Summary
Ici, nous fournissons une méthode reproductible pour examiner la neurogenèse adulte en utilisant un essai de neurosphères dérivées de l'ensemble du cerveau ou de l'une ou l'autre télencéphalique, tectale ou des régions cérébelleuses du cerveau adulte de poisson zèbre. En outre, nous décrivons la procédure de manipuler l'expression des gènes dans les neurosphères de poisson zèbre.
Introduction
Les cellules souches neurales de mammifère (NNC) ont été caractérisées in vitro par leur aptitude à croître dans des cultures flottantes comme des amas de cellules en division appelées neurosphères 1. En présence du facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), le NNC se divisent de manière symétrique pour générer NNC d'auto-renouvellement, ou asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, à savoir., Une cellule progénitrice de différenciation et un nouveau CNS. Cultures neurosphères sont donc un mélange de cellules souches / progénitrices neurales et des cellules neurales plus différenciées 2-4 NSCs peuvent cependant être distinguées des neurosphères autres types de cellules par deux propriétés spécifiques:. Ils affichent à long terme d' auto-renouvellement Free- les cultures flottantes et elles peuvent se différencier en toutes les lignées cellulaires de neurones ( par exemple, les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes) après le retrait des facteurs de croissance et de l' adhérence à des substrats de la matrice extracellulaire. Dans mammals, le système de culture de neurosphères a été le premier système in vitro utilisé pour démontrer la présence de NNC dans le cerveau adulte et reste l'outil le plus couramment utilisé pour analyser la prolifération, la capacité d' auto-renouvellement et multipotence des cellules souches et progénitrices neurales. Par conséquent, même si les essais de sphère formant souffrent de certains inconvénients et limitations 4, ce système de culture est utile pour évaluer le potentiel d'une cellule à se comporter comme une cellule souche lorsqu'elle est retirée de sa niche in vivo 4 et a joué un rôle dans l' identification des régulateurs clés de NSC auto-renouvellement et le destin des cellules détermination 5-7.
Contrairement aux mammifères qui ont limité la neurogenèse adulte, le poisson zèbre produisent constitutivement nouveaux neurones le long de l'axe du cerveau entier tout au long de leur vie. Le cerveau du poisson zèbre adulte affiche plusieurs niches neurogène hébergeant souches neurales / cellules progénitrices rendant zebrafish un organisme modèle puissant pour comprendre til endiguer l'activité des cellules dans le cerveau, ainsi que les programmes moléculaires nécessaires à la centrale régénération du système nerveux. Au cours des 17 dernières années, plusieurs groupes de recherche ont développé des méthodologies pour l' isolement et la culture de cellules neuronales 8,9 poisson zèbre. Ces études visaient à produire des neurones embryonnaires et les cellules gliales in vitro, mais pas au maintien de NNC et enquêter sur leurs propriétés. Bien que neurosphères ont été générés chez l'adulte Apteronotus leptorhynchus (Brown fantôme knifefish) 10, un dosage de neurosphères formant chez le poisson zèbre reste à établir.
Nous décrivons ici un essai de Neurosphère formation à démontrer le rôle de miR-107 au cours de la neurogenèse zebrafish 11. Le protocole permet: 1) la collecte des adultes cellules souches / progénitrices neurales soit de zebrafish ensemble du cerveau ou de plusieurs régions du cerveau disséqués comme le télencéphale, tectum, et le cervelet; 2) la production de flottant et neurosphères d'auto-renouvellement de cellules souches / progénitrices neurales adultes; 3) l'aval et la régulation de l'expression des gènes codant ou petits ARN non codantes 11 en neurosphères, afin d'enquêter sur leur rôle dans la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices neurales.
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Protocol
Zebrafish de la souche WT CF ont été soulevées et entretenu conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l' Université Yale Institutional animale soin et l' utilisation (IACUC numéro de protocole 2012-11473). Toutes les expériences doivent d'abord être approuvées par toute éthique gouvernementales et institutionnelles pertinentes régissant les organismes en ce qui concerne l'utilisation des animaux à des fins de recherche.
1. Préparatifs
- Préparer 10 ml de milieu de dissection, ajouter 200 ul de pénicilline-streptomycine 100X dans 9,8 ml de DMEM / F12.
- Préparer une solution de L-cystéine: à 10 ml d'eau pour culture de tissus, ajouter 120 mg de L-cystéine. Stocker la solution de L-cystéine à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines, ou dans des aliquotes à -20 ° C pendant jusqu'à 1 an.
