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Biology

DamID-सेक: Adenine-methylated डीएनए टुकड़े के उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा प्रोटीन डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण

Published: January 27, 2016 doi: 10.3791/53620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

हम उच्च throughput अनुक्रमण (DamID-सेक) के लिए डीएनए एडिनाइन मिथाइल पहचान (DamID) युग्मन द्वारा इस के साथ साथ एक परख का वर्णन है। यह बेहतर तरीका एक उच्च संकल्प है और एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान करता है, और अनुमति देता है आदि चिप seq, आरएनए-सेक के रूप में अन्य उच्च throughput अनुक्रमण डेटा के साथ संयोजन के रूप में DamID-सेक डेटा का विश्लेषण

Introduction

डीएनए एडिनाइन मिथाइल पहचान (DamID) 1,2 विवो में प्रोटीन, डीएनए बातचीत का पता लगाने के लिए एक विधि है और chromatin immunoprecipitation (चिप) 3 के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। यह कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम राशि का उपयोग करता है और डीएनए या एक अति विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन की रासायनिक पार से जोड़ने की आवश्यकता नहीं है। लक्ष्य प्रोटीन शिथिल या परोक्ष रूप से डीएनए के साथ जुड़ा हुआ है जब उत्तरार्द्ध विशेष रूप से उपयोगी है। DamID सफलतापूर्वक परमाणु लिफाफा प्रोटीन 4-10, क्रोमेटिन जुड़े प्रोटीन 11-13, क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों 14, प्रतिलेखन कारक है और 15-18 सह कारकों और आरएनएआई मशीनरी 19 सहित प्रोटीन की एक किस्म के बंधन साइटों नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विधि एस सहित कई जीवों में लागू है cerevisiae 13, एस pombe 7, सी एलिगेंस 9,17, डी मेलानोगास्टर 5,11,18,20, ए 21,22 और साथ ही माउस और मानव कोशिका लाइनों 6,8,10,23,24 thaliana।

DamID परख के विकास अंतर्जात एडिनाइन मिथाइलेशन 2 की कमी है कि कोशिकाओं में एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े की विशिष्ट पहचान के आधार पर किया गया था। ब्याज और ई के डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन से मिलकर एक व्यक्त संलयन प्रोटीन, कोलाई डीएनए एडिनाइन मिथाइल (बांध), स्थानिक निकटता में (सबसे महत्वपूर्ण 1 केबी के भीतर और ऊपर लगभग 5 केबी) कर रहे हैं जीनोम 2 में प्रोटीन की बाध्यकारी साइटों के लिए कि GATC दृश्यों में एडिनाइन आधार methylate सकते हैं। संशोधित डीएनए टुकड़े विशेष रुचि 1,25,26 के प्रोटीन के जीनोमिक बाध्यकारी साइटों का पता लगाने के प्रोटीन को परिलक्षित और संकरित जा सकता है। यह मूल DamID विधि प्रोटीन की उपलब्धता और पूर्व निर्धारित जांच के घनत्व द्वारा सीमित था। इसलिए हम में उच्च throughput अनुक्रमण एकीकृत हैDamID 10 और DamID-सेक के रूप में विधि नामित। कम से बड़ी संख्या में DamID-सेक से उत्पन्न पढ़ता जीनोम चौड़ा प्रोटीन डीएनए बातचीत की सटीक स्थानीयकरण सक्षम बनाता है। हम DamID-सेक जीनोम परमाणु पटल (एनएल) संघों 10 के अध्ययन के लिए माइक्रोएरे द्वारा DamID तुलना में एक उच्च संकल्प है और एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान की है कि पाया। यह बेहतर तरीका जीन संरचनाओं 10 के भीतर नाथन संघों की जांच कर रही अनुमति देता है और इस तरह के चिप seq और आरएनए seq के रूप में अन्य उच्च throughput अनुक्रमण डेटा, साथ तुलना की सुविधा।

