Abstract
RNA-förmedlad knockdowns används ofta för att kontrollera genuttryck. Denna mångsidiga familj av tekniker använder kort RNA (sRNA) som kan syntetiseras med vilken som helst sekvens och utformats för att komplettera varje gen riktade för ljuddämpning. Eftersom sRNA-konstruktioner kan införas i många celltyper direkt eller med hjälp av en mängd olika vektorer, kan genuttryck undertryckas i levande celler utan mödosam genetisk modifiering. Den vanligaste RNA knockdown teknik, RNA-interferens (RNAi), använder sig av den endogena RNA-induced silencing complex (RISC) medla kvensigenkännande och spjälkning av mål-mRNA. Tillämpningar av denna teknik är därför begränsade till RISC-uttryckande organismer, främst eukaryoter. Nyligen har en ny generation av RNA biotekniker utvecklat alternativa mekanismer för att kontrollera genuttryck genom RNA, och så möjliggjort RNA-medierad gen knockdowns i bakterier. Här beskriver vi en metod för att tysta genen expressionen i E. coli som funktionellt liknar RNAi. I detta system en syntetisk fagemid är utformad för att uttrycka sRNA, vilket kan utformade för att rikta någon sekvens. Expressionskonstrukten levereras till en population av E. coli-celler med icke-lytisk M13-fag, varefter den är i stånd att stabilt replikera som en plasmid. Antisens erkännande och tystande av mål-mRNA förmedlas av Hfq protein, endogena för E. coli. Detta protokoll omfattar metoder för att utforma antisense sRNA, konstruktion fagemidvektorn, förpackning fagemiden i M13 bakteriofag, förbereder en levande cell population för infektion, och utför infektionen själv. Det fluorescerande proteinet mKate2 och antibiotikaresistensgenen kloramfenikolacetyltransferas (CAT) är riktade för att generera representativa data och för att kvantifiera knockdown effektivitet.
Introduction
RNA-medierad gen knockdowns vidare i två etapper. För det första är en RNA-molekyl presenterad för en cellinje eller organism av studien. För det andra, endogena RNA-bindande proteiner underlättar RNA-måligenkännande och producera ljuddämpningseffekten. Alla RNA knockdown teknik gynnas av anpassningsbara karaktären av syntetiska sRNAs, som lätt kan tillverkas för att passa ett specifikt mål av intresse. Men de molekylära detaljerna i RNA upptag och tysta varierar kraftigt mellan modellsystem, begränsar var och hur RNA knockdowns kan tillämpas.
Hos nematoder, dubbelsträngat RNA (dsRNA) molekyler kan introduceras direkt i mediet eller genom att mata maskar med en population av dsRNA-uttryckande E. coli-celler 1,2. I Drosophila, kan RNAi åstadkommas genom microinjecting embryon med dsRNA 3, eller genomförs i cellinjer genom att helt enkelt lägga dsRNA till odlingsmediet 4. I däggdjurscellinjer,syntetiska små störande RNA (siRNA) kan levereras till levande celler genom elektroporation 1,2,5, förpackas i liposomer 3,6, eller uttryckt från DNA-plasmidvektorer 4,7. När väl RNA-slag når cytosolen förlitar sig RNAi pathway på RISC-komplexet för att bearbeta dsRNA, underlätta antisens igenkänning av målet, och katalysera translationell repression, mRNA nedbrytning eller heterokromatin bildning, beroende på värden.
På grund av dessa krav, kan klassisk RNAi endast utföras i organismer som tar upp exogen RNA effektivt och uttrycker RISC eller en RISC-liknande aktivitet. Noterbart utesluter detta modellen bakterien E. coli, som saknar den RNAi pathway. Men de senaste framstegen inom syntetisk biologi ger verktyg för att lösa både leveransproblem och tysta problemet.
I detta protokoll är Srna konstruktioner uttrycks i E. coli från en DNA-vektor som levereras till living celler med M13 fagemid / hjälpare systemet. En fagemid är någon plasmid med en fag-härledd f1 för replikation. En hjälpare plasmid, i det här fallet M13KO, bär alla maskiner som krävs för att producera viruspartiklar, men är inte i sig behörig för replikering och packning. När en fagemid och hjälpare plasmid samtransformeras är fagemiden ensam replik på f1 ursprung, förpackas och utsöndras. Den vektoriserade fagemiden är då behörig att infektera levande E. coli via F pilus.
