Summary
ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。
Introduction
哺乳動物の神経幹細胞（NSCは）分裂細胞のクラスターは、神経球1と呼ばれるように自由に浮遊培養物中で成長する能力により、in vitroで特徴づけられています。上皮成長因子（EGF）及び線維芽細胞増殖因子（FGF）の存在下では、NSCは、すなわち 、二つの異なる娘細胞を生成するために、非対称自己再生のNSCを生成するためにいずれかの対称的に分裂し、または、分化前駆細胞および新規NSCを。ニューロスフェア培養物は、したがって、神経幹/前駆細胞とより分化した神経細胞2-4の混合物であるNSCは、しかし、2つの特定の特性によって、他の神経球の細胞型と区別することができます。彼らは自由に長期の自己再生を表示します文化を浮遊し、それらは、細胞外マトリクス基板への成長因子の撤退と、接着以下のすべての神経細胞系統（ すなわち 、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト）に分化することができます。 mammでALS、神経球培養系は成体脳におけるNSCの存在を示すために使用されるインビトロ系において最初であり、神経幹細胞および前駆細胞の増殖、自己再生能と多分化を分析するための最も一般的に使用されるツールのままです。したがって、球形成アッセイは、いくつかの欠点や限界4苦しむもかかわらず、この培養系は、そのインビボニッチ4から除去され、重要な調節因子を同定することに尽力してきたときに、幹細胞として振る舞うために、細胞の可能性を評価するための価値がありますNSC自己複製と細胞の運命決意5-7の。
成体の神経発生が制限されている哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュは、構成的に、その生涯を通じて脳全体軸に沿って、新しいニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ成体の脳は、ゼブラフィッシュにトンを理解するための強力なモデル生物を作る神経幹/前駆細胞を保有する複数の神経因性ニッチを表示します彼は、細胞、脳内の活動だけでなく、中枢神経系の再生に必要な分子プログラムを食い止めます。過去17年間で、いくつかの研究グループは、単離およびゼブラフィッシュ神経細胞8,9を培養するための方法論を開発しました。これらの研究は、 インビトロではなく、NSCのを維持し、その特性を調査で胚性神経細胞およびグリア細胞を産生することを目的としました。ニューロスフェアは、大人Apteronotusのleptorhynchus（ブラウンゴーストKnifefish）10で生成されているが、ゼブラフィッシュにおけるニューロスフェア形成アッセイが確立されて残りました。
ここでは、ゼブラフィッシュの神経新生11中のmiR-107の役割を実証するためのニューロスフェア形成アッセイを説明します。プロトコルが可能になります。1）ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋、および小脳などのいくつかの解剖脳領域からいずれかの成体神経幹細胞/前駆細胞のコレクションです。 FLの2）の生成浮動および成体神経幹/前駆細胞からの自己再生の神経球。 3）ダウンとアップレギュレーションをコードする遺伝子または小さな非コードRNAニューロスフェア中の11の発現のためには、神経幹/前駆細胞の増殖および分化における役割を調査します。
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Protocol
WT CF株のゼブラフィッシュは、イェール大学施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号2012から11473）によって承認されたプロトコルに従って上昇し、維持しました。全ての実験は、最初の研究目的のための動物の使用に関する遺体を規制するすべての関連する政府や機関の倫理によって承認されなければなりません。
1.準備