- Préparer DNase I solution: 1 ml d'eau pour la culture de tissus, ajouter 10 mg de DNase I. Magasin I solution DNase à 4 ° C pendant 2 mois.
- Préparer la solution papaïne: pour préparer la papaïne solution, ajouter 100 ul de papaïne (environ 140 unités), 100 ul de DNase I (1%) et 200 ul de L-cystéine (12 mg / ml) dans 5 ml de DMEM / F12. Fraîchement préparer la solution de papaïne à chaque fois et stériliser avec un filtre de 0,22 um de taille de pores avant l'utilisation.
- Préparer une solution de lavage: préparer 100 ml d'une solution de lavage, ajouter 650 pl de glucose à 45%, 500 ul de HEPES 1 M et 5 ml de FBS dans 93,85 ml de DPBS 1x. Stériliser la solution de lavage avec un filtre de 0,22 um de taille de pores avant l'utilisation. Stocker la solution de lavage à 4 ° C pendant jusqu'à 2 mois.
- Préparer une solution d'insuline: préparer 2 ml de solution d'insuline, on ajoute une goutte de 25 ul de NaOH 10 N et 100 mg d'insuline dans 2 ml d'eau pour culture de tissus.
- Préparer des solutions EGF et FGF: Dissoudre les deux mitogènes dans DMEM / F12 à 100 pg / ml de concentration. Magasin en 10 aliquotes à -20 ° C.
- Préparer des milieux B-27 et N-2: stocker des suppléments de B-27 et N-2 à -20 ° C et 500 ul aliquotes de 1 ml, respectively.
- Préparer le milieu de condition Z différenciation: préparer 100 ml de milieu de condition Z différenciation, ajouter de l'insuline 40 ul (50 mg / ml), 500 ul de B-27, 1 ml de N-2, 650 pl de glucose à 45% et 1 ml d' 100 x pénicilline-streptomycine dans 97,81 ml de DMEM / F12. Stériliser l'état moyen Z de différenciation avec un filtre de 0,22 um de taille de pores avant l'utilisation. Stocker l'état moyen Z-différenciation à 4 ° C pendant 1 semaine.
- Préparer le milieu Z-condition: préparer 50 ml de Z-état de support, ajouter 10 ul de l'EGF et 10 pi de type FGF dans 50 ml de milieu de différenciation état Z-stérile (20 ng / ml). Conserver le milieu Z-état à 4 ° C pendant 1 semaine.
- Préparer une solution de revêtement pour la culture de la différenciation: pour 5 ml de solution de revêtement extracellulaire, ajouter 100 ul de la solution de matrice extracellulaire dans 4,9 ml de DMEM / F12 (par exemple, le Matrigel.). Décongeler une solution de matrice extracellulaire à 4 ° C sur de la glace. Une fois décongelés, conserver à 4 ° C pour up 2 semaines.
2. Dissection du cerveau adulte Zebrafish
- Préparer une dissection lit en remplissant un 100 mm x 15 mm boîte de Pétri avec des packs de glace de gel. Ensuite, placez le couvercle sur la boîte de Pétri et incuber à -20 ° C jusqu'à ce que les gels de gel. Au-dessus de la place du couvercle un carré de papier filtre propre et envelopper à la fois le papier filtre et boîte de Pétri avec un film plastique.
- Nettoyer et stériliser tous les instruments de microdissection par 70% d'éthanol ou de la chaleur avant chaque utilisation. Placez tous les instruments de dissection stérilisés près de la loupe binoculaire et, juste avant l'euthanasie, placer le lit de dissection au microscope avec éclairage à fibres optiques.
- Collecter 2 zebrafish adulte pour toute une préparation cerveau Neurosphère; et de 3 à 4 poisson zèbre pour générer des neurosphères à partir de régions du cerveau disséqué.
- Euthanasier zebrafish adulte (8-12 mois) en utilisant un protocole approuvé par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels. Ensuite, plonger le poisson dans 75% d'éthanol pendant 5-10 sec et rapidement dans le lit de dissection suivie par décapitation au niveau des branchies en utilisant une lame chirurgicale.
- Pour euthanasier les animaux, administrer une surdose (300 mg / L) de tricaïne méthanesulfonate jusqu'au battement de coeur de l'animal ralentit progressivement et la circulation arrête, puis plonger dans l'eau glacée.