I detta system är den ljuddämpande effekten som produceras av anpassade sRNA kassetter som kombinerar en byggnadsställning sekvens med en målbindande sekvens. Den målbindande sekvensen är 24 baspar antisens till en mRNA-mål, typiskt vid den ribosom-bindningsstället (RBS). Ställningen sekvensen, som utvecklats av Na och kollegor 8 innehåller en Hfq bindande motiv utvinns ur MICC, en liten reglerande RNA endogen till E. coli. Den Hfq proteinet stimulerar RNA-RNA binding och mRNA nedbrytning, som betjänar en roll i detta system liknande RISC i RNAi. Figur 1 visar en komplett system för fag-medierad Srna knockdowns, inklusive sRNA kassettstrukturen, fagemid vektorisering och tysta mekanism.
Som ett förfarande för att modulera genexpression i E. coli, sRNA ljuddämpning är enkel, snabb och mångsidig. Den riktade E. coli inte belastas utöver föröknings fagemiden och uttrycka sRNA. Detta kan vara relevant i samband med syntetisk biologi eller grundforskning där uttrycket av större heterologa konstruktioner kan anstränga cellulära resurser 9. Fagemider med nya mål kan framställas med en enda PCR och skördades en dag efter fagemid transformation. Slutligen kan nästan alla mRNA riktas. Den sRNA förordningen kassett (på en standard plasmid) har visat sig fungera på en mängd olika mål i ämnesomsättningen med typiska förtryck nivåer> 90% 8.
10. För det första är en förpackad fagemid introduceras till en satsvis odling av E. coli-celler och som används för att tysta expression av det fluorescerande proteinet mKate2. Efterföljande fluorescensförändringar övervakas i realtid. För det andra, knacka ner CAT-genen har visat sig minska fenotypisk kloramfenikolresistens på agarplattor. I båda fallen fagemiden själv bär en GFP markör, vilket gör att infektioner som skall mätas oberoende av knockdown effektivitet.
Protocol
1. Design och konstruktion av fagemidvektorer Bearing sRNA Ljuddämpning Kassetter
- De Novo Design of sRNA Ljuddämpnings Kassetter 8
- Identifiera den kompletta sekvensen av mRNA för att tystas genom att använda en DNA-sekvensdatabas. För att generera målsekvensen, notera den första 24 bp av kodande sekvens, från position 1 till 24 som börjar med startkodonet (t.ex. ATG).
Obs: Tysta är mindre effektivt när andra webbplatser eller delar av mRNA är riktade 8. - Ta det omvända komplementet av målsekvensen för att producera den styrsekvens för sRNA kassetten. Se tabell 1 för exempel på TARGET och GUIDE sekvenser för kloramfenikolacetyltransferas (CAT).
- Att utforma 292 bp komplett sRNA expressionskassett, ordna pr-promotorn, styrsekvens, Hfq proteinbindande domän och T1 / TE transkriptionsterminatorsekvenser i serie (tabell 2).
- Lägg till ytterligare kloningsställen val för att underlätta kloning av sRNA kassetten i målvektorn.
- Erhålla den kompletta sRNA kassetten genom kommersiell gensyntes eller en liknande metod och klona den till en fagemid vektor med en funktionell f1-replikationsursprung 11. Se Bakgrundsinformation för den fullständiga sekvensen för den slutliga fagemidvektorn.
- Identifiera den kompletta sekvensen av mRNA för att tystas genom att använda en DNA-sekvensdatabas. För att generera målsekvensen, notera den första 24 bp av kodande sekvens, från position 1 till 24 som börjar med startkodonet (t.ex. ATG).
- Förändra Sequence Riktade av en befintlig sRNA uttryckskassett med hjälp av PCR-baserad mutagenes 12
- Identifiera den 24 bp GUIDE sekvens i en befintlig sRNA expressionskassett. Obs: Den kommenterade pAB.001 plasmid, som används i detta arbete, är tillgänglig som en kompletterande sekvens fil.
- Design framåt och bakåt primers med korta regioner av homologi till den befintliga sRNA kassetten flankerande den nya 24 bp GUIDE sekvens. Erhålla primers genom kommersiella oligonukleotidsyntes.