- 解剖培地10mlを準備し、DMEM / F12の9.8ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシンの200μlを添加します。
- L-システイン溶液を調製する：組織培養のための水10ミリリットルに、L-システイン120mgのを追加します。 2週間まで4℃でL-システインソリューションを保存し、または1年まで-20℃でアリコートインチ
- 組織培養のための水の1ミリリットルに、DNアーゼIのショップまで2ヶ月間4℃でのDNase I溶液10mgを追加：DNアーゼI溶液を準備します。
- パパイン溶液を調製する：パパインsolutを準備しますイオンは、DMEM / F12の5ミリリットルに100μlのパパイン（約140台）、100μlのDNアーゼI（1％）と200μlのL-システイン（12 mg / mlで）を追加します。新たにパパイン溶液を毎回調製し、使用前に0.22μmの孔サイズのフィルターを用いて滅菌します。
- 洗浄溶液を調製：93.85 mlのDPBS 1Xに650μlのグルコースを45％、500μLのHEPES、1M、5mlのFBSを追加し、洗浄溶液100mLを調製しました。使用前に0.22μmの孔径のフィルターを有する洗浄溶液を滅菌します。最大2ヶ月間4℃で洗浄液を保管してください。
- インスリン溶液を調製する：組織培養用の水2mlに10 N NaOHおよび100mgのインスリンの25μlの液滴を追加し、インスリン溶液2mlを調製します。
- EGFとFGF溶液を調製する：100μg/ mlの濃度でDMEM / F12の両方でマイトジェンを溶かします。 -20℃で10μlのアリコートとして保管してください。
- 500μlの、1mlのアリコートとして-20℃で保存のB-27およびN-2は、サプリメント、respectiv：B-27、N-2メディアを準備しますエリー。
- Z-分化条件培地を準備します、Z-分化条件培地の100ミリリットルを準備40μlのインスリン（50 mg / mlで）、500μlのB-27、1ミリリットルN-2、650μlのグルコース45％および1ミリリットルのを追加しますDMEM / F12の97.81ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシン。使用前に、0.22μmの孔サイズのフィルタを有するZ-分化条件培地を滅菌します。 1週間まで4℃でZ-分化状態媒体を保管してください。
- Z-条件培地を準備します、Z-条件培地の50ミリリットルを準備滅菌Z-分化条件培地の50ミリリットル（20 ngの/ ml）の中にEGFを10μlとFGFの10μlを添加します。 1週間まで4℃でZ-条件媒体に保管してください。
- 5ミリリットル外塗布液に、DMEM / F12の4.9ミリリットルに細胞外マトリックス溶液（ 例えば 、マトリゲル。）の100μlを添加する：分化培養用の塗布液を準備します。氷の上で4℃で細胞外マトリックス溶液を解凍します。一度解凍し、uのために4℃で維持2週間のp。
大人のゼブラフィッシュの脳の2解剖
- ゲルアイスパック100ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿を充填することにより解剖ベッドを準備します。その後、シャーレに蓋を置き、ゲルがフリーズするまで、-20℃でインキュベートします。蓋の場所の上にきれいなろ紙の正方形とプラスチックフィルムで濾紙とシャーレの両方をラップします。
- 清潔で、各使用前に70％エタノールまたは熱により、すべての顕微解剖器具を滅菌します。解剖顕微鏡の近くにすべて滅菌解剖器具を置き、右安楽死の前に、光ファイバ照明で顕微鏡下で解剖ベッドを配置します。
- 全脳の神経球の調製のための2大人のゼブラフィッシュを収集。 3〜4ゼブラフィッシュは、解剖脳領域からのニューロスフェアを生成します。
- 施設内動物管理使用委員会により承認されたプロトコルを使用して、大人のゼブラフィッシュ（8-12カ月齢）を安楽死させます。次に、7で魚を浸しますすぐに5％5-10秒間エタノールおよび外科刃を用いて鰓のレベルで断頭続い解剖ベッドに置きます。