यहाँ वर्णित DamID-सेक प्रोटोकॉल शुरू में मानचित्रण जीनोम नाथन संघों 10 के लिए विकसित किया गया था। हम ई करने के लिए माउस या मानव Lamin बी 1 tethering द्वारा एक संलयन प्रोटीन उत्पन्न कोलाई डीएनए एडिनाइन मिथाइल और C2C12 माउस (डेटा प्रकाशित नहीं) 10 और IMR90 मानव भ्रूण फेफड़ों fibroblasts myoblasts, 3T3 माउस भ्रूण fibroblasts में प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। इस प्रोटोकॉल में, हम ग के साथ शुरूवैक्टर onstructing और स्तनधारी कोशिकाओं 24 में lentiviral संक्रमण से बांध सीमित संलयन प्रोटीन व्यक्त। अगला, हम एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े amplifying और अन्य जीवों में लागू किया जाना चाहिए कि अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी की विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है।

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Protocol

1. जनरेशन और फ्यूजन प्रोटीन और नि: शुल्क बांध प्रोटीन की अभिव्यक्ति

  1. DamID वेक्टर में ब्याज का क्लोन प्रोटीन।
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार ब्याज (POI) के प्रोटीन वांछित उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग और उचित प्राइमरों के सीडीएनए बढ़ाना। प्रयोगात्मक सम्मिलित करता है की उचित प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम प्रवर्धन शर्तों का निर्धारण।
    2. एक agarose जेल चलाने के लिए और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार जेल निकासी किट द्वारा POI के प्रवर्धित सीडीएनए शुद्ध।
    3. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बीपी Clonase द्वितीय का उपयोग pDONR201 वेक्टर में POI के क्लोन सीडीएनए।
    4. POI fusing के वांछित दिशा पर निर्भर करता है, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एलआर Clonase द्वितीय का उपयोग pLGW-RFC1-वी 5-EcoDam गंतव्य वेक्टर या pLGW-EcoDam-वी 5-RFC1 गंतव्य वेक्टर 27 में दाता वेक्टर से POI के सीडीएनए क्लोन एन टर्मिनस या वीं के लिएई के ई सी टर्मिनस कोलाई डीएनए एडिनाइन मिथाइल (EcoDam) 27।
    5. क्लोन किया सीडीएनए में फ्रेम संलयन EcoDam के लिए एक सही क्रम और रूपों है कि अनुक्रमण द्वारा सत्यापित करें।
  2. Lentiviral शेयरों उत्पन्न करता है।
    1. Lentiviral अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर बांध-वी 5-POI और (pLGW-वी 5-EcoDam वेक्टर 27 से) वी 5-बांध व्यक्त lentiviral शेयरों उत्पन्न करता है। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार आगे अभिकर्मक प्रक्रिया का प्रयोग करें।
      1. अभिकर्मक के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार lentiviral शेयरों उत्पन्न करने के लिए 293T कोशिकाओं और lipofection का प्रयोग करें।
      2. 0.45 माइक्रोन PVDF फिल्टर कदम शामिल हैं।
  3. Lentivirus के साथ कोशिकाओं को संक्रमित।
    1. संक्रमण (0 दिन) के पहले दिन, के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ही विकास मीडिया का उपयोग कर एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट को यह सेल प्रकार के लिए उचित विकास मीडिया में सुसंस्कृत पक्षपाती कोशिकाओं पारितसंक्रमण के दिन पर 50% संगम को प्राप्त करने। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह कोशिकाओं।