Beakta: Primer design för ställesriktad mutagenes är depicted i figur 2. Exakt primer templatsekvenser tillhandahålls i tabell 3. - Förbered en 5 ml kultur av E. coli som bär mallen sRNA expressions fagemid. Odla cellerna över natten vid 37 ° C under skakning, i LB-medium med lämpliga antibiotika.
- Extrahera och rena mallen sRNA uttryck fagemid från 5 ml bakteriekultur med hjälp av en DNA-miniprep kit eller liknande metod 12.
- Förbered två PCR-reaktioner med användning av mall sRNA expressions fagemid och high fidelity-polymeras, ett med den främre och en med den omvända primern (tabell 4). Använda PCR-betingelser såsom rekommenderas av polymeras leverantören (Tabell 5). Öka mallkoncentration 10-50x högre än en vanlig reaktion för att ta hänsyn till det faktum att den enda primern reaktionen inte producerar exponentiell amplifiering.
- Kombinera de två ovanstående PCR-reaktioner i ett mikrocentrifugrör. Anneal produkterna genom upphettning till 98 ° C i ett kokande vattenbad. Omedelbart efter placering av mikrocentrifugrör i vattenbadet, ta bort värmekällan och tillåta badet att långsamt återgå till rumstemperatur under 1-2 h.
- För att eliminera omuterade mall sRNA uttryck fagemid, tillsätt 1 pl. Dpnl restriktionsenzym till blandningen och inkubera vid 37 ° C under en timme, eller den tid som rekommenderas av tillverkaren för fullständig digerering.
Obs: Dpnl smälter bara metylerade målplatser, som är närvarande på värdreplike fagemider men inte PCR-produkter. - Trans köpas eller framställas 13 kemiskt kompetenta E. coli med 1-5 | il av det glödgade PCR-produkten. Isolera enstaka kolonier av den transformerade stammen genom selektiv plätering på LB-agarplattor innehållande lämpliga antibiotika.
- För att kontrollera införlivandet av den korrekta styrsekvens, screena de resulterande kolonier genom koloni-PCR. Med användning av en 200 mikroliter pipettspets, collect en liten mängd celler från en enda transformerad koloni. Mark och bevara den ursprungliga kolonin för nedströmsanvändning efter kontroll.
- Lägga de uppsamlade cellerna till 50 pl nukleasfritt vatten i ett mikrocentrifugrör. Blanda genom att pipettera upp och ner.
- Med användning av en bänk-top termocykler eller ett kokande vattenbad, lysera cellerna genom upphettning till 95 ° C under 2 min.
- PCR-amplifiering av fagemid regionen med användning 1 ni av värmelyserade celler som en DNA-mall. PCR-betingelser och termocykler protokoll tillhandahålls i Tabellerna 6 och 7. Se den supplementära pAB.001 sekvensen filen för verifiering primersekvenser.
- Sekvensera PCR-produkten för att kontrollera införlivandet av den korrekta GUIDE sekvensen.
- Inokulera en 5 ml kultur av E. coli klon som bär sekvensen verifierade sRNA uttryck fagemid. Odla cellerna över natten vid 37 ° C under skakning, i selektivt LB-medium.
- Förbered en glycerol lagerav sekvensen verifierade klon. Med 750 | il av övernattskultur till 250 ul av 60% glycerol i ett skruvlock Cryo röret.
- Lagra glycerolstam vid -80 ° C på obestämd tid. Återstoden av den över natten odlade kulturen kan användas som en källa för den sRNA expression fagemiden i steg 2.
2. Produktion och Skörd av M13-förpackade Fagemidpartiklar Stocks
- Förbered en 5 ml kultur av E. coli som bär den sRNA expressions fagemid. Odla cellerna över natten vid 37 ° C under skakning, i LB-medium med lämpliga antibiotika. Obs! SRNA uttryck fagemid kan erhållas genom de novo kloning som beskrivs i steg 1.1.5, eller modifierad från en befintlig fagemid och skördades i steg 1.2.16.
- På samma sätt förbereda en 5 ml kultur av E. coli som bär den M13KO7 hjälparplasmid. Odla cellerna över natten vid 37 ° C under skakning, i selektivt LB-medium.
- Extrahera och rena den sRNA expression fagemid och hjälpare plasmid med hjälp av en DNA-extraktion kit eller liknande metod 12.
- Cotransform köpt eller framställas 13 kemiskt kompetenta E. coli med 1 pl vardera av sRNA uttryck fagemid och hjälpare plasmid. Välj för cotransformants genom plätering på LB-agar med selektiva antibiotika för båda konstruktionerna.