- Tournez le côté dorsal de la tête vers le bas, et en utilisant les ciseaux faire une coupe longitudinale du côté de la coupe à la bouche. Utilisation de la pince exposer la base du crâne et enlever tout le tissu adjacent. Couper les parois latérales du crâne, à partir du début de la moelle épinière vers le tectum.
- À l'aide des ciseaux, couper et enlever les nerfs optiques, puis retirer les deux côtés de la partie la plus latérale du crâne au niveau du tectum. Tournez la tête ventrale vers le haut. En utilisant des pinces, retirez le reste de la partie la plus apicale du crâne.
- Transférez le cerveau ainsi que la partie restante du crâne dans un nouveau plat with le moyen de dissection (1.1). Nettoyer le tissu cérébral dans le milieu de dissection en utilisant la poignée en plastique du micro couteau, en gardant toutes les structures du cerveau intact.
- De ce point, continuer le protocole en utilisant l'ensemble du cerveau du poisson zèbre.
- Vous pouvez également adapter ce protocole à des régions spécifiques du cerveau pour générer neurosphères de tout le cerveau du poisson zèbre ou du télencéphale, tectum / diencéphale ou cervelet disséqués avec une nouvelle scalpel. Utilisez un fluorescent zebrafish lignée transgénique neuronal spécifique de neurones pour disséquer la région du cerveau d'intérêt selon la figure 3 et la référence 11.
3. cellule unique Dissociation de Brain Adult
- Effectuer tous les travaux ultérieurs dans une enceinte de sécurité biologique. Transférer le tissu du cerveau dans un tube de 1,5 ml contenant 800 pi de milieu de dissection (préparé à l'étape 1.1). Retirer le moyen de dissection par pipetage, sans toucher le tissu cérébral.
- Ajouter 500 pi de solution de papaïne (étape 1.4) et la digestion du tissu cérébral à 37 ° C pendant 10 min. Ne pas laisser incuber plus de 15 minutes car cela pourrait diminuer la viabilité cellulaire.
- Après incubation, transférer le tissu cérébral avec 500 pi de la solution de papaïne dans un tube conique de 15 ml en utilisant une pointe de pipette coupé 1000 pi à ~ 0,25 pouces du fond. dissocier délicatement le tissu cérébral par pipetage lentement de haut en bas 10 fois avec la même pointe. Ne pas pipeter monter et descendre plus de 15 fois et ne génèrent pas de bulles d'air lors de cette étape, car il pourrait altérer la viabilité des cellules.
- Incuber le tissu cérébral à nouveau à 37 ° C pendant 10 min suivie par pipetage de haut en bas 10-13 fois en utilisant un 1000 pi pointe régulière uncut. Ne pas pipeter monter et descendre plus de 15 fois, pour éviter la mort cellulaire.
- Arrêter la digestion enzymatique par addition de 2 ml de solution de lavage (étape 1.5) et centrifuger la suspension de cellules à 800 g pendant 5 min à température ambiante (TA). Décanter avec soin les supernatant et resuspendre le culot dans la solution restante en appuyant vigoureusement le tube avec un doigt, puis par pipetage de haut en bas avec une pointe régulière 1.000 pi. Ensuite, ajouter 2 ml de solution de lavage.
- A ce stade, vérifier sous le microscope qu'une seule suspension cellulaire a été obtenue. Centrifuger la suspension de cellules à nouveau à 800 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot en utilisant 1 ml de milieu Z-état frais (étape 1.10).
- Cellules Stain en utilisant trypan bleu 12 et compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre en excluant les cellules mortes bleu. Préparer une plaque de 24 puits avec 200 pi de suspension cellulaire et 300 pi de milieu Z-état frais dans chaque puits. cellules de semences à une densité de ~ 500 cellules / ul. Maintenir les cellules cultivées dans un incubateur à 30 ° C dans 5% de CO 2, puisque neurosphères cérébrales dérivés de poisson zèbre ne poussent pas bien à 37 ° C.
4. Génération de neurosphères primaire </ P>
- Après 1 jour in vitro (Div1), observer la suspension cellulaire unique obtenu à partir de l'ensemble du cerveau adulte sous le microscope et noter si des débris se sont accumulés dans le centre du puits. Retirez soigneusement les débris par pipetage environ 100 pi de milieu (moins si possible). Ensuite, ajoutez 100 pi de milieu Z-état frais. Des suspensions de cellules simples doivent être observées à ce moment (Figure 2A Div1).