    2. संक्रमण (1 दिवस) के दिन, एक से बांध-वी 5-POI और वी 5-डैम दोनों lentiviral supernatants के 2 cryovials हटाने -80 सी फ्रीजर और जगह ° पिघलना करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
      1. कोशिकाओं से विकास मीडिया निकालें और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना नए सिरे से विकास मीडिया के 0.5 मिलीलीटर के साथ बदलें।
      2. प्रत्येक अच्छी तरह से (वी 5-डैम के साथ 2 कुओं और बांध-वी 5-POI के साथ 2 कुओं) को thawed lentivirus के 1 मिलीलीटर जोड़ें। शेष 2 के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें कुओं-यह एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा। धीरे मिश्रण और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर हे / एन में वापस जगह के लिए 6 अच्छी तरह से थाली हिला।
    3. संक्रमण (2 दिन) के बाद दिन, कोशिकाओं से वायरल निलंबन हटाने और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 2 मिलीलीटर विकास मीडिया के साथ बदलें। वापस 48 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह कोशिकाओं।
  4. GDNA अलग।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से और डी से महाप्राण मीडिया250 μl 0.05% ट्रिप्सिन- EDTA का उपयोग tach कोशिकाओं। 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर विकास मीडिया और पिपेट कोशिकाओं के साथ थाली से कोशिकाओं को धो लें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं।
    3. आरटी पर 2 मिनट के लिए 200 XG पर pelleted 500 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज धो लें।
    4. 200 μl पीबीएस में pelleted कोशिकाओं Resuspend।
    5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार रक्त और ऊतक किट द्वारा gDNA अलग। Elute 200 μl बफर एई में gDNA और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 260 आयुध डिपो को मापने के द्वारा एकाग्रता का निर्धारण।
      नोट: gDNA असंक्रमित या नकली संक्रमित कोशिकाओं से नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अलग किया जा सकता है। लंबी अवधि के भंडारण के लिए उच्च सांद्रता के gDNA वेग।
      1. 100% इथेनॉल के 3 संस्करणों और 3 एम सोडियम एसीटेट (5.5 पीएच) के 0.1 मात्रा में जोड़ें, और ट्यूब 4-6 बार inverting द्वारा मिश्रण।
      2. -20 डिग्री सीओ / एन पर स्टोर।
      3. 16,000 एक्स पर अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए जी।
      4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर 70% (मात्रा / मात्रा) इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज के साथ छर्रों धो लें।
      5. ध्यान से आरटी पर 3 मिनट के लिए सूखी हवा छर्रों इथेनॉल हटाने और अनुमति देते हैं।
      6. / Μl लगभग 1 ग्राम के लिए टी 10 ई 0.1 (7.5 पीएच) में gDNA भंग। प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना या नकारात्मक नियंत्रण और एकाग्रता को मापने से पूल gDNA। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. बढ़ाना Adenine-methylated डीएनए टुकड़े

  1. केवल एडिनाइन-methylated GATCs कटौती की है कि DpnI साथ डाइजेस्ट gDNA।
    1. 2.5 माइक्रोग्राम gDNA, 1 μl 10x बफर, 0.5 μl DpnI (20 यू / μl) के साथ बर्फ पर एक प्रतिक्रिया की स्थापना की और 10 μl की कुल मात्रा के लिए एच 2 ओ के साथ भरें। और दो ​​डब्ल्यू (0.5 μl एच 2 ओ के साथ DpnI की जगह है, "कोई DpnI") DpnI के बिना एक - प्रत्येक gDNA नमूना के लिए, तीन प्रतिक्रियाओं को तैयार("DpnI के साथ") ith DpnI।
