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Biology

लक्षित sRNA के फेज की मध्यस्थता प्रसव में जीन की अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के निर्माणों Published: March 20, 2016 doi: 10.3791/53618
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1U1001, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes
* These authors contributed equally

Abstract

आरएनए की मध्यस्थता knockdowns व्यापक रूप से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तकनीक के इस बहुमुखी परिवार लघु शाही सेना (sRNA) है कि किसी भी दृश्य के साथ संश्लेषित किया जा सकता है और किसी भी जीन मुंह बंद करने के लिए लक्षित पूरक बनाया का उपयोग करता है। sRNA constructs क्योंकि सीधे कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए पेश किया जा सकता है या वैक्टर की एक किस्म का उपयोग, जीन अभिव्यक्ति श्रमसाध्य आनुवंशिक संशोधन के बिना जीवित कोशिकाओं में दमित जा सकता है। सबसे आम आरएनए पछाड़ना प्रौद्योगिकी, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई), अंतर्जात आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (RISC) मध्यस्थता करने के लिए अनुक्रम मान्यता और लक्ष्य mRNA की दरार का उपयोग करता है। इस तकनीक के आवेदन इसलिए RISC व्यक्त जीवों, मुख्य रूप से eukaryotes तक सीमित हैं। हाल ही में, आरएनए biotechnologists की एक नई पीढ़ी आरएनए के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए वैकल्पिक तंत्र विकसित किया है, और इतने बैक्टीरिया में संभव आरएनए की मध्यस्थता जीन knockdowns बनाया है। यहाँ हम जीन अभिव्यक्ति मुंह बंद करने के लिए एक विधि का वर्णनई में सायन कोलाई कार्यात्मक आरएनएआई कि जैसा दिखता है। इस प्रणाली में एक कृत्रिम phagemid sRNA है, जो किसी भी क्रम को लक्ष्य बनाया गया हो सकती है व्यक्त करने के लिए बनाया गया है। अभिव्यक्ति का निर्माण ई की आबादी के लिए दिया जाता है गैर-अपघट्य M13 फेज, जिसके बाद यह स्थिरतापूर्वक एक प्लाज्मिड के रूप में दोहराने के लिए सक्षम है के साथ कोलाई कोशिकाओं। Antisense मान्यता और लक्ष्य mRNA का मुंह बंद Hfq प्रोटीन, ई अंतर्जात द्वारा मध्यस्थता है कोलाई। इस प्रोटोकॉल, antisense sRNA डिजाइनिंग phagemid वेक्टर निर्माण, M13 जीवाणुभोजी में phagemid पैकेजिंग, संक्रमण के लिए एक जीवित सेल की आबादी की तैयारी कर रहा है, और संक्रमण में ही प्रदर्शन के लिए तरीके शामिल हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन mKate2 और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन chloramphenicol acetyltransferase (कैट) के प्रतिनिधि डेटा उत्पन्न करने के लिए और पछाड़ना प्रभावशीलता यों को लक्षित कर रहे हैं।

Introduction

आरएनए की मध्यस्थता जीन knockdowns दो चरणों में आगे बढ़ें। सबसे पहले, एक आरएनए अणु एक सेल लाइन या अध्ययन के जीव के लिए शुरू की है। दूसरा, अंतर्जात शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन शाही सेना लक्ष्य मान्यता की सुविधा और मुंह बंद प्रभाव पैदा करते हैं। सभी आरएनए पछाड़ना प्रौद्योगिकियों सिंथेटिक sRNAs का अनुकूलन प्रकृति है, जो आसानी से ब्याज की एक विशेष लक्ष्य के मैच के लिए उत्पादन किया जा सकता से लाभ। हालांकि, आरएनए तेज और मुंह बंद करने की आणविक विवरण व्यापक रूप से मॉडल प्रणाली के पार, बाधा कहाँ और कैसे आरएनए knockdowns लागू किया जा सकता बदलती हैं।

नेमाटोड में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) अणुओं सीधे मीडिया में या dsRNA व्यक्त ई की आबादी के साथ कीड़े खिलाने से पेश किया जा सकता कोलाई कोशिकाओं 1,2। ड्रोसोफिला में, आरएनएआई बस संस्कृति के माध्यम से 4 dsRNA जोड़कर dsRNA 3 के साथ भ्रूण microinjecting के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, या सेल लाइनों में लागू किया है। स्तनधारी सेल लाइनों में,सिंथेटिक छोटे दखल RNAs (siRNAs) electroporation 1,2,5 द्वारा जीवित कोशिकाओं के लिए दिया जा सकता है, liposomes 3,6 में पैक, या डीएनए प्लाज्मिड वैक्टर 4,7 से व्यक्त किया। एक बार जब आरएनए प्रजातियों cytosol पहुंचता है, आरएनएआई मार्ग dsRNA प्रक्रिया है, लक्ष्य की antisense मान्यता की सुविधा है, और translational दमन, mRNA गिरावट, या हेट्रोक्रोमैटिन गठन को उत्प्रेरित, मेजबान के आधार पर करने के लिए RISC परिसर पर निर्भर करता है।