- Après 2 jours in vitro (DIV2), développez les cellules cultivées. En utilisant une pipette de 1000 pi avec la coupe de pointe, recueillir et transférer 250 pi de suspension de cellules de chaque puits dans un nouveau puits. Ajouter 250 pi de milieu Z-état frais dans tous les puits. Avant de développer les cellules en culture, homogénéiser la suspension très doucement par pipetage de haut en bas tout au long du puits.
- Répétez les étapes 4.1 et 4.2 pour les 4 jours suivants in vitro (DIV4). Une augmentation progressive de la taille des neurosphères devrait être visible au centre et les bords du puits à DIV3 et DIV4 (Figure 2B et C).
Note: neurosphères primaires peuvent être traitées pour le passage ou la différenciation pour évaluer multipotence. Alternativement, ils peuvent être traités pour nucléofection ou lipo-transfection 11 pour caractériser le rôle des gènes spécifiques pendant le processus de différenciation.
5. repiquage de Neurosphères primaire
- Prélever 250 ul de culture de tissu provenant de chaque puits et à se dissocier mécaniquement neurosphères DIV4 avec une pipette de 1 ml. Ne pas pipeter et trop rapidement que la formation de bulles d'air peut augmentation de la mort cellulaire.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre et distribuer 800 cellules / ul dans 250 pi de surnageant de culture primaire dans chaque puits d'une plaque de 24 puits.
- Ajouter 250 pi de milieu Z-état à chaque puits.
- Après 2 jours in vitro (DIV2), développez les cellules cultivées comme indiqué dans l' étape 4.2 uned 4.3.
6. Différenciation des neurosphères primaires
- Stériliser verres de couverture par immersion dans 70% d'éthanol pendant 10 min, verres de couverture puis sèche à la température ambiante en les plaçant dans chaque puits d'une plaque de 12 puits.
- Ajouter 300 pi de solution de revêtement extracellulaire (étape 1.11) au centre de la vitre de recouvrement d'une manière telle qu'elle puisse s'étendre largement et couvrir la totalité du verre de couverture. Ensuite, on incube à 37 ° C pendant 1 h (à l'aide de la cellule humidifiée incubateur de culture).
- Retirer la solution de revêtement extracellulaire après incubation, et sécher le verre de couverture pendant 2 heures à 37 ° C.
- Prélever 250 ul de culture de tissu provenant de chaque puits. Mécaniquement dissocier tous les primaires neurosphères DIV4 par puits avec une pipette de 1 ml (avec embout plus fin) par pipetage de haut en bas.
- Semences dissocie les suspensions cellulaires neurosphères à une densité cellulaire de 4 x 10 3 cellules / ml sur couvre - objets de la matrice extracellulaire revêtues préalablement préparées (étape 6.1-6.3) et la maintenir pendant au moins 30 min, à 30 ° C dans 5% de CO 2, jusqu'à fixée au substrat. Retirez ensuite le milieu de culture et d' ajouter rapidement 1 ml d'état moyen Z-différenciation frais préchauffé (étape 1.9) avant de cultiver les cellules pendant 24 heures à 30 ° C dans 5% de CO 2.
- Tous les deux jours, à remplacer la moitié du milieu de condition Z différenciation pendant la période de différenciation cellulaire.
7. Gene Manipulation de Neurosphères primaire
- Collecter DiV3-4 neurosphères primaires (étape 4.3) par centrifugation pendant 8 min à 80 x g à 4 ° C. Préparer pour liposome transfection de oligonucleoatides commerciales comme previouly décrit 11 ou nucléo-transfection de vecteurs d' ADN plasmidique.
- Remettre en suspension neurosphères pastille à une densité cellulaire de 4 x 10 3 cellules / ul dans 100 ul d'un mélange réactionnel (solution nucleofactor 82 pi et 18 pi de complément).
- Mélanger la suspensi Neurosphèreavec 5 pi des vecteurs d'ADN plasmidique de choix (stocks de plasmide à 1 pg / pl). Transférer le mélange Neurosphère / ADN dans une cuvette de Nucleofector pour nucleotransfection et sélectionnez Nucleofector programme selon les instructions du fabricant fournies par le kit de Nucleofector.
- Immédiatement après nucléofection, ajouter un volume de 500 ml de milieu Z état préchauffé (1,10) aux cellules et la plaque neurosphères transfectées pour l'étude de leur renouvellement cellulaire et / ou des propriétés de différenciation, tels que décrits ci-dessus.