    2. डाइजेस्ट हे / 37 डिग्री सेल्सियस पर एन और 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर DpnI निष्क्रिय।
  2. DamID एडेप्टर ligate।
    1. DamID एडेप्टर तैयार करें।
      1. 100 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए एच 2 ओ में दो DamID एडाप्टर ओलिगोस 24 में से प्रत्येक के Resuspend।
      2. , दो DamID एडाप्टर ओलिगोस की बराबर मात्रा का मिश्रण मिश्रण है और एक कसकर बंद ट्यूब में जगह है। Parafilm के साथ ट्यूब सील, 90 डिग्री सेल्सियस पर पानी से भरा एक बीकर में एक रैक और जगह में बैठते हैं। ट्यूब की टोपी के नीचे पानी का स्तर रखें लेकिन oligo मिश्रण की सतह से ऊपर (ट्यूब में हो रही पानी से बचने के लिए)।
      3. इसलिए एडेप्टर पानी रखना धीरे धीरे आरटी के लिए पानी शांत करते हैं।
      4. -20 डिग्री सेल्सियस पर annealed एडाप्टर (50 माइक्रोन) और दुकान विभाज्य।
    2. बर्फ पर एक प्रतिक्रिया को निर्धारित करें। 2.1.2 से प्रत्येक ट्यूब में, 6.2 μl एच 2 ओ, 2 μl 10x बंधाव बफर, 0.8 μl 50 माइक्रोन DamID विज्ञापन जोड़नेaptors (बर्फ पर thawed) और 1 μl टी -4 डीएनए ligase (5 यू / μl)। कुल मात्रा 20 μl है। । ट्यूब "DpnI के साथ" दो में से एक में, 1 μl एच 2 ओ ("कोई ligase") के साथ ligase की जगह प्रत्येक gDNA नमूना दो नकारात्मक नियंत्रण है कि नोट - "कोई DpnI" और "कोई ligase"।
    3. Ligate हे / 16 डिग्री सेल्सियस पर एन और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ligase निष्क्रिय।
  3. DpnII साथ डाइजेस्ट डीएनए unmethylated GATCs होते हैं कि टुकड़े को नष्ट करने के लिए।
    1. बर्फ पर एक प्रतिक्रिया को निर्धारित करें। 2.2.3 से प्रत्येक ट्यूब में, 24 μl एच 2 हे, 5 μl 10x DpnII बफर और 1 μl DpnII (10 यू / μl) जोड़ें। कुल मात्रा 50 μl है।
    2. 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डाइजेस्ट और 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर DpnII निष्क्रिय।
  4. एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े बढ़ाना।
    1. 2.3.2 से, 5 μ पचाने DpnII 5 μl के साथ बर्फ पर एक प्रतिक्रिया सेट अपएल 10x पीसीआर बफर, 12.5 μl 5 माइक्रोन DamID पीसीआर μl 10 मिमी dNTP मिश्रण प्राइमर 24, 4, 1 μl 50x पोलीमर्स मिश्रण और 22.5 μl एच 2 ओ कुल मात्रा 50 μl है।
    2. इस प्रकार के रूप पीसीआर चलाने: 68 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए; 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट, 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 4 चक्र; 1 मिनट, 1 मिनट, 2 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 17 चक्रों।
    3. एक 1% agarose जेल पर प्रत्येक प्रतिक्रिया से 5 μl पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें। पीसीआर उत्पादों 0.2 से 2 केबी (चित्रा 2) को लेकर एक धब्बा के रूप में प्रकट करना चाहिए। "कोई DpnI" और "कोई ligase" नियंत्रण नहीं या स्पष्ट रूप से कम प्रवर्धन चाहिए।
    4. कदम 2.4.3 से परिणाम संतोषजनक है, तो प्रयोगात्मक नमूने के लिए दो या तीन प्रतिक्रियाओं और दो नकारात्मक नियंत्रण से प्रत्येक के लिए एक प्रतिक्रिया के साथ कदम 2.4.1-2.4.3 दोहराएँ।
    5. पूल उसी से पीसीआर उत्पादों को शुद्ध औरनिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट या ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मनकों का उपयोग कर प्रयोगात्मक नमूना। "कोई DpnI" या "नहीं ligase" नियंत्रण को शुद्ध नहीं है। बफर ईबी के साथ डीएनए Elute।