- 動物を安楽死させるために、動物のハートビートが徐々に遅くなり、循環が停止するまでトリカインメタンスルホン酸の過剰摂取（300ミリグラム/ L）を投与し、その後、氷水に浸します。
- ダウンヘッドの背側を回して、ハサミを使って口にカット側から長手方向のカットをします。鉗子を使用すると、頭蓋底を露出させ、隣接するすべての組織を除去します。蓋に向かって脊髄の先頭から頭蓋骨の横方向の壁をカットします。
- はさみを使用して、視神経を切断して除去した後、蓋のレベルで頭蓋骨の最も外側部の両側を削除します。頭部腹側を上に回します。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も先端部の残りの部分をはがします。
- 新しい皿のwiに頭蓋骨の残りの部分で脳に沿って転送します解剖培地（1.1）番目。すべてそのまま脳構造を維持し、マイクロナイフのプラスチック製のハンドルを使用して、解剖培地中の脳組織を清掃してください。
- この点から、全体のゼブラフィッシュの脳を使用してプロトコルを続けます。
- あるいは、新鮮なメスで切開し、全体のゼブラフィッシュの脳から、または終脳、蓋/間脳や小脳からのニューロスフェアを生成するために、特定の脳領域に、このプロトコルを適応させます。 図3および参照11によれば、関心の脳領域を分析するために、神経特異的な蛍光ゼブラフィッシュの神経トランスジェニック系統を使用してください。
成人の脳の3単一細胞解離
- 生物学的安全キャビネット内の後続のすべての作業を実行します。解剖培地800μlのを含む1.5 mlチューブに脳組織を転送する（ステップ1.1で調製しました）。脳組織に触れることなく、ピペットで解剖媒体を削除します。
- パパイン溶液（ステップ1.4）の500μlを添加して、10分間37℃で脳組織を消化。それは、細胞生存率を減少させることができたとして、15分以上インキュベートしないでください。
- インキュベーション後、下から〜0.25インチ1,000μlのピペットチップカットを使用して、15ミリリットルコニカルチューブにパパイン溶液500μlで脳組織を移します。静かにゆっくりと同じチップで上下に10回ピペッティングすることにより脳組織を解離します。アップピペットと15倍以上ダウンし、それが細胞の生存率を変化させる可能性があるので、このステップの間に空気の泡を生成しませんしないでください。
- ノーカット千μlの定期的なチップを用いてダウン10-13回ピペッティングし、続いて37℃で10分間、再び脳組織をインキュベートします。アップピペットと15回以上ダウンし、細胞死を回避するためにしないでください。
- 室温で5分間（RT）、800×gで洗浄液（ステップ1.5）、遠心2mlの細胞懸濁液を添加することにより酵素消化を停止します。慎重秒をデカントupernatant 1,000μlの定期的な先端でピペッティングすることによっておよびダウン激しく指で、次いでチューブをタップして、残りの溶液中にペレットを再懸濁。次に、洗浄液の2ミリリットルを追加します。
- この段階では、単一細胞懸濁液が得られたことを顕微鏡で確認してください。室温で5分間、800×gで再び細胞懸濁液を遠心します。上清を除去し、新鮮なZ-条件培地（ステップ1.10）の1ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。
- トリパンブルー12とを用いて、染色細胞は青色の死細胞を除くことにより、血球計数器を使用して生細胞を数えます。各ウェルに200μlの細胞懸濁液と新鮮なZ-条件培地300μlで24ウェルプレートを準備します。 〜500細胞/μlの密度でシード細胞。ゼブラフィッシュ脳由来のニューロスフェアは、37℃でよく成長しないので、5％CO 2で30℃のインキュベーターで培養した細胞を維持します。
一次ニューロスフェアの4世代</ P>
- in vitroでの 1日（DIV1）した後、顕微鏡下で成人の全脳から得られた単一細胞懸濁液を観察し、破片がウェルの中心部に蓄積されたかどうかに注意してください。慎重に（可能な場合はそれ以下）の媒体のおよそ100μLをピペットで任意の破片を除去します。次に、新鮮なZ-条件培地100μlを追加します。単一細胞懸濁液は、この時点（ 図2A DIV1）で観察されるはずです。