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Representative Results
Schéma général de l'adulte Zebrafish Neurosphère Culture
Nous décrivons ici toutes les étapes du protocole d'un essai de Neurosphère formation effectuée à partir du cerveau adulte zebrafish. Tout d' abord, les cellules souches / progénitrices neurales adultes ont été recueillis soit à partir du poisson zèbre ensemble du cerveau ou de plusieurs régions du cerveau disséqués comme le télencéphale, le tectum et le cervelet (figures 1A à C). Seule cellule suspension de cellules souches / progénitrices neurales adultes ont ensuite été utilisées pour générer flottant et neurosphères d'auto-renouvellement (figures 1D, E). Enfin, neurosphères ont contribué à l' étude de l'aval et de la régulation de l'expression des gènes codant ou petits ARN non codants 11 afin d'étudier leur rôle dans la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices neurales de poisson zèbre.
neurosphères primaires Zebrafish peuvent se renouveler après plusieurs passages. Pour générer neurosphères au passage 1 et 2, les étapes 5.1-5.4 ont été répétées deux fois, dans un total de 6-8 jours. A partir DiV2-4, la taille des neurosphères a augmenté jusqu'à environ 50 um de diamètre. Neurosphères secondaires et tertiaires ont également été obtenues après le passage 1 et 2, respectivement (figure 2D). A Passage 3, neurosphères de poisson zèbre ont cependant été incapables de grandir à la taille critique de 50 um de diamètre et ont échoué à l' auto-renouvellement, ce qui suggère que notre condition de culture sélectionne plutôt un pool de cellules souches / progénitrices d'une population pure de cellules souches neurales 4 .
neurosphère Différenciation
neurosphères primaires, secondaires ou tertiaires dérivées de l'whole cerveau ou de la télencéphalique cérébelleuse et la zone tectale de poisson-zèbre adultes ont été testés pour leurs potentialités de différenciation. Entre 1 et 3 jours in vitro dans des conditions de différenciation (DiVd1-DiVd3), une monocouche de cellules adhérentes a été observée (figures 3A, B). Comme le montre la figure 3C, à DiVd4, axonale comme des projections ainsi que des cellules gliales étaient visibles et distinguables par l' expression immunohistochimique ou d'un gène analyse 11, l' évaluation que les cellules souches neurales / progénitrices se sont différenciées. De même, les neurones et les cellules gliales différenciées des neurones cellules souches / progénitrices isolées à partir de différents territoires du cerveau (figures 3D, E).
Gene Expression Manipulation en Zebrafish Neurosphères
Nous avons testé le rôle de miR-107 sur la différenciation neuronale et gliale de toute zebrafish cerveau-de les cellules souches / progénitrices neurales rivé (figure 4). Nous avons montré que la régulation à la baisse miR-107 par l' anti-miR-107 n'a pas affecté la formation de neurosphères , mais la différenciation neuronale altérée, comme indiqué par la croissance anormale des processus axonaux (figures 4A, B). l'expression génique par RT-PCR analyses ont confirmé que l'inhibition de miR-107 conduit à une augmentation de l'expression à la fois du neuroblastes marqueur Neurogenin-1 (NGN-1) et les molécules spécifiques à l'axone, telles que la carte-2 et d'α-tubuline, sans affecter les cellules gliales l' expression du marqueur de cellules (S-100, GFAP, Olig2) (figure 4C). Par conséquent, le gain de miR-107 expression par miR-107-mimétique induit une diminution de l' expression du marqueur spécifique axone neuroblast- et (Figure 4D), l' évaluation que, in vitro, miR-107 agit en tant que régulateur de la différenciation neuronale au cours de la neurogenèse zebrafish 11.
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Figure 1:. Représentation schématique du protocole Étapes Les procédures et le calendrier associé comprennent la dissection soit ensemble du cerveau ou de la télencéphalique, tectal et régions cervelet du cerveau adulte zebrafish (A, B), l'obtention d'une suspension cellulaire unique (C ), la génération de neurosphères flottants (D) et la différenciation des neurosphères (E).