    6. चारों ओर 0.1 माइक्रोग्राम / μl या अधिक होना चाहिए जो एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, का उपयोग करते हुए 260 आयुध डिपो को मापने के द्वारा शुद्ध डीएनए की एकाग्रता उपाय। प्रत्येक नमूना के लिए 10 माइक्रोग्राम डीएनए की एक न्यूनतम ले लीजिए। पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करते हैं, तो एक स्तंभ के साथ प्रत्येक 50 μl पीसीआर उत्पादों को शुद्ध 30 μl बफर ईबी में elute और eluates पूल।
  5. DpnII साथ डाइजेस्ट डीएनए अनुक्रम किया जा रहा से DamID पीसीआर प्राइमरों रोकने के लिए।
    1. एक 2.4.6 से 5 ग्राम शुद्ध डीएनए के साथ बर्फ पर प्रतिक्रिया, 5 μl 10x DpnII बफर, 1 μl DpnII (10 यू / μl) की स्थापना की और 50 μl की कुल मात्रा के लिए एच 2 ओ के साथ भरें। प्रत्येक नमूने के लिए दो या तीन प्रतिक्रियाओं तैयार करें।
    2. 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डाइजेस्टऔर 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर DpnII निष्क्रिय।
    3. पूल निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट या SPRI मोतियों के साथ एक ही नमूना से हज़म शुद्ध और। बफर ईबी के साथ डीएनए Elute।
    4. चारों ओर 0.06 माइक्रोग्राम / μl या अधिक होना चाहिए, जो शुद्ध डीएनए की एकाग्रता उपाय। प्रत्येक नमूना के लिए 6 ग्राम डीएनए की एक न्यूनतम ले लीजिए। पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करते हैं, तो 30 μl बफर ईबी में elute, प्रत्येक 50 μl एक स्तंभ के साथ पचा शुद्ध और eluates पूल।

उच्च throughput अनुक्रमण के लिए 3. पुस्तकालय तैयारी

  1. टुकड़ा डीएनए
    1. प्रयोगात्मक dsDNA Fragmentase के प्रत्येक नए बैच के लिए उचित पाचन समय निर्धारित करते हैं। एंजाइम की गतिविधि समय के साथ कम हो सकती है, के रूप में एक नया प्रयोग के प्रदर्शन से पहले परीक्षण दोहराना। वास्तविक विखंडन के लिए 2.5.4 से डीएनए बचाने के लिए, पिछले experime से 2.4.6 या अतिरिक्त डीएनए से शुद्ध मिथाइल पीसीआर उत्पादों का उपयोगइस कदम पर एनटीएस।
      1. एक 6 ग्राम डीएनए के साथ मास्टर मिश्रण, 12 μl 10x Fragmentase बफर सेट अप और 114 μl की कुल मात्रा के लिए एच 2 ओ के साथ भरें।
      2. भंवर 3 सेकंड के लिए Fragmentase शेयर शीशी, मास्टर मिश्रण में 6 μl जोड़ने और 3 सेकंड के लिए मास्टर मिश्रण भंवर। कुल मात्रा 120 μl है।
      3. अशेष 5 नए नलियों से प्रत्येक के लिए मास्टर मिश्रण के 20 μl। 10 मिनट की एक वेतन वृद्धि पर 5 मिनट से 55 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी 6 ट्यूबों सेते हैं। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5 μl 0.5 एम EDTA जोड़ें।
      4. 12.5 μl प्रत्येक प्रतिक्रिया के (0.5 माइक्रोग्राम डीएनए) के साथ-साथ एक agarose जेल पर 0.5 ग्राम पचाया डीएनए (चित्रा 3) को पचाने का विश्लेषण करें। चारों ओर 0.2 केबी के लिए धब्बा के बहुमत को पचाने के लिए आवश्यक कम से कम समय (टी 0.2kb) निर्धारित करते हैं। वास्तविक विखंडन के लिए समान वेतन वृद्धि के साथ (5 मिनट और टी 0.2kb सहित) 5 मिनट और टी 0.2kb के बीच 6 समय अवधियों का चयन करें।
    2. वास्तविक fragmen सेट अपtation रूप 3.1.1.1-3.1.1.3 में वर्णित है। 3.1.1.4 में निर्धारित समय अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