- Förbered en 10 ml kultur från en enda koloni av samtrans stammen i LB med selektiva antibiotika. Inkubera vid 37 ° C med skakning under 8-12 h eller över natten.
- Centrifugera kulturen vid 3300 xg under 10 min. Samla upp supernatanten och filtrera genom en 0,2 pm filter. Varning: Vid medie spill, rengör området med utspädd blekmedel (0,5%) för att förstöra infektiösa fagpartiklar.
- Förvara den förpackade fagemid filtratet vid 4 ° C. Notera: Prov kan upprätthållas under dagar till veckor utan förlust av aktivitet.
3. Framställning av F + målceller för Ljuddämpning
- Ta reda på om de celler som skall riktas till tysta uttrycka F pilus 14. Om F pilus redan finns, gå vidare till steg 4.
Obs: Vanliga laboratoriestammar av E. coli markeras enligt F + eller F 'för att indikera närvaron av F pilus i sitt genom eller på en plasmid. - Skaffa en F + stam av E. coli såsom TOP10F '.
Observera: Se till att målet stammen bär en unik resistensmarkör för att skiljas från F-plasmiden donator efter konjugering. - Att införa F pilus genom konjugering med en F + stam, förbereda 5 ml kulturer av både målet stammen och F-plasmid givare 14. Odla cellerna över natten vid 37 ° C under skakning, i LB-medium med lämpliga antibiotika.
- Följande dag, späd båda stammarna 1: 100 i 5 ml selektiv LB och fortsätta odlingen vid 37 ° C med skakning.
- Bestämma tillväxtfasen för cellerna genom mätning av optical densiteten för kulturen vid 600 nm (OD 600) med användning av en bords spektrofotometer. Odla cellerna under ca 2 h tills en OD 600 av 0,3 uppnås, vilket indikerar log-fas tillväxt 15.
- Förbereda 3 konjugeringsreaktioner i mikrocentrifugrör: 0,5 ml F-plasmid donator + 0,5 ml mål-stam, 0,5 ml F-plasmid donator + 0,5 ml LB-medium (negativ kontroll) och 0,5 ml mål-stammen + 0,5 ml LB-medium (negativ kontroll). Tillåta konjugering fortgå under 2 h vid 37 ° C med skakning.
- Plattan 100 | il av varje konjugeringsreaktion på selektivt LB-agar med antibiotika som är specifika för F-plasmiden (typiskt tetracyklin) och mål-stam. Plate de negativa kontrollreaktioner för att bekräfta att varken givaren eller mottagaren stam uttrycka båda antibiotika motstånd.
4. Infektion med pakete Fagemider för att tysta
- Inokulera en enda koloni av F + målceller i en 5 ml kultur av LB medien med lämpliga antibiotika. Inkubera över natten vid 37 ° C med skakning.
- Följande dag, späd F + målceller 1: 100 i 5 ml av selektiva LB media och fortsätta att odling vid 37 ° C med skakning.
- Bestämma tillväxtfasen för cellerna genom mätning av den optiska densiteten av kulturen vid 600 nm (OD 600) med användning av en bords spektrofotometer. Odla cellerna under ca 2 h tills en OD 600 av 0,3 uppnås, vilket indikerar log-fas tillväxt 15. Obs: Expression av F pilus och infektionseffektiviteten är högst i log-fas.
- Tillsätt M13 förpackade fagemider (från steg 2,6) till målceller i ett volymförhållande av 1: 100 för att uppnå nästan 99% infektion av målgruppen. Tillåta infektionen att fortskrida vid 37 ° C med skakning under 30-60 min.
- Analysera de sRNA-tystande fenotyp enligt den metod som.
Obs! För ett fluorescerande protein mål, kan ljuddämpningseffekt kvantifierasdirekt genom fluorometri 10. Alternativt kan fenotypiska analyser användas för att observera de fenotypiska konsekvenserna av gen knockdown 8. - Förbered en glycerol lager för sRNA-uttryck fagemid värd att följa stegen 1.2.14-1.2.16. Notera: fagemiden kommer att fortplanta i värdstammen på obestämd tid och kan upprätthållas med antibiotika liknande en konventionell plasmid.