- in vitroでの 2日間（DIV2）の後、培養細胞を展開します。先端カット1,000μlのピペットを使用して、収集し、よく新しいに各ウェルからの細胞懸濁液の250μlのを転送します。すべてのウェルに新鮮なZ-条件培地250μlのを追加します。培養細胞を拡大する前に、よく全体に上下にピペッティングすることにより、非常に穏やかな懸濁液を均質化します。
- 繰り返しは、 インビトロで 、次の4日間（DIV4）のための4.1と4.2を繰り返します。ニューロスフェアの大きさの漸進的増加は、viのでなければなりませんDIV3及びDIV4（ 図2BおよびC）を中心とウェルの縁部でsible。
注：一次ニューロスフェアは、通路または多分化を評価するための分化のために処理することができます。あるいは、それらは、分化プロセス中の特定の遺伝子の役割を特徴付けるためにヌクレオまたはリポフェクション11のために処理することができます。
一次ニューロスフェアの5継代
- 各ウェルからの組織培養の250μlのを削除し、機械的に1ミリリットルピペットでDIV4のニューロスフェアを解離します。気泡形成が細胞死を増加させ得るような、あまりにも急速に上下にピペットとしないでください。
- 血球計数器で細胞をカウントし、24ウェルプレートの各ウェルに初代培養上清250μlの中に800細胞/μLを配布します。
- 各ウェルにZ-条件培地250μlのを追加します。
- ステップ4.2で報告されているように、in vitroで 2日（DIV2）の後、培養細胞を拡大D 4.3。
一次ニューロスフェアの6分化
- 12ウェルプレートの各ウェルにそれらを配置することにより、室温で乾燥したカバーガラスその後、10分間、70％エタノールに浸してカバーガラスを滅菌します。
- それは広く拡大し、全体のカバーガラスを覆うことができるようにカバーガラスの中央に細胞外コーティング液（ステップ1.11）の300μLを加えます。そして、（加湿細胞培養インキュベーターを使用して）1時間37℃でインキュベートします。
- インキュベーション後、細胞外のコーティング溶液を除去し、37℃で2時間、カバーガラスを乾燥させます。
- 各ウェルからの組織培養の250μlのを削除します。機械的に上下にピペッティングにより（より広いエンドチップ付き）1ミリリットルピペットでウェル当たりすべてDIV4の一次ニューロスフェアを解離。
- 種子は、（先に調製した細胞外マトリックスでコーティングしたカバーガラス上に4×10 3細胞/ mlの細胞密度でステップ6.1から6のニューロスフィア細胞懸濁液を解離しました。3）基板に付着するまで、5％CO 2中、30℃で、少なくとも30分間保ちます。その後、培地を除去し、迅速に5％CO 2中で30℃で24時間、細胞を培養する前に、予め温めておいた新鮮Z分化条 件培地（ステップ1.9）を1ml加えます。
- 2日毎に、細胞differentationの時間の間にZ-分化条件培地の半分を交換してください。
一次ニューロスフェアの7遺伝子操作
- 4℃で80×gで8分間遠心分離することによりDiV3-4一次ニューロスフェア（ステップ4.3）を収集します。 previouly DNAプラスミドベクターの11または核-トランスフェクションに記載されているように商業oligonucleoatidesのリポソームトランスフェクションのために準備します。
- 反応混合物を100μl（82μlのnucleofactor液とサプリメントの18μl）を4×10 3細胞/μlでの細胞密度で再懸濁し、ニューロスフェアのペレット。
- 神経球をミックスsuspensi（1μgの/μlのでプラスミド株）選択肢のDNAプラスミドベクターの5μlを持つ上。 nucleotransfectionのためのNucleofectorキュベットに神経球/ DNA混合物を移し、ヌクレオキットが提供するメーカーの指示に従ってプログラムをヌクレオ選択します。
- すぐヌクレオ後、細胞を予め温めZ条件培地（1.10）を500mlの容量を追加し、上記のように、それらの細胞の再生および/または分化の特性を研究するためのトランスフェクトされた神経球をプレート。
