूरक, EGF, FGF) कमजोर हो रहा है इस अखंडता सेल के विकास में सीमित कारकों का गठन किया। बैच नंबर की जाँच करें, और जिस तरह के नमूने संरक्षित किया गया। पिघलना से बचें / संस्कृति में इस्तेमाल किसी भी जांचा अभिकर्मक के चक्र refreeze
एकल कोशिकाओं की उपस्थिति हस्तांतरण के मोड / neurospheres का विस्तार भी कठोर है यह कदम एक विस्तार / कमजोर पड़ने कदम क्योंकि बहुत सारे क्षेत्रों में अच्छी तरह का गठन कर रहे हैं। स्थानांतरण के दौरान कठोर क्षेत्र संग्रह से बचें एकल कक्षों में neurosphere हदबंदी को रोकने के लिए
Matrigel पर कोशिकाओं के अभाव Matrigel ठीक से नहीं किया गया था thawed / पतला -20 डिग्री सेल्सियस से Matrigel पिघलना करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट की जरूरत है और चिपचिपा Pipet ध्यान रहता है
Matrigel पर कोई आसंजन सेल निलंबन की मात्रा काफी छोटा Matrigel कोट पर सेल बयान अनुमति देने के लिए हो गया है
सेल बयान के लिए और अधिक समय की अनुमति दें (अप 2 घंटा, तो बड़ी मात्रा में उपयोग किया जाता है)
ताजा भेदभाव माध्यम भी ठंड जब सेल लगाव मध्यम जगह, भेदभाव माध्यम जमा कोशिकाओं पर थर्मल आघात को रोकने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर गरम करने की जरूरत है
गरीब nucleofection मृत कोशिकाओं सुनिश्चित करें कि आप हवा के बुलबुले जबकि nucleofection प्रदर्शन उत्पन्न नहीं करते हैं। मैक्सी तैयारियों का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए वैक्टर का प्रयोग करें। कम से कम 1 - 2 nucleofection के बाद मानव संसाधन, तो ताजा जेड भेदभाव हालत मध्यम या जेड हालत माध्यम का उपयोग कर संस्कृति के माध्यम से जगह।
कुछ सकारात्मक neurospheres अलग आकार के Neurospheres गरीब nucleofection के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। DIV2 और Div3 पर प्रयोग neurospheres nucleofection के लिए आदर्श होते हैं। कोशिकाओं के घनत्व 4 एक्स 10 3 neurospheres मिलीलीटर -1 एक 100 मिलीलीटर प्रतिक्रिया में अधिक नहीं होनी चाहिए।

तालिका 1: समस्या निवारण सलाह, लिस्टिंग प्रोटोकॉल, संभव मुद्दों और समाधान के प्रत्येक चरण उन पर काबू पाने के लिए।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य न्यूरल स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के सेलुलर और आणविक सुविधाओं के अध्ययन के लिए अलग और संस्कृति वयस्क zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न neurospheres है। यहाँ, हम कैसे multipotent तंत्रिका कोशिकाओं का चयन और तीन तंत्रिका कोशिका प्रकार, यानी, astrocytes, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes उत्पन्न, वयस्क zebrafish मस्तिष्क से करने के लिए रिपोर्ट। प्रोटोकॉल अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य neurosphere के गठन परख zebrafish में स्थापित नहीं किया गया है अब तक।

प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम का सम्मान किया जाना चाहिए और समस्या निवारण सलाह (1 टेबल) में recapitutaled की है। सबसे पहले, कोशिका मृत्यु दोनों वयस्क zebrafish मस्तिष्क के विच्छेदन और एकल कक्ष निलंबन प्रक्रिया के दौरान होता है। कोशिका मृत्यु का विस्तार सीमित करने के लिए, यह साफ है और तेज उपकरणों का उपयोग करने के साथ-साथ सख्ती से समय और ऊष्मायन के तापमान उपस्थित समर्थक में सिफारिश का सम्मान करने के लिए आवश्यक हैtocol। दूसरे, neurosphere संस्कृति हौसले से तैयार मीडिया के साथ और एक सावधान pipetting तकनीक के साथ किया जाना चाहिए। तीसरा, सेल घनत्व सिफारिशों विश्वसनीय नवीकरण या neurosphere कोशिकाओं के भेदभाव को प्राप्त करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए। इसे ध्यान में रखते, किसी को भी सेल कल्चर तकनीक में कुशल प्रोटोकॉल का उपयोग करें और वयस्क zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न neurospheres के अलगाव, संस्कृति और जीन में गड़बड़ी से बाहर ले जाने के लिए सक्षम होना चाहिए।