Representative Results
Tysta mKate2 fluorescens i Liquid Media
Figur 1 visar systemet för sRNA-förmedlade knockdowns som beskrivs i detta arbete, inklusive sRNA kassett design, fagemid vektorisering och tysta mekanism. Följande protokoll 1,2 ades sRNA tysta kassetten av plasmid pAB.001 ändras för att rikta mKate. Den sRNA kassetten syntetiserades och klonades i fagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP, en gåva från Monica Ortiz och Drew Endy 11. Denna fagemid bär markörer för GFP uttryck och kanamycinresistens, vilket gör framgångsrika infektioner kan spåras. Paketerade fagemid lager framställdes enligt protokoll 2.
Ett derivat av E. coli K12 MG1655 som bär en konstitutivt uttryckt, kromosomalt integrerad mKate2 markör framställdes för faginfektion genom konjugering med en F-plasmid donatorstam följande protokoll 3. Cellerna odlades till mitten av log-fasen och fagemiden infördes följande protokoll 4. Efter fagemid infektion, var 200 | il kulturer överfördes till en fluorescensplattläsare och fluorescens övervakades kontinuerligt under 24 timmar.
Figur 3 visar effekten av sRNA-medierad tysta på mKate2 uttryck. Stammen infekterade med en anti-mKate2 fagemid visade ingen detekterbar mKate2 fluorescens över bakgrunden. I motsats, denna stam gjorde uttrycka GFP markör, indikerar framgångsrik upptag av fagemiden. Oinfekterade kontrollceller producerade mKate2 fluorescens men inte GFP. En ytterligare kontroll, där anti-mKate2 inriktning domänen ersattes med en sekvens inriktning CAT, hade ingen effekt på mKate2 fluorescens.
Tysta av kloramfenikolresistens på agarplattor
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Efter protokoll 1,1, en sRNA tysta kassett producerades att rikta CAT A-derivat av E. coli K12 MG1655 som bär en konstitutivt uttryckt, var kromosomalt integrerad CAT markör beredd på. faginfektion genom konjugering med en F-plasmid donatorstam följande protokoll 3. cellerna odlades till mitten av log-fasen och fagemiden infördes följande protokoll 4. efter en timme av inkubering vid 37 ° C, infekterades cellerna seriespäddes och ströks ut vid en utbud av kloramfenikol koncentrationer. Plattorna inkuberades över natten, och andelen resistenta celler vid varje kloramfenikol koncentration bestämdes genom att räkna kolonibildande enheter (CFU) nästa dag.Figur 4 visar effekten av sRNA-medierad ljuddämpning på kloramfenikolresistens fenotyp. Oinfekterade celler eller celler som infekterats med fagemid targeting mKate2, var resistenta motkloramfenikol vid alla testade koncentrationer. I kontrast, celler infekterade med fagemid targeting CAT visade minskad överlevnad vid låga kloramfenikol koncentrationer, och nästan 99% dödande vid högre koncentrationer. Tillsatsen av ampicillin, för att välja endast bakteriebärande fagemiden, minskade kloramfenikol överlevnad till omätbara nivåer. Detta överensstämmer med tidigare arbete som visar att fly från fag-infektion är en vanlig väg att undkomma ljuddämpnings 10.