क्योंकि इन आवश्यकताओं की, शास्त्रीय आरएनएआई केवल जीवों कि कुशलतापूर्वक बहिर्जात आरएनए हाथ में ले लिया और RISC या एक RISC-तरह गतिविधि को व्यक्त करने में किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह शामिल नहीं मॉडल जीवाणु ई कोलाई, जो आरएनएआई मार्ग का अभाव है। हालांकि, सिंथेटिक जीव विज्ञान में हाल के अग्रिमों दोनों वितरण की समस्या और मुंह बंद करने से समस्या का समाधान करने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, sRNA निर्माणों ई में व्यक्त कर रहे एक डीएनए वेक्टर से कोलाई ली के लिए दियाM13 phagemid / सहायक प्रणाली का उपयोग कोशिकाओं ving। एक phagemid एक फेज व्युत्पन्न प्रतिकृति की F1 मूल के साथ किसी भी प्लाज्मिड है। एक सहायक प्लाज्मिड, इस मामले में M13KO, सभी मशीनरी वायरल कणों का निर्माण करने के लिए आवश्यक किया जाता है, लेकिन प्रतिकृति और पैकेजिंग के लिए सक्षम ही नहीं है। जब एक phagemid और सहायक प्लाज्मिड सह तब्दील कर रहे हैं, अकेले phagemid, F1 मूल में दोहराया पैक और स्रावित होता है। Vectorized phagemid रहते हैं तो ई संक्रमित करने के लिए सक्षम है एफ Pilus के माध्यम से कोलाई।

इस प्रणाली में, मुंह बंद प्रभाव लक्ष्य बाध्यकारी अनुक्रम के साथ एक पाड़ अनुक्रम के संयोजन कस्टम sRNA कैसेट द्वारा निर्मित है। लक्ष्य बाध्यकारी अनुक्रम एक mRNA लक्ष्य को antisense 24 आधार जोड़े, आम तौर पर राइबोसोम बाध्यकारी साइट (आरबीएस) पर है। पाड़ अनुक्रम, ना और उनके सहयोगियों ने 8 द्वारा विकसित की है, एक Hfq बाध्यकारी मूल भाव MICC, एक छोटी सी नियामक आरएनए ई अंतर्जात से निकाला शामिल कोलाई। Hfq प्रोटीन को उत्तेजित करता है आरएनए-आरएनए bindinजी और mRNA गिरावट, इस प्रणाली आरएनएआई में RISC के लिए इसी तरह की भूमिका में एक सेवारत। चित्रा 1 sRNA कैसेट संरचना, phagemid vectorization, और मुंह बंद तंत्र सहित फेज की मध्यस्थता sRNA knockdowns, के लिए एक पूरी योजना को दर्शाया गया है।

एक विधि के रूप में ई जीन अभिव्यक्ति मिलाना कोलाई, sRNA मुंह बंद करने, सरल, तेजी से और बहुमुखी है। लक्षित ई कोलाई phagemid प्रचार और sRNA व्यक्त परे बोझ नहीं है। यह सिंथेटिक जीव विज्ञान या बुनियादी अनुसंधान जहां बड़े heterologous निर्माणों की अभिव्यक्ति सेलुलर संसाधनों 9 तनाव कर सकते हैं के संदर्भ में प्रासंगिक हो सकता है। नए लक्ष्य के साथ Phagemids एक भी पीसीआर के साथ उत्पादन किया जा सकता है और phagemid परिवर्तन के बाद एक दिन काटा। अंत में, लगभग किसी भी mRNA को निशाना बनाया जा सकता है। SRNA विनियमन कैसेट (एक मानक प्लाज्मिड पर) ठेठ दमन स्तरों> 90% 8 के साथ चयापचय में लक्ष्यों की एक किस्म पर काम करने के लिए दिखाया गया है।

10 का उपयोग कर पहले काम पर फैलता है। सबसे पहले, एक पैक phagemid ई के एक बैच संस्कृति को पेश किया है कोलाई कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट प्रोटीन mKate2 की अभिव्यक्ति को चुप करने के लिए इस्तेमाल किया। इसके बाद प्रतिदीप्ति परिवर्तन वास्तविक समय में निगरानी कर रहे हैं। दूसरा, कैट जीन नीचे दस्तक अगर प्लेटों पर प्ररूपी chloramphenicol प्रतिरोध को कम करने के लिए दिखाया गया है। दोनों ही मामलों में, phagemid खुद को अनुमति देने के लिए संक्रमण दर पछाड़ना दक्षता की स्वतंत्र रूप से मापा जाना एक GFP मार्कर किया जाता है।