    3. पूल 6 प्रतिक्रियाओं और पीसीआर शुद्धि किट या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार SPRI मोतियों के साथ हज़म शुद्ध। 51 μl बफर ईबी में डीएनए Elute। अंतिम eluate ~ 50 μl है।
  2. मरम्मत खंडित डीएनए के समाप्त हो जाती है
    1. 3.1.3 से eluate, 25 μl एच के साथ बर्फ पर एक प्रतिक्रिया सेट अप 2 हे, 10 μl 10 मिमी एटीपी के साथ 10x टी -4 डीएनए ligase बफर, 4 μl 10 मिमी dNTP मिश्रण, 5 μl टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ (3 यू / μl) , 1 μl Klenow डीएनए पोलीमरेज़ (5 यू / μl), और 5 μl टी -4 polynucleotide काइनेज। कुल मात्रा 100 μl है। विंदुक के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। फोम और बुलबुले से बचें।
    2. 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. पीसीआर शुद्धि किट या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार SPRI मोतियों के साथ डीएनए शुद्ध। 33 μl बफर ईबी में डीएनए Elute। अंतिम eluate ~ 32 & # है181, एल।
  3. 'ए' overhangs जोड़ें
    1. एक 3.2.3 से eluate के साथ बर्फ पर प्रतिक्रिया, 5 μl 10x Klenow बफर, 10 μl 1 मिमी dNTP, और 3 μl Klenow (3 '→ 5' exo-) (5 यू / μl) की स्थापना की। कुल मात्रा 50 μl है। विंदुक के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। फोम और बुलबुले से बचें।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. पीसीआर शुद्धि किट या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार SPRI मोतियों के साथ डीएनए शुद्ध। 22 μl बफर ईबी में डीएनए Elute। अंतिम eluate ~ 21 μl है।
  4. Ligate अनुक्रमण एडेप्टर
    1. अनुक्रमण एडेप्टर 28 तैयार करें।
      1. 10 मिमी Tris सीएल (पीएच 7.8), 0.1 मिमी EDTA (8.0 पीएच) और 50 मिमी NaCl में 100 माइक्रोन की एकाग्रता के लिए प्रत्येक एडाप्टर oligo Resuspend।
      2. सार्वभौमिक अनुकूलक 28 और एक अनुक्रमित एडाप्टर 28 की बराबर मात्रा में मिलाएं।
      3. निम्नलिखित के साथ एक थर्मल cycler में एडेप्टर पानी रखनाकार्यक्रम: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड के 95 डिग्री सेल्सियस पर शुरू करने और 0.5 डिग्री सेल्सियस हर चक्र से कम करने के लिए 140 चक्र; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
      4. अशेष एडेप्टर और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. 3.4.1.4 और 2.5 μl टी -4 डीएनए ligase से (बर्फ पर thawed) 3.3.3 से eluate के साथ बर्फ पर एक प्रतिक्रिया, 25 μl 2x बंधाव बफर, अनुक्रमण एडेप्टर annealed 1.5 μl 50 माइक्रोन की स्थापना की। विंदुक के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। फोम और बुलबुले से बचें। मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण वांछित है, प्रत्येक नमूना के लिए एक अलग सूचीबद्ध अनुकूलक का उपयोग करें।
    3. 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
    4. पीसीआर शुद्धि किट या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार SPRI मोतियों के साथ डीएनए शुद्ध। 24 μl बफर ईबी में डीएनए Elute। अंतिम eluate ~ 23 μl है।
  5. डीएनए टुकड़ा 28 आकार का निर्धारण सही ढंग से सक्षम करने के लिए dsDNA के लिए वाई के आकार एडेप्टर कन्वर्ट
    1. 3.4.4 से eluate, 12.5 μl एच 2 ओ के साथ बर्फ पर एक प्रतिक्रिया सेट अप, 1 μl 25 माइक्रोन प्राइमर 1 28 1 μl 25 माइक्रोन प्राइमर 2 28, 1.5 μl 10mM dNTP, 10 μl 5x पीसीआर बफर और 1 μl डीएनए पोलीमरेज़ (1 यू / μl)।