Figure 2: Formant Neurosphères Zebrafish dérivé du cerveau. (A - C) des images à contraste de phase représentatif de neurosphères entiers du cerveau dérivés primaires flottants observés au jour 1 (Div1, A), jour 3 (DIV3, B) et le jour 4 (DIV4, C). (D) Graphique représentant le nombre relatif de neurospheres à Passages 1 et 2 par rapport au nombre de Neurosphère au Passage 0. Après passage 2, neurosphères formation a été considérablement diminué. Barre d'échelle: 25 um.
. Figure 3: Différenciation des neurosphères Zebrafish dérivé du cerveau (A - C, E) des images à contraste de phase de neurosphères cérébrales dérivées entiers cultivés dans le milieu Z différenciation durant 1 (A, DiVd1), 3 (B DiVd3) et 4 (C et D, DiVd4) jours. Vue (E) Dorsale de l'ensemble du cerveau d'un 12 mois vieux Tg (GFAP: DsRed) zebrafish. Le télencéphale (Tel), tectum (Tec) et le cervelet (Cer) ont été disséqués et recueillis comme indiqué. (D) Images de neurosphères DiVd4 dérivées du tectum, télencéphale et le cervelet au Passage 0 (P0), 1 (P1) Et 2 (P2). Barre d'échelle: 25 um.
Figure 4:. Analyse des Neurosphères Formé suivant MiR107 Manipulation des images (A) de contraste de phase montrant neurosphères Div4d traités à DIV4 avec les oligonucléotides indiqués. Les boîtes noires dans les panneaux supérieurs indiquent la zone agrandie dans les panneaux de fond. (B) Haut graphique représente la quantification du nombre de neurosphères formés avec, ou sans, miR107. Neurosphères sont sous-groupes en par leur taille (20 à 30 pm, 31-50 pm,> 51 um de diamètre). graphique du bas indique la quantification des projections axonales de neurosphères traités et sous regroupés comme ci-dessus. (C, D) qRT-PCR analyse de l' expression des gènes indiqués par neurosphères Div4d précédemment traités avec des oligonucléotides indiqués à DIV4. Les données représentent lamoyenne ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: scramble. Barre d'échelle: 25 um.
| Problème | raison possible | Solution |
| Récupération de trop de cellules mortes | Temporisation dans la préparation du cerveau avant traitement enzymatique | Assurez-vous que la dissection mis en place et les médias sont prêts avant de sacrifier le poisson (aussi vérifier la stérilité, de la température) |
| le traitement à la papaïne stringent | dissociation mécanique doit être suffisamment sensible pour générer une suspension unique de cellules vivantes, mais suffisamment forte pour éviter de laisser derrière un trop grand nombre des amas de tissu. Respecter les temps et les températures recommandées pour des périodes d'incubation / centrifugation | |
| Neurosphères ne semblent pas ou poussent mal | température incorrecte | Vérifier que incubateur réglé à 30 ° C fournit le ctempérature orrect. |
| sphères croissantes enlevées par des débris | Pour chaque puits, l'aspiration des débris doit être bien effectuée sur le dessus du support. Éviter d'entrer dans le milieu avec votre pipette | |
| L'intégrité de certains réactifs (supplément de B27, EGF, FGF) est affaibli | Cette intégrité constitue des facteurs limitants de la croissance cellulaire. Vérifiez le numéro de lot, et la façon dont les échantillons ont été conservés. Éviter le dégel / recongeler cycles de tout réactif échantillonné utilisés dans la culture | |
| Présence de cellules individuelles | Mode de transfert / extension de neurosphères est trop sévère | Cette étape est une étape d'expansion / de dilution parce que trop de sphères sont formées dans le puits. Évitez collection sphère dure pendant le transfert pour empêcher la dissociation Neurosphère en cellules individuelles |
| Absence de cellules sur le matrigel | Matrigel n'a pas été correctement décongelé / dilué | Matrigel de -20 ° C a besoin d'au moins 30 min à 4 ° C pour fondre et reste soigneusement Pipeter visqueux |
| Pas d'adhérence sur matrigel | Le volume de la suspension cellulaire doit être suffisamment faible pour permettre le dépôt de cellules sur la couche de Matrigel | |
| Prévoir plus de temps pour le dépôt de cellules (jusqu'à 2 h si des volumes plus importants sont utilisés) | ||
| milieu de différenciation frais trop froid | Lors du remplacement du milieu cellulaire attachement, le milieu de différenciation doit être réchauffé à 30 ° C pour éviter un choc thermique sur les cellules déposées | |
| Pauvre nucléofection | Les cellules mortes | Assurez-vous que vous ne génèrent pas de bulles d'air tout en effectuant nucléofection. Utilisez des vecteurs d'ADN de haute qualité en utilisant Maxi-préparation. Au moins 1 - 2 h après nucléofection, remplacer le milieu de culture à l'aide soit du milieu de la condition Z-différenciation frais ou moyenne Z-état. |
| Peu de neurosphères positifs | Neurosphères de tailles différentes peuvent conduire à une mauvaise nucléofection. Utilisation de neurosphères à DIV2 et DIV3 sont idéales pour nucléofection. La densité des cellules ne doit pas dépasser 4 x 10 3 neurosphères ml -1 dans une réaction de 100 ml. |
Tableau 1: Dépannage Conseils Liste, pour chaque étape du protocole, les questions possibles et les solutions pour les surmonter.