Protocol

1. डिजाइन और Phagemid वैक्टर के निर्माण असर sRNA मुंह बंद कैसेट्स

  1. SRNA मुंह बंद कैसेट्स 8 के डी नोवो डिजाइन
    1. पहचानें mRNA की पूरी अनुक्रम एक डीएनए अनुक्रम डेटाबेस का उपयोग करने के लिए खामोश हो। लक्ष्य अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए, शुरू कोडोन (जैसे, ATG) के साथ शुरुआत ध्यान दें अनुक्रम कोडन के पहले 24 बीपी, स्थिति से +1 +24 करने के लिए।
      नोट: मुंह बंद कम कुशल जब अन्य साइटों या mRNA के क्षेत्रों 8 लक्षित कर रहे है।
    2. sRNA कैसेट के लिए गाइड अनुक्रम का निर्माण करने के लक्ष्य अनुक्रम के रिवर्स पूरक ले लो। Chloramphenicol acetyltransferase (कैट) के लिए लक्ष्य और गाइड दृश्यों के उदाहरण के लिए 1 टेबल देखें।
    3. 292 बीपी पूरा sRNA अभिव्यक्ति कैसेट डिजाइन करने के लिए, पीआर प्रमोटर, गाइड अनुक्रम, Hfq प्रोटीन बाध्यकारी डोमेन और श्रृंखला में T1 / ते ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेटर दृश्यों (तालिका 2) की व्यवस्था।
    4. पसंद के अतिरिक्त क्लोनिंग साइटों को लक्षित वेक्टर में sRNA कैसेट की क्लोनिंग की सुविधा के लिए जोड़ें।
    5. वाणिज्यिक जीन संश्लेषण या इसी तरह की एक विधि के माध्यम से पूरा sRNA कैसेट प्राप्त करें और एक कार्यात्मक F1 प्रतिकृति मूल 11 के साथ किसी भी phagemid वेक्टर में यह क्लोन। अंतिम phagemid वेक्टर की पूरी अनुक्रम के लिए जानकारी का समर्थन देखें।
  2. अनुक्रम मौजूदा sRNA अभिव्यक्ति पीसीआर आधारित साइट निर्देशित mutagenesis 12 का उपयोग कर कैसेट द्वारा लक्षित फेरबदल
    1. एक मौजूदा sRNA अभिव्यक्ति कैसेट में 24 बीपी गाइड अनुक्रम को पहचानें। नोट: एनोटेट pAB.001 प्लाज्मिड, इस काम में इस्तेमाल किया, एक पूरक अनुक्रम फ़ाइल के रूप में उपलब्ध है।
    2. डिजाइन आगे और मौजूदा sRNA कैसेट नए 24 बीपी गाइड अनुक्रम flanking करने अनुरूपता के छोटे क्षेत्रों के साथ प्राइमरों रिवर्स। वाणिज्यिक oligonucleotide संश्लेषण के माध्यम से प्राइमरों प्राप्त करते हैं।
      नोट: साइट निर्देशित mutagenesis के लिए प्राइमर डिजाइन depic हैटेड चित्रा 2 में सटीक प्राइमर टेम्पलेट दृश्यों 3 टेबल में प्रदान की जाती हैं।
    3. ई की एक 5 मिलीलीटर संस्कृति तैयार कोलाई टेम्पलेट sRNA अभिव्यक्ति phagemid ले। उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिलाते हुए, लेग मीडिया के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित।
    4. निकालें और 5 मिलीलीटर जीवाणु संस्कृति एक डीएनए miniprep किट या इसी तरह की पद्धति का उपयोग करने से 12 टेम्पलेट sRNA अभिव्यक्ति phagemid शुद्ध।
    5. टेम्पलेट sRNA अभिव्यक्ति phagemid और उच्च निष्ठा पोलीमर्स, आगे के साथ एक और रिवर्स प्राइमर (तालिका 4) के साथ एक का उपयोग कर दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं तैयार करें। के रूप में पोलीमर्स आपूर्तिकर्ता (5 तालिका) ने सिफारिश की पीसीआर की स्थिति का प्रयोग करें। एक मानक प्रतिक्रिया की तुलना में अधिक 10-50x करने के लिए तथ्य यह है कि एक प्राइमर प्रतिक्रिया घातीय प्रवर्धन उत्पादन नहीं करता है के लिए खाते में करने के लिए टेम्पलेट एकाग्रता में वृद्धि।
    6. एक microcentrifuge ट्यूब में दो से ऊपर पीसीआर प्रतिक्रियाओं का मिश्रण। Anneaएल एक उबलते पानी के स्नान में 98 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से उत्पादों। इसके तत्काल बाद पानी से स्नान में microcentrifuge ट्यूब रखने के बाद, गर्मी स्रोत को दूर करने और स्नान धीरे-धीरे 1-2 घंटा से अधिक कमरे के तापमान पर लौटने के लिए अनुमति देते हैं।
    7. unmutated टेम्पलेट sRNA अभिव्यक्ति phagemid को समाप्त करने के लिए, 1 μl जोड़ें। मिश्रण करने के लिए DpnI प्रतिबंध एंजाइम और 1 घंटा, या समय पूरा पाचन के लिए निर्माता से सिफारिश के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: DpnI केवल methylated लक्ष्य साइटों, जो पीसीआर उत्पादों मेजबान दोहराया phagemids पर उपस्थित लेकिन नहीं हैं हज़म।
    8. खरीदी या तैयार 13 रासायनिक सक्षम ई रूपांतरण annealed पीसीआर उत्पाद के 1-5 μl के साथ कोलाई। लेग अगर उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेटों पर चयनात्मक चढ़ाना से बदल तनाव के एकल कालोनियों अलग।
    9. सही गाइड अनुक्रम के समावेश को सत्यापित करने के लिए, कॉलोनी पीसीआर द्वारा परिणामस्वरूप कालोनियों स्क्रीन। एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग करना, सहएक भी तब्दील कॉलोनी से कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा llect। मार्क और सत्यापन के बाद नीचे की ओर उपयोग के लिए मूल कॉलोनी रक्षा करता है।
    10. एक microcentrifuge ट्यूब में nuclease मुक्त पानी की 50 μl करने के लिए एकत्र कोशिकाओं जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
    11. एक बेंच शीर्ष thermocycler या एक उबलते पानी के स्नान का प्रयोग, 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से कोशिकाओं lyse।
    12. phagemid क्षेत्र एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में गर्मी lysed कोशिकाओं की 1 μl का उपयोग करते हुए पीसीआर बढ़ाना। पीसीआर की स्थिति और thermocycler प्रोटोकॉल टेबल्स 6 और 7 में प्रदान की जाती हैं। सत्यापन प्राइमर दृश्यों के लिए पूरक pAB.001 अनुक्रम फ़ाइल देखें।
    13. पीसीआर उत्पाद अनुक्रम सही गाइड अनुक्रम का समावेश सत्यापित करने के लिए।
    14. ई की एक 5 मिलीलीटर संस्कृति टीका लगाना कोलाई अनुक्रम सत्यापित sRNA अभिव्यक्ति phagemid ले जाने क्लोन। कोशिकाओं रातोंरात, झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें चयनात्मक लेग मीडिया में।
    15. एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयारअनुक्रम सत्यापित क्लोन की। एक पेंच टोपी क्रायो ट्यूब में 60% ग्लिसरॉल के 250 μl करने के लिए रातोंरात संस्कृति के 750 μl जोड़ें।
    16. -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल शेयर की दुकान अनिश्चित काल के लिए। रातोंरात संस्कृति के शेष चरण 2 में sRNA अभिव्यक्ति phagemid के लिए एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