Figur 1: geners i E. coli med sRNA Expression kassetter levereras av M13-fag Den sRNA kassetten består av 4 moduler:. PR-promotorn (en konstitutiv promotor från bakteriofag lambda), en 24 bp inriktning domän, en Hfq bindande domän som extraherats från MICC och en transkriptionsterminator 8 E. coli som uttrycker F pilus, där sRNA expression börjar. Den sRNA rekryterar sedan Hfq protein (visas i rött) och binder en antisens-mRNA mål nära ribosombindningsstället, vilket resulterar i translations förtryck och mRNA nedbrytning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Primer Design och ställesriktad mutagenes av sRNA målstället Två primrar är utformade med partiell homologi till en befintlig sRNA kassett. Den framåtriktade primern innehåller 20 bp homolog med pR-promotor vid 5'-änden, följt av24 bp som representerar den nya styrsekvens, därefter 18 bp homolog med Hfq bindande domän vid 3'-änden. Den omvända primern är den exakta omvända komplementet till den framåtriktade primern, med regioner av homologi till den befintliga sRNA kassetten flankerar det omvända komplementet av den nya styrsekvens. Exakta primersekvenser ges i Tabell 3. Separata single-primer PCR-reaktioner med den framåtriktade och den bakåtriktade primrarna producerar linjär, enkelsträngad DNA med den önskade modifierade sekvensen. Glödgning av framåt och bakåt reaktionsprodukter efter sanering som beskrivs i protokollet, resulterar i dubbelsträngad plasmid-DNA som bär den önskade modifierade sRNA kassett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Knockdown av en kromosomalt integrerad mKate2 Fluorescerande Reporter. E. coli MG1655 K12 uttrycker mKate2 lämnades antingen obehandlade (röda linjer och barer), infekterade med en anti-mKate2 fagemid (gröna linjer och barer), eller infekterade med en styr fagemid inriktning CAT (blå linjer och barer). (A) Obehandlad E. coli växte till högre mättnadstäthet, vilket tyder på en metabolisk kostnad för fag-infektion. Streckade linjerna indikerar standardavvikelser för 3 replikat. (B) mKate2 signalen reducerades till nära bakgrundsnivåerna i anti-mKate2 behandlade stammen, men inte i kontrollstammar. (C) GFP fluorescens, transporteras också av fagemiden, kunde påvisas endast i fagemid-behandlade kontroller. (D, E) Slutliga fluorescensavläsningar efter 24 timmar av tillväxten normaliserades till OD. GFP signal, som indikerar fagemid infektion, var frånvarande i obehandlade kontroller, men också väsentligt reducerad efter anti-CAT phagemid behandling. Detta kan tyda på off-target effekterna av fagemiden. Den mKate2 signalen reducerades med anti-mKate2 fagemid-behandling jämfört med obehandlade kontroller. CAT-riktade kontroll fagemid visade ingen effekt på mKate2 fluorescens. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 3 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Knockdown av CAT Åter Chloramphenicol Känslighet för en genetiskt resistent Population E.. coli MG1655 K12 uttrycker en kromosomalt integrerad CAT-gen lämnades obehandlade (röda staplar), behandlades med en kontroll fagemid inriktning mKate2 (gröna staplar) eller behandlas med en fagemid som uttrycker en anti-CAT sRNA (blå staplar). Efter en timme av infektion, lönsamhet på den angivna antibiotics bedömdes genom seriespädningar och plätering. Stammar som behandlats med anti-CAT fagemid signifikant dödades (> 90%) av kloramfenikol vid högre koncentrationer, medan kontrollbehandlingar var opåverkad. Lägga ampicillin till odlingsplattor väljer positivt för fagemid infektion och eliminerar oinfekterade celler. Under dessa betingelser, observerades inga kloramfenikolresistenta kolonier observerades efter anti-CAT-behandling. Detta tyder på att de flesta överlevande representerar ett fel på infektion, snarare än ett fel i tystande. Felstaplar representerar standardavvikelsen för 3 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| CAT målsekvens | 5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3' |
| CAT GUIDE sekvens | 5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3' |
Tabell 1:. Ett exempel TARGET och styrsekvens för CAT-genen Observera det omvända komplementet relationen.
| pR-promotor | TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC | ||||
| GUIDE sekvens | ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT | ||||
| Hfq bindande domänen | TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG | ||||
| T1 / TE-terminatorn | CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA | ||||
Tabell 2:. Sekvens Komponenter i sRNA Cassette Varje sekvens är skriven 5'-3 '. Den kompletta kassetten är en sammansättning av dessa 4 element i ordning och omfattar 292 bp.
| Forward Primer | 5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3' |
| Reverse Primer | 5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3' |
Tabell 3: Primer Design att påverka de befintliga styrelement Den främre primern innehåller de sista 20 bp av pR-promotor, den nya styrsekvens, och det första 18 bp av Hfq-bindande domänen.. Målsekvensen är den exakta omvända komplementet till GUIDE sekvensen. Den omvända primern är den exakta omvända komplementet till den framåtriktade primern.