Zebrafish में क्षेत्र के गठन assays में एक ही सीमाओं पहले स्तनधारी प्रजातियों 4 में वर्णित से पीड़ित है: 1) तंत्रिका स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार को उनके प्राकृतिक मस्तिष्क आला से उनके अलगाव के बाद बदल दिया है; 2) neurospheres स्टेम कोशिकाओं का एक सजातीय आबादी नहीं हैं, लेकिन स्टेम सेल, पूर्वज कोशिकाओं के साथ ही बाद mitotic विभेदित कोशिकाओं शामिल हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि हमारे प्रोटोकॉल aclonal neurosphere संस्कृतियों उत्पन्न करता है इसके अलावा लायक है। संस्कृतियों की सेल घनत्व हैक्षेत्र के गठन assays में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के बाद से यह clonality, यानी निर्धारित करता है, चाहे संस्कृति, प्रतिरूप अर्द्ध प्रतिरूप या aclonal है। क्लोनल की स्थिति सही विशेषताएँ और संस्कृति में मौजूद स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं के विभिन्न पूल यों की अनुमति देते हैं। हम अब तक सेल clonality assays प्रदर्शन करने में सक्षम नहीं किया गया है और हमारी संस्कृति की स्थिति अभी भी अधिक अनुकूलन की जरूरत है इससे पहले कि हम अन्य पूर्वज सेल पूल से तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव कर सकते हैं।

Zebrafish neurosphere संस्कृतियों प्रयोगों की एक बड़ी रेंज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। के रूप में तंत्रिका कोशिका भाग्य (चित्रा 4 और 11) के ऊतक विशिष्ट निर्धारण में मीर 107 समारोह का आकलन हमारे अध्ययन से यह साफ वे न्यूरोजेनेसिस के दौरान जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के साथ ही जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर की अनुमति है। अतिरिक्त अनुप्रयोगों आदेश neuroge में तंत्रिका स्टेम / पूर्वज जीन की भूमिका का परीक्षण करने के लिए, इस तरह के CRISPR / Cas9 प्रणाली के रूप में जीनोम संपादन रणनीतियों में शामिलNesis और मस्तिष्क की मरम्मत 13। अंत में, हमारे प्रोटोकॉल पता चलता है कि zebrafish neurospheres न्यूरॉन्स और glia कोशिकाओं के क्षेत्र विशेष सुविधाओं का अध्ययन करने और zebrafish मस्तिष्क के विभिन्न 14 वेंट्रिकुलर डोमेन में तंत्रिका कोशिका विविधता के सेलुलर और आणविक आधार का पता लगाने के लिए संभावना खोलने अलग मस्तिष्क क्षेत्रों से प्राप्त किया जा सकता है ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS 1x Life Technologies 14190-144
DMEM/F12 1x Life Technologies 11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate  Sigma C6852-25g
B-27 Life Technologies 17504-044
N-2 Life Technologies 17502-048 N-2 supplement (100x) liquid 
HEPES  Life Technologies 15630 1 M
D-(+)-Glucose 45%  Sigma G8769
Penicillin-streptomycin  Life Technologies 15140-122
Fetal Bovine Serum  Life Technologies 16000044
Human FGF-basic  Peprotech  100-18B
Human EGF  Peprotech AF-100-15
Insulin  Sigma I5500-50 mg
DNAse Sigma DN25-10mg
Papain  Worthington Biochemical Corporation LS003126
Matrigel  Becton Dickinson 356234
PFA  TCI P0018
PBS AmericanBio AB11072-04000
Tricaine MS-222 Sigma A5040 stock solution of 4 mg/ml. 
Trycold gel  Sigma TGP8 gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit Lonza VPI-1004
Trypan blue stain  Life Technologies 15250061

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 108 zebrafish न्यूरोजेनेसिस तंत्रिका वयस्क स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं neurosphere परख miRNA आनुवंशिक हेरफेर
अलगाव और वयस्क Zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न Neurospheres की संस्कृति
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Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F.,… More

Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres. J. Vis. Exp. (108), e53617, doi:10.3791/53617 (2016).

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