2. उत्पादन और M13 पैक Phagemid स्टॉक्स की फसल

  1. ई की एक 5 मिलीलीटर संस्कृति तैयार कोलाई sRNA अभिव्यक्ति phagemid ले। उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिलाते हुए, लेग मीडिया के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित। नोट: sRNA अभिव्यक्ति phagemid एक मौजूदा phagemid से कदम 1.1.5 में वर्णित के रूप में नए सिरे से क्लोनिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, या संशोधित और कदम 1.2.16 में काटा।
  2. इसी तरह ई के एक 5 मिलीलीटर संस्कृति तैयार कोलाई M13KO7 सहायक प्लाज्मिड ले। कोशिकाओं रातोंरात, झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें चयनात्मक लेग मीडिया में।
  3. निकालें और sRNA expressio शुद्धn phagemid और सहायक प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण किट या इसी तरह की पद्धति का उपयोग करते हुए 12।
  4. Cotransform खरीदा या 1 μl sRNA अभिव्यक्ति phagemid और सहायक प्लाज्मिड से प्रत्येक के साथ 13 रासायनिक सक्षम ई कोलाई तैयार किया। दोनों निर्माणों के लिए चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग अगर पर चढ़ाना द्वारा cotransformants के लिए चयन करें।
  5. चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग में cotransformed तनाव का एक भी कॉलोनी से एक 10 मिलीलीटर संस्कृति तैयार करें। 8-12 मानव संसाधन या रात भर के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 10 मिनट के लिए 3300 XG पर संस्कृति अपकेंद्रित्र। 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला और फिल्टर लीजिए। सावधानी: मीडिया गिर के मामले में, संक्रामक फेज कणों को नष्ट करने के लिए पतला ब्लीच (0.5%) के साथ क्षेत्र को साफ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर पैक phagemid छानना स्टोर। नोट: नमूने गतिविधि की हानि के बिना सप्ताह के दिनों के लिए रखा जा सकता है।

3. एफ + लक्ष्य कोशिकाओं की तैयारी के लिए मुंह बंद

  1. यदि कोशिकाओं को मुंह बंद करने के लिए निशाना बनाया जा करने के लिए एफ Pilus 14 को व्यक्त निर्धारित करते हैं। अगर एफ Pilus पहले से ही मौजूद है, चरण 4 पर आगे बढ़ें।
    नोट: ई की आम प्रयोगशाला उपभेदों कोलाई उनके जीनोम में या एक प्लाज्मिड पर एफ Pilus की उपस्थिति का संकेत के रूप में एफ + या एफ 'की व्याख्या की जाती है।
  2. ई की एक एफ + तनाव प्राप्त कोलाई 'ऐसे TOP10F के रूप में।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि लक्ष्य तनाव के क्रम में एक अद्वितीय प्रतिरोध मार्कर किया जाता विकार के बाद एफ प्लाज्मिड दाता से अलग किया जा सके।
  3. एक एफ + तनाव के साथ विकार द्वारा एफ Pilus परिचय, दोनों लक्ष्य तनाव और एफ प्लाज्मिड दाता 14 के 5 मिलीलीटर संस्कृतियों तैयार करते हैं। उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ मिलाते हुए, लेग मीडिया के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित।
  4. अगले दिन, दोनों उपभेदों 1 पतला: 5 चयनात्मक पौंड की मिलीलीटर में 100 और झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संवर्धन जारी है।
  5. ऑप्ट को मापने के द्वारा कोशिकाओं के विकास के चरण का निर्धारण करते हैं600 एनएम (600 आयुध डिपो) एक benchtop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने पर संस्कृति के राजनैतिक घनत्व। संस्कृति 0.3 के एक आयुध डिपो 600 तक के बारे में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को उपलब्ध हो जाता है, लॉग चरण विकास 15 का संकेत है।
  6. microcentrifuge ट्यूब में 3 विकार प्रतिक्रियाओं तैयार: 0.5 मिलीलीटर एफ प्लाज्मिड दाता + 0.5 मिलीलीटर लक्ष्य तनाव, 0.5 मिलीग्राम एफ प्लाज्मिड दाता + 0.5 मिलीलीटर लेग मीडिया (नकारात्मक नियंत्रण) और 0.5 मिलीलीटर लक्ष्य तनाव + 0.5 मिलीलीटर लेग मीडिया (नकारात्मक नियंत्रण)। विकार झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
  7. प्लेट एफ प्लाज्मिड के लिए विशिष्ट एंटीबायोटिक दवाओं (आमतौर पर टेट्रासाइक्लिन) और लक्ष्य तनाव के साथ चयनात्मक लेग अगर पर प्रत्येक विकार प्रतिक्रिया के 100 μl। प्लेट नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं पुष्टि करने के लिए है कि न तो दाता या प्राप्तकर्ता तनाव दोनों एंटीबायोटिक प्रतिरोध व्यक्त करते हैं।