Tabell 4: Föreslagna Villkor för Single-Primer mutagen PCR.
| Steg | temp | Tid |
| initial denaturering | 98 ° C | 30 sek |
| 30 cykler | 98 ° C | 10 sek |
| 55 ° C | 30 sek | |
| 72 ° C | 120 sek | |
| slutlig förlängning | 72 ° C | 300 sek |
| Lagring | 10 ° C |
Tabell 5: Föreslagna Termo protokollet om Single-Primer mutagen PCR.
| Komponent | Volym |
| mall-DNA | 1 pl |
| 10 | iM Forward Primer | 0,5 ^ |
| 10 | iM Reverse Primer | 0,5 ^ |
| Taq 2X Master Mix | 25 ^ |
| Nukleasfritt water | 23 | il |
| total volym | 50 ^ |
Tabell 6: Föreslagna villkor för sekvensverifiering PCR.
| Steg | temp | Tid |
| initial denaturering | 95 ° C | 30 sek |
| 30 cykler | 95 ° C | 30 sek |
| 55 ° C | 30 sek | |
| 68 ° C | 30 sek | |
| slutlig förlängning | 68 ° C | 300 sek |
| Lagring | 10 ° C |
Tabell 7: Föreslagna Thermocycler Proprotokoll för sekvensverifiering PCR.
Discussion
Föreliggande förfarande uppnås 80% minskning av mKate fluorescens nivåer jämfört med oriktade kontroller. Detta är i linje med andra RNA-knockdown metoder, där hela ljuddämpnings inte observeras och 50-90% verkningsgrad är typiskt 16,17. På fenotypisk nivå, CAT inriktade knockdowns kunde avsevärt dämpa kloramfenikolresistens och eliminera det under vissa förhållanden.
Den knockdown fenotyp kunde detekteras på befolkningsnivå efter bara några timmar efter infektion (Figur 3B). Detta illustrerar en viktig egenskap hos fag-baserade leverans: en hög knockdown frekvens kan erhållas direkt i satsvis odling utan föregående genetisk modifiering. Till skillnad från konventionella genetiska modifieringar som använder plasmid transformation eller genomisk integration, inte fag infektionen inte kräva att en population åter vuxit från en enda isolerad koloni. Detta tillåter effekterna av faginfektion vara explored i populationer med komplexa rumsliga dynamik 11, med redan existerande rumsliga strukturer som biofilmer 18, eller i genetiskt blandade naturliga populationer 19.
Ett kritiskt steg i denna metod är framställningen av förpackade fagemid med hög titer. Den metaboliska bördan i samband med produktion fagpartikel kan leda till höga mutation eller plasmid förlust i fagemiden produktionsstammen. Det rekommenderas att fagemid produktionsstammen odlas direkt från en enda samtrans koloni och inte kylda, frysta eller under odlas före fag skörd. En låg effektivitet av co-transformation kan också iakttas vid införandet av fagemiden och hjälpare plasmid till E. coli samtidigt. I detta fall kan högre effektivitet erhållas genom transformering av hjälpar-plasmiden först och sedan framställa kompetenta celler som är försedda med hjälpar-plasmid för efterföljande transformation med fagemiden.
Phagemid infektion eller sRNA uttryck innebär också en påvisbar metabolisk börda för målceller, och kan resultera i viss fenotypisk störning. Till exempel var en minskning av mKate2 fluorescens observerades även när cellerna infekterades med en fagemid inriktning CAT (Figur 3). Infektion med M13 är inte tänkt att utlösa systemstressreaktioner i E. coli 20, men kan förändra transkriptionsmönster indirekt. Alternativt kan GFP eller ampicillin resistensmarkörer inkluderade på fagemiden konkurrerar om cellulära resurser, vilket minskar mKate2 uttryck och tillväxt 9. Slutligen kan sRNA själva kassetten globalt förändra genuttrycksprofilerna genom titrering av Hfq proteinet, eller genom off-mål-mRNA ljuddämpning. Från målet effekter är vanliga i in vivo RNAi inriktning 21-23, men de har ännu inte utretts systematiskt för det här systemet.
En begränsning med denna metod är att infektionen effiteten är mindre än 100%, vilket gör att vissa icke-infekterade bakterier att kvarstå i populationen. Resultatet av detta arbete och tidigare arbete 10 tyder på att icke-infekterade celler representerar 1-10% av den slutliga befolkningen, och är ansvariga för de flesta av de nonsilenced fenotyper observerats. En mängd olika vägar till M13-motstånd är kända, med de vanligaste är mutations förlust av pilus uttryck 24. Mot bakgrund av dessa begränsningar, bör kontroller användas för att bekräfta höga infektionshastigheter och knockdown effektivitet.