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Representative Results
アダルトゼブラフィッシュ神経球文化の一般的スキーム
ここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から行っニューロスフェア形成アッセイのプロトコルのすべての手順を説明します。まず、成体神経幹細胞/前駆細胞は、ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋および小脳（ 図1A-C）などのいくつかの解剖脳領域のいずれかから収集されました。成体神経幹/前駆細胞の単一細胞懸濁液をフローティングと自己再生ニューロスフェア（ 図1D、E）を生成するために使用されています。最後に、ニューロスフェアは、ダウンを研究する上で、アップレギュレーションゼブラフィッシュ神経幹/前駆細胞の増殖および分化における役割を調べるためにコードする遺伝子または小さな非コードRNA 11の発現の尽力してきています。
ゼブラフィッシュの一次ニューロスフェアは、いくつかの通路を、以下の自己再生することができます。継代1および2でのニューロスフェアを生成するには、5.1から5.4までは6-8日間の合計で、二回繰り返しました。 DiV2-4からは、ニューロスフェアの大きさは直径50μm程度にまで増加しました。第二および第三神経球はまた、継代1及び2であった（ 図2D）の後に得られました。パッセージ3では、ゼブラフィッシュの神経球は直径50μmの重要なサイズで育つができなかったと自己複製に失敗した、私たちの培養条件ではなく、神経幹細胞4の純粋な集団よりも、幹細胞/前駆細胞のプールを選択することを示唆しています。
神経球分化
どちらかwhol由来、第一、第二または第三ニューロスフェア電子脳または終脳、小脳と大人のゼブラフィッシュのtectal領域からは、それらの分化の潜在能力について試験しました。分化条 件（DiVd1-DiVd3）のin vitroでの 1と3日の間、付着細胞の単層（ 図3A、B）が観察されました。 図3Cに示すように、DiVd4で、凸部だけでなく、グリア細胞のような軸索 は、免疫組織または遺伝子発現によって可視光と区別可能であった神経幹/前駆細胞が分化したことを評価し、11を解析します 。同様に、ニューロンおよびグリア細胞は、脳の異なる地域（ 図3D、E）から単離された神経幹/前駆細胞から分化しました。
ゼブラフィッシュ神経球における遺伝子発現操作
私たちは、全体のゼブラフィッシュの脳ドのニューロンとグリア分化に対するのmiR-107の役割をテストしています rived神経幹/前駆細胞（ 図4）。私たちは、軸索突起の異常成長（ 図4A、B）で示すように、抗のmiR-107によるのmiR-107のダウンレギュレーションは、ニューロスフェア形成するが、変更された神経分化に影響を与えなかったことを示しました。 RT-PCR遺伝子発現は、miR-107の阻害は、グリアに影響を与えることなく、神経芽細胞マーカーニューロゲニン-1（NGN-1）と、このようなMAP-2及びαチューブリンのような軸索特異的分子の両方の発現増加をもたらすことが確認分析します細胞マーカーの発現（S-100、GFAP、OLIG2）（ 図4C）。したがって、によってのmiR-107の発現のゲインのmiR-107-模倣は、ゼブラフィッシュの神経発生時の神経分化の調節因子として、in vitroで 、のmiR-107の行為、ということを評価し、neuroblast-と軸索特異的なマーカー発現（ 図4D）の減少を誘導し11。
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図1：プロトコル手順の概略図で手続きと関連するタイミングは、脳全体または終脳、tectalと大人のゼブラフィッシュの脳（A、B）の小脳領域のいずれかの解剖、単一細胞懸濁液（Cの獲得を含みます）、浮遊ニューロスフェア（D）、および神経球の分化（E）を生成します。