4. मुंह बंद के लिए पैक Phagemids के साथ संक्रमण

  1. पौंड दवा की एक 5 मिलीलीटर संस्कृति में एफ + लक्ष्य कोशिकाओं का एक ही कॉलोनी टीका लगानाउचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक। झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. अगले दिन, एफ + लक्ष्य कोशिकाओं 1 पतला: 5 चयनात्मक लेग मीडिया की मिलीलीटर में 100 और झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के लिए जारी है।
  3. 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के एक benchtop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं के विकास के चरण निर्धारित करते हैं। संस्कृति 0.3 के एक आयुध डिपो 600 तक के बारे में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को उपलब्ध हो जाता है, लॉग चरण विकास 15 का संकेत है। नोट: एफ Pilus और संक्रमण दक्षता की अभिव्यक्ति लॉग चरण में सबसे अधिक है।
  4. लक्ष्य की आबादी का लगभग 99% संक्रमण प्राप्त करने के लिए 100: 1 की मात्रा के अनुपात में लक्ष्य कोशिकाओं को (2.6 कदम से) M13 पैक phagemids जोड़ें। संक्रमण 30-60 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें।
  5. पसंद की विधि के अनुसार sRNA-मुंह बंद phenotype परख।
    नोट: एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन लक्ष्य के लिए, मुंह बंद प्रभाव मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैसीधे fluorometry 10 से। वैकल्पिक रूप से, प्ररूपी assays जीन पछाड़ना 8 की प्ररूपी परिणामों निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. कदम 1.2.14-1.2.16 निम्नलिखित sRNA व्यक्त phagemid की मेजबानी के लिए एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करें। नोट: phagemid अनिश्चित काल के लिए मेजबान तनाव में प्रचार करेंगे और एक पारंपरिक प्लाज्मिड के लिए एंटीबायोटिक समान के साथ बनाए रखा जा सकता है।

Representative Results

तरल मीडिया में mKate2 प्रतिदीप्ति का मुंह बंद

चित्रा 1 इस काम में वर्णित sRNA की मध्यस्थता knockdowns, sRNA कैसेट डिजाइन, phagemid vectorization, और मुंह बंद करने के लिए तंत्र सहित योजना को दर्शाया गया है। प्रोटोकॉल 1.2 के बाद, प्लाज्मिड pAB.001 की sRNA मुंह बंद कैसेट mKate निशाना बनाने के लिए बदल गया था। SRNA कैसेट synthetized और phagemid Litmus28i_J23115-B0032 GFP, मोनिका Ortiz और आकर्षित Endy 11 से एक उपहार में क्लोन किया गया था। इस phagemid GFP अभिव्यक्ति और केनामाइसिन प्रतिरोध के लिए मार्कर किया जाता है, की अनुमति सफल संक्रमणों पर नज़र रखी जा सके। डिब्बाबंद phagemid शेयरों प्रोटोकॉल 2 निम्नलिखित तैयार थे।

ई के व्युत्पन्न कोलाई K12 MG1655 एक अनिवार्यता से व्यक्त की, chromosomally एकीकृत mKate2 मार्कर ले जाने के विकार से फेज संक्रमण के लिए तैयार किया गया था एक एफ प्लाज्मिड दाता निम्नलिखित प्रोटोकॉल 3. कोशिकाओं के मध्य लॉग चरण और phagemid प्रोटोकॉल 4. phagemid संक्रमण के बाद निम्नलिखित शुरू की बड़े हो रहे थे तनाव के साथ, 200 μl संस्कृतियों एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक के लिए स्थानांतरित कर दिया गया और प्रतिदीप्ति 24 घंटे के लिए लगातार नजर रखी थी।

चित्रा 3 mKate2 अभिव्यक्ति पर sRNA की मध्यस्थता मुंह बंद करने के प्रभाव को दर्शाता है। तनाव एक विरोधी mKate2 phagemid से संक्रमित पृष्ठभूमि पर नहीं detectable mKate2 प्रतिदीप्ति दिखाया। इसके विपरीत, इस तनाव GFP मार्कर का इजहार किया था, phagemid के सफल तेज का संकेत है। असंक्रमित नियंत्रण कक्षों mKate2 प्रतिदीप्ति नहीं बल्कि GFP का उत्पादन किया। एक अतिरिक्त नियंत्रण में है, जो विरोधी mKate2 को निशाना डोमेन एक दृश्य को निशाना बिल्ली के साथ बदल दिया गया था, mKate2 प्रतिदीप्ति पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

अगर प्लेटों पर Chloramphenicol प्रतिरोध का मुंह बंद

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> प्रोटोकॉल 1.1 के बाद, एक sRNA मुंह बंद कैसेट कैट निशाना बनाने के लिए तैयार की गई थी कोलाई K12 MG1655 ले जाने के एक अनिवार्यता से व्यक्त की, chromosomally एकीकृत कैट मार्कर के लिए तैयार किया गया था के व्युत्पन्न। एक एफ प्लाज्मिड दाता तनाव प्रोटोकॉल 3. कोशिकाओं निम्नलिखित के साथ विकार द्वारा फेज संक्रमण मध्य लॉग चरण के लिए बड़े हो रहे थे और phagemid 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटोकॉल 4. निम्नलिखित शुरू की ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद, संक्रमित कोशिकाओं क्रमानुसार पतला है और एक पर चढ़ाया गया प्लेट्स chloramphenicol सांद्रता की। रेंज रात भर incubated रहे थे, और प्रत्येक chloramphenicol एकाग्रता में प्रतिरोधी कोशिकाओं के अनुपात में कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) अगले दिन की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था।

चित्रा 4 chloramphenicol प्रतिरोध phenotype पर sRNA की मध्यस्थता मुंह बंद करने के प्रभाव को दर्शाता है। असंक्रमित कोशिकाओं, या कोशिकाओं को निशाना phagemid mKate2 से संक्रमित करने के लिए प्रतिरोधी रहे थेपरीक्षण सभी सांद्रता में chloramphenicol। इसके विपरीत, कोशिकाओं को निशाना phagemid कैट से संक्रमित कम chloramphenicol सांद्रता में अस्तित्व के लिए कम से पता चला है, और लगभग 99% उच्च सांद्रता में मौत हो गई। एम्पीसिलीन के अलावा, केवल बैक्टीरिया phagemid ले जाने के लिए चयन करने के लिए, undetectable स्तर तक chloramphenicol अस्तित्व कम हो। इस फेज के संक्रमण से जो बच दिखा एक आम मार्ग 10 मुंह बंद बच रही है पहले काम के अनुरूप है।