En annan potentiell begränsning för vissa tillämpningar är tillfällig överföring av kontamine hjälparfag. Även M13K07 innehåller en muterad packningssignal, kan den förpackas i fagkapsiden vid låg frekvens och överförs till infekterade populationer, vilket resulterar i celler som är behöriga för fagproduktion och fortsatt spridning av fag bortom den initiala infektionen händelsen 25. Modifieringar av hjälparfag har visat sig effektivaatt minska ospecifik förpackningar, även om det ibland på bekostnad av minskad fagproduktion 26.
Konstruerad bakteriofager har blivit ett oumbärligt verktyg för E. coli syntetisk biologi, vilket möjliggör snabb leverans av nya gener till en växande befolkning. Senaste arbete har producerat interkommunikationskretsar 11 eller uttryckt transkriptionsfaktorer för att undertrycka antibiotikaresistens vägar 27. Protokollet presenteras här bidrar till en växande samling av verktyg som gör kontroll av bakteriell fysiologi genom programmerade RNA. Crispr-Cas nukleaser, när muteras för att eliminera nukleasaktivitet, har visat sig undertrycka transkription vid RNA-styrda genmål 17,28. I motsats härtill arbetar sRNA tystande på den translationella nivån och inte kräver exogen proteinuttryck. Nästa generations bioteknik kan förena transkriptionell och translationell kontroll med fag-medierad leverans att programmera komplexa Fenoltyper i realtid.
Acknowledgments
Finansieringen av detta arbete lämnades av Fondation Bettencourt Schueller stöd för Paris Bettencourt iGEM laget. Vi tackar INSERM U1001 forskningsenheten och Chantal Lotton för tekniskt stöd och rådgivning. Fagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP från Monica Ortiz och Drew Endy av Stanford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
| M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
| DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
| LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
| Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
| Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G |
References
- Ohkumo, T., Masutani, C., Eki, T., Hanaoka, F.
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. J Vis Exp. (50), e2477 (2011).
- Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells. Nat Protoc. 2 (9), 2245-2264 (2007).
- Tsong, T. Y.
- Kim, W. J., Chang, C. -W., Lee, M., Kim, S. W. Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy. J Control Release. 118 (3), 357-363 (2007).
- Shi, Y.
- Na, D., Yoo, S. M., Chung, H., Park, H., Park, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs. Nat Biotechnol. 31 (2), 170-174 (2013).
- Ceroni, F., Algar, R., Stan, G. -B., Ellis, T. Quantifying cellular capacity identifies gene expression designs with reduced burden. Nat Methods. 12 (5), 415-418 (2015).
- Libis, V. K., Bernheim, A. G., et al. Silencing of Antibiotic Resistance in E. coli with Engineered Phage Bearing Small Regulatory RNAs. ACS Synth Biol. 3 (12), 1003-1006 (2014).
- Ortiz, M. E., Endy, D. Engineered cell-cell communication via DNA messaging. J Biol Eng. 6 (1), 16 (2012).
- Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnol. 9 (1), 61 (2009).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Recombinant DNA Part I. , 621-627 (1993).
- Phornphisutthimas, S., Thamchaipenet, A., Panijpan, B.
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat Rev Genet. 5 (5), 355-365 (2004).
- Qi, L. S., Larson, M. H., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
- Lu, T. K., Collins, J. J. Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (27), 11197-11202 (2007).
- Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (23), 7267-7272 (2015).
- Karlsson, F., Malmborg-Hager, A. -C., Albrekt, A. -S., Borrebaeck, C. A. K. Genome-wide comparison of phage M13-infected vs. uninfected Escherichia coli. Can J Microbiol. 51 (1), 29-35 (2005).
- Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Caveat of RNAi in plants: the off-target effect. Methods in molecular biology. 744, Clifton, N.J. 13-25 (2011).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 57-67 (2010).
- Cho, S. W., Kim, S., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
- Hagens, S., Blasi, U. Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study. Lett Appl Microbiol. 37 (4), 318-323 (2003).
- Kasman, L. M., Kasman, A., Westwater, C., Dolan, J., Schmidt, M. G., Norris, J. S. Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy. J Virol. 76 (11), 5557-5564 (2002).
- Chasteen, L., Ayriss, J., Pavlik, P., Bradbury, A. R. M. Eliminating helper phage from phage display. Nucleic Acids Res. 34 (21), e145 (2006).
- Lu, T. K., Collins, J. J. Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4629-4634 (2009).
- Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., Marraffini, L. A. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7429-7437 (2013).