図2：ゼブラフィッシュ脳由来神経球を形成します 。 （A - C）全脳由来の初代浮遊ニューロスフェアの代表的な位相コントラスト画像は、3日目、1日目（DIV1、A）で観察された（DIV3、B）と4日（DIV4、C）。 NEの相対的な数を表す（D）チャートパサージュ2後パッセージ0で神経球数に比べて通路1と2でurospheresは、ニューロスフェアの形成が大幅に減少しました。スケールバー：25μmで。
。図3：ゼブラフィッシュ脳由来神経球の分化 （A - C、E）1中のZ-分化培地で培養し、全脳由来のニューロスフェアの位相差画像（A、DiVd1）、3（B、DiVd3）と4 （C及びD、DiVd4）日。ゼブラフィッシュ：12ヶ月齢のTg（DsRedのGFAP）の全脳の（E）背ビュー。終脳（電話番号）、蓋（テック）と小脳（CER）が解剖し、示されるように収集しました。 （D）パッセージ0（P0）で蓋、終脳と小脳由来DiVd4のニューロスフェア、1（P1の画像）及び2（P2）。スケールバー：25μmで。
図4：示されたオリゴヌクレオチドでDIV4で処理Div4d神経球を示すMiR107操作後に形成神経球の分析 （A）位相コントラスト画像。トップパネルにあるブラックボックスは、下のパネルで拡大領域を示します。 （B）トップチャートは、またはmiR107、なしで形成された神経球の数の定量化を表します。ニューロスフェアは、そのサイズ（20〜30ミクロン、31から50ミクロン、直径が> 51ミクロン）によりサブグループされています。ボトムチャートは、処理され、サブは、上記のようにグループ化されたニューロスフェアからの軸索投射の定量化を示しています。以前DIV4で示されたオリゴヌクレオチドで処理されたDiv4d神経球によって示された遺伝子の（C、D）定量RT-PCR発現解析。データが表します平均±SEM、* P <0.05、N = 3のScr：スクランブル。スケールバー：25μmで。
| 問題 | 考えられる理由 | 溶液 |
| あまりにも多くの死細胞の回復 | 酵素処理の前に脳を調製するのに時間遅延 | 解剖が設定を確認し、メディアが魚を犠牲にする前に準備ができている（また、無菌性を確認し、温度） |
| 厳格パパイン処理 | 機械的解離は、ライブ単一細胞懸濁液を生成するのに十分な、繊細な、しかし組織のあまりに多くの塊を残す回避するのに十分強力である必要があります。インキュベーション/遠心分離期間のための推奨時間および温度を尊重 | |
| ニューロスフェアが表示されたり不十分成長しません | 不適切な温度 | Cを提供している30℃に設定し、そのインキュベーターをチェックorrect温度。 |
| 破片で除去成長する球 | 各ウェルについて、破片の吸引は、媒体の上に十分に行う必要があります。あなたのピペットで培地に入力しないでください | |
| いくつかの試薬（B27サプリメント、EGF、FGF）の整合性が弱くなり、 | この完全性は、細胞増殖の制限因子となります。バッチ番号、およびサンプルが保存されていた方法を確認してください。 /融解を避け培養に用いられる任意のサンプリングされた試薬のサイクルを再凍結 | |
| 単一細胞の存在 | ニューロスフェアの転送/拡大モードはあまりにも過酷です | あまりにも多くの球が十分に形成されているため、このステップは、拡張/希釈ステップです。単一細胞に神経球解離を防止するために、転送中に過酷な球体のコレクションを避けます |
| マトリゲル上の細胞の不在 | マトリゲルは、適切に希釈/解凍されませんでした | -20°Cからマトリゲルは、解凍し、4℃で少なくとも30分を必要とし、慎重に粘性ピペットのまま |
| マトリゲルには接着しません | 細胞懸濁液の体積は、マトリゲルコートの細胞付着を可能にするのに十分に小さくなければなりません | |
| 細胞堆積のためのより多くの時間を許可する（2時間までの大容量が使用されている場合） | ||
| 新鮮な分化培地寒すぎます | 細胞付着培地を交換するときは、分化培地は、堆積細胞の熱衝撃を防ぐために30℃まで温めする必要があります | |
| 悪いヌクレオ | 死細胞 | ヌクレオを実行中に気泡を発生させないことを確認します。マキシ準備を用いて高品質のDNAベクターを使用してください。ヌクレオ後2時間、新鮮Z分化条件培地またはZ条件培地のいずれかを使用して培地を交換する - 少なくとも1。 |