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Discussion
L'objectif principal de ce protocole est d'isoler et de la culture adulte poisson zèbre neurosphères cérébrales dérivées pour étudier les caractéristiques cellulaires et moléculaires de cellules souches / progénitrices neurales. Ici, nous rapportons comment sélectionner les cellules neurales pluripotentes et de générer les trois types de cellules neurales, à savoir, les astrocytes, neurones et les oligodendrocytes, du cerveau adulte zebrafish. Le protocole est très significatif car un essai de Neurosphère formation reproductible n'a pas été établi dans le zebrafish jusqu'à présent.
Quelques étapes critiques dans le protocole doivent être respectés et ont été recapitutaled dans les conseils de dépannage (tableau 1). Tout d'abord, la mort cellulaire se produit à la fois pendant la dissection du cerveau adulte de poisson zèbre et la procédure de suspension cellulaire unique. Afin de limiter l'étendue de la mort cellulaire, il est essentiel d'utiliser des outils propres et nettes, ainsi que de respecter strictement le calendrier et la température d'incubation recommandée dans le présent protocol. En second lieu, la culture de neurosphères doit être réalisée avec des milieux fraîchement préparés et avec une technique de pipetage avec soin. Troisièmement, des recommandations de densité cellulaire doivent être suivies pour obtenir le renouvellement fiable ou la différenciation des cellules de neurosphères. Avec cela à l'esprit, l'homme de techniques de culture cellulaire devrait être en mesure d'utiliser le protocole et réaliser l'isolement, la culture et la manipulation des gènes neurosphères cérébrales dérivés de poisson zèbre adulte.
Les essais de la sphère de formation dans le zebrafish souffre des mêmes limitations décrites précédemment chez les mammifères 4: 1) le comportement des cellules souches / progénitrices neurales est modifié à la suite de leur isolement de leur niche naturelle dans le cerveau; 2) ne sont pas neurosphères une population homogène de cellules souches, mais incluent des cellules souches, des cellules progénitrices, ainsi que des cellules différenciées post-mitotiques. Il est d'ailleurs intéressant de noter que notre protocole génère des cultures de neurosphères aclonal. La densité cellulaire des cultures estun paramètre critique dans des essais de sphère de formation car il détermine clonalité, à savoir si la culture est clonale, semi-clonal ou aclonal. conditions clonales permettent de caractériser et quantifier les différents pools de cellules souches et progénitrices présentes dans la culture avec précision. Nous ne sommes pas en mesure d'effectuer des tests de clonalité des cellules jusqu'à présent et nos conditions de culture ont encore besoin de plus d'optimisation avant que nous puissions distinguer les cellules souches neurales à partir d'autres pools de cellules progénitrices.
cultures de neurosphères Zebrafish peuvent être utilisés pour une large gamme d'expériences. Elles permettent l' analyse de l' expression du gène ainsi que la manipulation de l' expression génique au cours de la neurogenèse , comme illustré par notre étude évaluant miR-107 dans la détermination de la fonction spécifique du tissu neuronal du destin cellulaire (figure 4 et 11). D'autres applications comprennent des stratégies d'édition du génome, tels que le système de CRISPR / cas9, afin de tester le rôle des gènes souches / progénitrices neurales dans neurogenesis et réparation du cerveau 13. Enfin, notre protocole montre que neurosphères poisson zèbre peuvent provenir de différentes régions du cerveau ouvrant la possibilité d'étudier les caractéristiques des neurones et des cellules gliales spécifiques à la région et explorer la base cellulaire et moléculaire de l' hétérogénéité des cellules neuronales dans différents domaines ventriculaires du cerveau zebrafish 14 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
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