    2. इस प्रकार के रूप पीसीआर चलाने: 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए; 15 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 63 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 5 चक्र; 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; ठंडे बस्ते में 4 डिग्री सेल्सियस।
    3. पीसीआर शुद्धि किट या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार SPRI मोतियों के साथ डीएनए शुद्ध। 11 μl बफर ईबी में डीएनए Elute। अंतिम eluate ~ 10 μl है।
  6. आकार पुस्तकालय का चयन
    1. 1x TAE बफर के साथ एक 2% agarose जेल तैयार करें। Ethidium ब्रोमाइड (चेतावनी!) जोड़ें 500 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पिघल ताए-agarose समाधान ethidium ब्रोमाइड की साँस लेना से बचने के लिए ठंडा हो गया है। सभी के नमूने, डीएनए सीढ़ी और खाली गलियों के लिए पर्याप्त लेन करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. 3.5.3 से eluate करने के लिए 8 μl 6x लोडिंग डाई जोड़ें।
      3. <ली> 1 केबी प्लस 1 के अनुपात में डीएनए सीढ़ी (1.0 माइक्रोग्राम / μl), 6X लोडिंग डाई और एच 2 ओ के मिश्रण से डीएनए सीढ़ी तैयार: 1: 4।
    3. डीएनए सीढ़ी μl लोड 6, एक अलग लेन में और आसन्न नमूने / सीढ़ी से कम से कम एक खाली लेन के साथ 3.6.2 से नमूने और एक अन्य 6 μl डीएनए सीढ़ी, प्रत्येक।
    4. 60 मिनट के लिए 120 वी पर जेल चला।
    5. एक यूवी transilluminator पर जेल देखें (यूवी के लिए जोखिम के समय को कम)। सुरक्षा चश्मा और एक चेहरा ढाल पहनें। सुनिश्चित करें कि डीएनए सीढ़ी के कम से कम एक 300 बीपी और 400 बीपी बैंड के बीच (3 जेल स्लाइस excising के लिए पर्याप्त) उपयुक्त अंतराल के साथ अच्छी तरह से रन बनाते हैं। व्यापक अंतर excised जेल स्लाइस की मात्रा बढ़ जाती है, जबकि संकीर्ण रिक्ति, कई जेल स्लाइस excising में कठिनाइयों बढ़ जाती है।
    6. एक नए छुरी या प्रत्येक लेन के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें। आबकारी 300 और प्रत्येक गली से 400 बीपी के बीच तीन पतली जेल स्लाइस (चित्रा 4) और एक microcentrifuge ट्यूब में उन्हें हर जगह है। प्रत्येक जेल रों की मात्रा रखेंसंभव (<100 μl) के रूप में के रूप में कम जूँ।
    7. प्रत्येक जेल टुकड़ा (1 μl जेल लगभग 1 मिलीग्राम वजन का होता है) की मात्रा को मापने QG बफर के 6x मात्रा में जोड़ने के लिए और 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. जेल टुकड़ा पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक QG-जेल मिश्रण हर 2-3 मिनट भंवर। Isopropanol के 2x जेल की मात्रा और मिश्रण जोड़ें।
    9. इस कदम से, जेल निकालना किट से प्रोटोकॉल का पालन करें। 51 μl बफर ईबी में डीएनए Elute। अंतिम eluate ~ 50 μl है।
  7. अनुक्रमण एडाप्टर संशोधित डीएनए टुकड़े को समृद्ध
    1. पीसीआर चक्र 29 की संख्या का अनुकूलन।
      1. 3.6.10 से 1 μl eluate, 1 μl 25 माइक्रोन प्राइमर 1 28 1 μl 25 माइक्रोन प्राइमर 2 28, 7 μl एच 2 हे और 10 μl SYBR ग्रीन Supermix के साथ बर्फ पर एक प्रतिक्रिया को निर्धारित करें। कुल मात्रा 20 μl है।
      2. इस प्रकार के रूप qPCR चलाएँ: 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 20 चक्र, 30 सेकंड के लिए 63 डिग्री सेल्सियस, 730 सेकंड के लिए 2 डिग्री सेल्सियस, प्लेट पढ़ा।