आकृति 1
चित्रा 1: ई में जीन मुंह बंद sRNA अभिव्यक्ति कैसेट के साथ कोलाई M13 फेज द्वारा वितरित sRNA कैसेट 4 मॉड्यूल से बना है:। पीआर प्रमोटर (एक विधान प्रमोटर जीवाणुभोजी लैम्ब्डा से प्राप्त), एक 24 बीपी को निशाना डोमेन, एक Hfq बाध्यकारी डोमेन MICC से निकाला और एक ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेटर 8 ई को संक्रमित करने में सक्षम हैं कोलाई एफ Pilus, जहां sRNA अभिव्यक्ति शुरू होता है व्यक्त। SRNA तो Hfq प्रोटीन (लाल रंग में चित्रित) रंगरूटों और राइबोसोम बाध्यकारी स्थल के निकट एक antisense mRNA लक्ष्य बांधता है, translational दमन और mRNA गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रथम डिजाइन और साइट निर्देशित sRNA लक्ष्य साइट की mutagenesis दो प्राइमरों एक मौजूदा sRNA कैसेट को आंशिक अनुरूपता साथ डिजाइन किए हैं। आगे प्राइमर 5 'अंत में जनसंपर्क के प्रमोटर द्वारा पीछा करने के लिए 20 बीपी मुताबिक़ शामिल24 बीपी नई गाइड अनुक्रम का प्रतिनिधित्व, तो 3 'के अंत में Hfq बाध्यकारी डोमेन के लिए 18 बीपी मुताबिक़। रिवर्स प्राइमर आगे प्राइमर की सटीक रिवर्स पूरक, मौजूदा sRNA कैसेट नई गाइड अनुक्रम के रिवर्स पूरक flanking करने अनुरूपता के क्षेत्रों के साथ है। सटीक प्राइमर दृश्यों 3 टेबल में दिए गए हैं। आगे और रिवर्स प्राइमरों के साथ अलग-अलग एकल प्राइमर पीसीआर प्रतिक्रियाओं वांछित संशोधित अनुक्रम के साथ रैखिक, एकल असहाय डीएनए का उत्पादन। आगे annealing और प्रतिक्रिया उत्पादों रिवर्स, साफ-अप प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में निम्नलिखित, डबल असहाय डीएनए असर वांछित संशोधित sRNA कैसेट में परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: कश्मीरएक chromosomally एकीकृत mKate2 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की nockdown ई। कोलाई MG1655 K12 mKate2 व्यक्त कर रहे थे तो छोड़ दिया अनुपचारित (लाल लाइनों और बार), एक विरोधी mKate2 phagemid (हरे रंग की लाइनों और सलाखों) से संक्रमित है, या एक नियंत्रण phagemid को निशाना कैट (नीले रंग की लाइनों और सलाखों) से संक्रमित। (ए) अनुपचारित ई कोलाई उच्च संतृप्ति घनत्व के लिए बढ़ी, फेज संक्रमण के लिए एक चयापचय लागत का संकेत है। बिंदीदार लाइनों 3 प्रतिकृति की मानक विचलन का संकेत मिलता है। (बी) mKate2 संकेत विरोधी mKate2 में पास पृष्ठभूमि के स्तर को कम किया गया था तनाव का इलाज किया, लेकिन नियंत्रण उपभेदों में नहीं। (सी) GFP प्रतिदीप्ति भी phagemid द्वारा किया जाता है, केवल phagemid इलाज नियंत्रण में detectable था। (डी, ई) अंतिम प्रतिदीप्ति रीडिंग के बाद विकास के 24 घंटा के आयुध डिपो के लिए सामान्यीकृत किया गया। GFP संकेत, phagemid संक्रमण का संकेत है, अनुपचारित नियंत्रण में अनुपस्थित था, लेकिन यह भी काफी हद तक विरोधी कैट पी निम्नलिखित कम होhagemid उपचार। इस बंद लक्ष्य phagemid के प्रभाव का संकेत हो सकता है। mKate2 संकेत अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में विरोधी mKate2 phagemid उपचार की कमी थी। कैट-लक्षित नियंत्रण phagemid mKate2 प्रतिदीप्ति पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया। त्रुटि सलाखों 3 प्रतिकृति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: कैट की पछाड़ना एक आनुवंशिक रूप से प्रतिरोधी जनसंख्या को Chloramphenicol संवेदनशीलता पुनर्स्थापित ई। कोलाई MG1655 K12 एक chromosomally एकीकृत कैट जीन व्यक्त इलाज (लाल बार) छोड़ दिया गया, एक नियंत्रण phagemid को निशाना mKate2 (हरे रंग की सलाखों) के साथ इलाज, या एक phagemid एक एंटी-कैट sRNA (नीले सलाखों) व्यक्त के साथ इलाज किया। संकेत दिया चींटी पर संक्रमण का 1 घंटा, व्यवहार्यता के बादibiotics धारावाहिक dilutions और चढ़ाना द्वारा मूल्यांकन किया गया था। विरोधी कैट phagemid के साथ इलाज खींच काफी उच्च सांद्रता में chloramphenicol द्वारा (> 90%) की मौत हो गई, जबकि नियंत्रण उपचार अप्रभावित थे। संस्कृति प्लेटों को जोड़ना एम्पीसिलीन सकारात्मक phagemid संक्रमण के लिए चयन करता है और असंक्रमित कोशिकाओं को समाप्त। इन शर्तों के तहत, कोई chloramphenicol प्रतिरोधी कालोनियों विरोधी कैट उपचार के बाद मनाया गया। यह इंगित करता है कि ज्यादातर जीवित बचे मुंह बंद करने की विफलता के संक्रमण की विफलता है, बजाय प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों 3 प्रतिकृति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कैट लक्ष्य अनुक्रम 5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3'
बिल्ली गाइड अनुक्रम 5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3'