| いくつかの肯定的なニューロスフェア | 様々なサイズのニューロスフェアは、貧しいヌクレオにつながることができます。 DIV2とDIV3で、神経球を使用すると、ヌクレオに最適です。細胞の密度は、4×10 3の神経球のml -1の100ミリリットルの反応でを超えてはなりません。 |
表1： トラブルシューティングのアドバイスは、 それらを克服するために 議定書、 可能性のある問題と解決方法 の各ステップのために、リスト 。
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Discussion
このプロトコルの主な目的は、神経幹/前駆細胞の細胞および分子の機能を研究するためにゼブラフィッシュの脳由来の神経球を分離し、培養大人のすることです。ここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から、多能性神経細胞を選択し、3神経細胞型、 すなわち 、アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを生成する方法を報告しています。再現性のニューロスフェア形成アッセイは、これまでにゼブラフィッシュで確立されていなかったので、プロトコルは非常に重要です。
プロトコルのいくつかの重要なステップは尊重される必要があり、トラブルシューティングに関するアドバイス（ 表1）にrecapitutaledされています。まず、細胞死は、成体ゼブラフィッシュ脳、単一細胞懸濁液手順の切開の両方で起こります。細胞死の拡張を制限するために、クリーンでシャープなツールを使用するだけでなく、厳密に存在プロにお勧めのインキュベーションのタイミングと温度を尊重することが不可欠ですトコール。第二に、ニューロスフェア培養物を新たに調製したメディアとし、慎重なピペット操作技術を用いて行われるべきです。第三に、細胞密度の推奨は、信頼性の高い更新または神経球細胞の分化を得るために従うべきです。これを念頭において、細胞培養技術の業者は、プロトコルを使用し、成人のゼブラフィッシュの脳由来の神経球の単離、培養および遺伝子操作を行うことができるはずです。
ゼブラフィッシュにおける球形成アッセイは、以前の哺乳動物種4で説明したのと同じ制限に苦しんでいる：1）神経幹/前駆細胞の挙動は、彼らの自然な脳のニッチからのそれらの単離を以下に変更されます。 2）ニューロスフェアは、幹細胞の均一な集団ではなく、幹細胞、前駆細胞ならびに有糸分裂後の分化した細胞が含まれます。それは私たちのプロトコルがaclonalニューロスフェア培養を生成することは注目にさらに価値があります。培養物の細胞密度が球形成アッセイにおける重要なパラメータは、それは文化が、クローン半クローンまたはaclonalであるかどうか、 すなわちクローン性を、決定するので。クローン条件を正確に特徴付け、培養物中に存在する幹細胞および前駆細胞の異なるプールを定量化することができます。我々はこれまでに、細胞クローンアッセイを行うことができていないと我々は他の前駆細胞プールから神経幹細胞を識別することができる前に、当社の培養条件は、より一層の最適化を必要としています。
ゼブラフィッシュニューロスフェア培養物は、実験の広い範囲のために使用することができます。神経細胞の運命（ 図4及び11）の組織特異的決意でのmiR-107の機能を評価する我々の研究によって示されているように彼らは、神経発生時の遺伝子発現解析だけでなく、遺伝子発現の操作を可能にします。追加のアプリケーションはneurogeの神経幹/前駆細胞の遺伝子の役割を試験するために、そのようなCRISPR / Cas9システムとしてゲノム編集戦略を含みますネシスと脳の修復13。最後に、我々のプロトコルは、ゼブラフィッシュの神経球は、ニューロンとグリア細胞の地域固有の機能を研究するためにゼブラフィッシュの脳14の異なる心室領域で神経細胞の異質性の細胞および分子基盤を探求する可能性を開いて、異なる脳領域から誘導することができることを示しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
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