तालिका 1:। कैट जीन के लिए एक उदाहरण के लक्ष्य और गाइड अनुक्रम रिवर्स पूरक संबंध ध्यान दें।

पीआर प्रमोटर TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC
गाइड अनुक्रम ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT
Hfq बाध्यकारी डोमेन TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT
TCTCGAG
T1 / ते टर्मिनेटर CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA
CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA

तालिका 2:। sRNA कैसेट्स के अनुक्रम घटकों प्रत्येक अनुक्रम 5'-3 'लिखा है। पूरा कैसेट क्रम में इन 4 तत्वों की कड़ी है और 292 बीपी शामिल हैं।

आगे प्राइमर 5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [गाइड] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3'
रिवर्स प्राइमर 5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [लक्ष्य] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3'

तालिका 3: प्राइमर डिजाइन मौजूदा गाइड तत्वों को बदलने के लिए आगे प्राइमर पीआर प्रमोटर के पिछले 20 बीपी, नई गाइड अनुक्रम, और Hfq बाध्यकारी डोमेन के पहले 18 बीपी भी शामिल है।। लक्ष्य अनुक्रम गाइड अनुक्रम की सटीक रिवर्स पूरक है। रिवर्स प्राइमर आगे प्राइमर की सटीक रिवर्स पूरक है। अंग आयतन खाका प्लाज्मिड 500 एनजी 10 माइक्रोन प्राइमर 2.5 μl 10 मिमी dNTPs 0.4 μl उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ (2 यू / μl) 0.5 μl 5x पीसीआर बफर 10 μl कुल मात्रा 50 μl

तालिका 4: एकल प्राइमर mutagenic पीसीआर के लिए सुझाए गए शर्तें।

चरण अस्थायी पहर
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
30 चक्रों 98 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड
55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 120 सेकंड
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 300 सेकंड
भंडारण 10 डिग्री सेल्सियस

तालिका 5: एकल प्राइमर mutagenic पीसीआर के लिए thermocycler प्रोटोकॉल गए।

अंग आयतन
टेम्पलेट डीएनए 1 μl
10 माइक्रोन के आगे प्राइमर 0.5 μl
10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर 0.5 μl
Taq 2X मास्टर मिक्स 25 μl
Nuclease मुक्त wateआर 23 μl
कुल मात्रा 50 μl

तालिका 6: अनुक्रम सत्यापन पीसीआर के लिए सुझाए गए शर्तें।

चरण अस्थायी पहर
प्रारंभिक विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
30 चक्रों 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
68 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
अंतिम विस्तार 68 डिग्री सेल्सियस 300 सेकंड
भंडारण 10 डिग्री सेल्सियस

टेबल 7: सुझाए गए thermocycler प्रोअनुक्रम सत्यापन पीसीआर के लिए tocol।

Discussion

वर्तमान पद्धति अलक्षित नियंत्रण की तुलना में हासिल की mKate प्रतिदीप्ति के स्तर में 80% की कमी। यह अन्य आरएनए पछाड़ना तरीकों, जहां पूरा मुंह बंद नहीं मनाया जाता है और 50-90% दक्षता ठेठ 16,17 के साथ कतार में है। प्ररूपी स्तर पर, कैट-लक्षित knockdowns काफी chloramphenicol प्रतिरोध attenuate, और कुछ शर्तों के तहत इसे खत्म करने में सक्षम थे।

पछाड़ना phenotype के केवल कुछ ही घंटे के बाद संक्रमण (चित्रा 3 बी) के बाद आबादी के स्तर पर detectable था। इस फेज डिलीवरी का एक महत्वपूर्ण विशेषता दिखाता है: एक उच्च आवृत्ति पछाड़ना से पहले आनुवंशिक संशोधन के बिना बैच संस्कृति में सीधे प्राप्त किया जा सकता है। प्लाज्मिड परिवर्तन या जीनोमिक एकीकरण का उपयोग पारंपरिक आनुवंशिक संशोधन के विपरीत, फेज संक्रमण की आवश्यकता नहीं है कि आबादी एक अलग कॉलोनी से फिर से उगाया जा सकता है। इस फेज संक्रमण के प्रभाव एक्सप्लोरेशन होने की अनुमति देताजटिल स्थानिक गतिशीलता 11 के साथ आबादी में एड, biofilms 18, या आनुवंशिक रूप से मिश्रित प्राकृतिक आबादी 19 में की तरह पूर्व मौजूदा स्थानिक संरचनाओं के साथ।

इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम उच्च अनुमापांक में पैक phagemid का उत्पादन होता है। चयापचय फेज कण उत्पादन के साथ जुड़े बोझ उत्परिवर्तन या phagemid उत्पादन तनाव में प्लाज्मिड नुकसान की उच्च दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यह सिफारिश की है कि phagemid उत्पादन तनाव जमे हुए या फेज फसल से पहले उप-सुसंस्कृत एक भी cotransformed कॉलोनी से सीधे सुसंस्कृत हो और प्रशीतित नहीं। सह-परिवर्तन की एक कम क्षमता भी जब ई करने के लिए phagemid और सहायक प्लाज्मिड शुरू मनाया जा सकता है कोलाई एक साथ। इस मामले में, उच्च क्षमता पहले सहायक प्लाज्मिड बदलने, तो असर phagemid के साथ बाद में परिवर्तन के लिए सहायक प्लाज्मिड सक्षम कोशिकाओं की तैयारी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

Phagemid संक्रमण या sRNA अभिव्यक्ति भी लक्ष्य कोशिकाओं पर एक detectable चयापचय बोझ लगाता है, और कुछ प्ररूपी गड़बड़ी में हो सकता है। उदाहरण के लिए, mKate2 प्रतिदीप्ति में कमी भी मनाया गया जब कोशिकाओं को एक phagemid को निशाना कैट (चित्रा 3) से संक्रमित थे। M13 के साथ संक्रमण ई में प्रणालीगत तनाव प्रतिक्रियाओं को गति प्रदान करने के बारे में सोचा नहीं है कोलाई 20 है, लेकिन ट्रांसक्रिप्शनल पैटर्न परोक्ष रूप से बदल सकता है। वैकल्पिक रूप से, GFP या एम्पीसिलीन प्रतिरोध मार्कर phagemid पर शामिल सेलुलर संसाधनों के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं, mKate2 अभिव्यक्ति और विकास 9 को कम करने। अंत में, sRNA कैसेट में ही विश्व स्तर पर Hfq प्रोटीन titrating द्वारा जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल परिवर्तन, या बंद लक्ष्य mRNA मुंह बंद करने के माध्यम से कर सकते हैं। बंद लक्ष्य प्रभाव में विवो आरएनएआई को निशाना 21-23 में आम हैं, लेकिन वे अभी तक व्यवस्थित इस प्रणाली के लिए जांच की जानी है।

इस पद्धति की एक सीमा है कि संक्रमण effi हैciency कम से कम 100%, कुछ गैर-संक्रमित बैक्टीरिया की आबादी में जारी रहती करने की इजाजत दी है। यह काम और पहले काम 10 के परिणाम बताते हैं कि noninfected कोशिकाओं अंतिम जनसंख्या का 1-10% का प्रतिनिधित्व करते हैं, और मनाया nonsilenced phenotypes के अधिकांश के लिए जिम्मेदार हैं। M13-प्रतिरोध करने के लिए मार्गों की एक किस्म Pilus अभिव्यक्ति 24 की सबसे आम जा रहा mutational हानि के साथ जाना जाता है। इन सीमाओं के प्रकाश में, नियंत्रण उच्च संक्रमण दर और पछाड़ना दक्षता पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

कुछ अनुप्रयोगों के लिए एक अन्य संभावित सीमा सहायक फेज contaminating के कभार हस्तांतरण है। हालांकि M13K07 एक उत्परिवर्तित पैकेजिंग संकेत होता है, यह फेज उत्पादन और आरंभिक संक्रमण घटना 25 परे फेज के निरंतर प्रसार के लिए सक्षम कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप कम आवृत्ति पर फेज capsid में पैक किया जा सकता है और संक्रमित आबादी को हस्तांतरित। सहायक फेज के लिए संशोधन प्रभावी सिद्ध कर दिया हैकम फेज उत्पादन 26 की कीमत पर अविशिष्ट पैकेजिंग को कम करने, हालांकि कभी कभी।

इंजीनियर जीवाणुभोजी ई के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गए हैं कोलाई सिंथेटिक जीव विज्ञान, एक बढ़ती हुई जनसंख्या के लिए नए जीन की त्वरित डिलीवरी की इजाजत दी। हाल ही में काम कहनेवाला संचार सर्किट 11 उत्पादित या एंटीबायोटिक प्रतिरोध को दबाने के लिए प्रतिलेखन कारक व्यक्त 27 रास्ते है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपकरण है कि प्रोग्राम किया RNAs के माध्यम से जीवाणु शरीर क्रिया विज्ञान के नियंत्रण की अनुमति की बढ़ती संग्रह के लिए कहते हैं। CRISPR कैस न्युक्लिअसिज़, जब nuclease गतिविधि को समाप्त करने के उत्परिवर्तित, आरएनए निर्देशित जीन लक्ष्य 17,28 पर प्रतिलेखन को दबाने के लिए दिखाया गया है। इसके विपरीत, sRNA मुंह बंद translational स्तर पर काम करता है और exogenous प्रोटीन अभिव्यक्ति की आवश्यकता नहीं है। अगली पीढ़ी के जैव प्रौद्योगिकी जटिल pheno कार्यक्रम के लिए फेज की मध्यस्थता वितरण के साथ ट्रांसक्रिप्शनल और translational नियंत्रण को एकजुट कर सकते हैंवास्तविक समय में प्रकार के।

Acknowledgments

इस काम के लिए अनुदान पेरिस Bettencourt iGEM टीम के समर्थन में Fondation Bettencourt Schueller द्वारा प्रदान किया गया। हम तकनीकी सहायता और सलाह के लिए INSERM U1001 रिसर्च यूनिट और Chantal Lotton धन्यवाद। Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP मोनिका Ortiz और स्टैनफोर्ड आकर्षित Endy द्वारा प्रदान किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid Miniprep Kit Qiagen 27104
DpnI Enzyme NEB R0176S
Phusion High Fidelity Polymerase NEB M0530S
Taq 2x Master Mix NEB M0270L
M13KO7 Helper Phage NEB N0315S
DH5α Competent Cells Life Technologies 18265-017
TOP10F' Cells Life Technologies C3030-03
LB Broth Sigma L3022-250G
Ampicillin Sigma A9393-5G
Kanamycin Sigma 60615-5G
Chloramphenicol Sigma C0378-5G
Tetracycline Sigma 87128-25G

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References

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