      3. एक qPCR विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण और निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए मात्रा चक्र (Cq) या दहलीज चक्र (सीटी) निर्धारित करते हैं। अंतिम पीसीआर चक्र संख्या (एन पीसीआर) के रूप में (अगले उच्च पूर्णांक तक पूर्णांक) Cq / सीटी ≤ 14. उपयोग किया है कि अधिक से अधिक नमूने Cq (सीक्यू 0) शून्य से 1 के साथ आगे बढ़ें।
      4. विभिन्न नमूनों पीसीआर चक्र का एक ही नंबर चलाने के बाद लगभग बराबर मात्रा को परिलक्षित किया जाएगा ताकि डीएनए टेम्पलेट्स की मात्रा समायोजित करें। उच्चतम Cq (सीक्यू 0) के साथ नमूना के लिए 8 μl टेम्पलेट का उपयोग करें, और निम्न सूत्र के साथ अन्य नमूनों की टेम्पलेट मात्रा की गणना:
        खंड = 8 एक्स 1.8 Cq मैं 0 -Cq
    2. 1 μl 25 माइक्रोन प्राइमर 1 28 1 μl 25 माइक्रोन प्राइमर 2 28, 1.5: 3.7.1.4 से गणना टेम्पलेट संस्करणों के साथ बर्फ पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेटμl 10 मिमी dNTP, 10 μl 5x बफर, 1 μl डीएनए पोलीमरेज़ (1 यू / μl) और 50 μl की कुल मात्रा के लिए एच 2 ओ के साथ भरें।
    3. इस प्रकार के रूप पीसीआर चलाने: 95 डिग्री सेल्सियस 45 सेकंड के लिए; एन पीसीआर चक्र 15 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 63 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के (3.7.1.3 में निर्धारित); 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; ठंडे बस्ते में 4 डिग्री सेल्सियस।
    4. एक 2% agarose जेल (चित्रा 5 ए) में 5 μl पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें। एक स्पष्ट "एकल" बैंड प्रवर्धित डीएनए टुकड़े एक संकीर्ण लंबाई सीमा के भीतर और डीएनए पुस्तकालय आगे के विश्लेषण के लिए विषय हो सकता है कि कर रहे हैं कि इंगित करता है।
    5. चयनित नमूने के लिए एक प्रतिक्रिया दोहराएँ और एक ही नमूना से परिलक्षित डीएनए पुस्तकालयों पूल।
    6. अनुक्रमण के लिए चयनित डीएनए पुस्तकालयों शुद्ध।
      1. प्राइमर / एडाप्टर dimers 3.7.4 में दिखाई नहीं कर रहे हैं, तो पीसीआर शुद्धि किट या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार SPRI मोतियों के साथ डीएनए पुस्तकालयों शुद्ध। 21 μl बफर ईबी में डीएनए Elute।अंतिम eluate ~ 20 μl है। उपयोगकर्ता की अनुक्रमण सुविधा क्षालन बफर, अंतिम मात्रा, आदि पर विशेष निर्देश दिया है, उसके अनुसार नमूने तैयार करते हैं।
      2. प्राइमर / एडाप्टर dimers 3.7.4 में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, तो आप निम्नानुसार पुस्तकालयों शुद्ध।
        1. एक 2% मिल में बना हुआ agarose जेल में 3.7.5 से लोड डीएनए और डीएनए सीढ़ी। मात्रा को कम करने के लिए 3.7.6.1 में वर्णित या कई कुओं में लोड किया जा सकता नमूने के रूप में शुद्ध किया जा सकता है। एक उचित बिजली व्यवस्था में agarose जेल रखें। जेल में 15 मिनट के लिए चलाने की अनुमति दें।
        2. एक उचित transilluminator का उपयोग करना, प्रत्येक नमूना के लिए एक साफ छुरी / रेजर के साथ वांछित बैंड बाहर में कटौती और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जेल टुकड़ा जगह है।
        3. दो संशोधनों के साथ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार जेल निकालना किट का उपयोग डीएनए अलग: 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मामीटरों मिक्सर में बफर QG-जेल मिश्रण सेते हैं और 30 मिनट के लिए 1000 rpm, और isopropanol की 2x जेल खंडों को जोड़ने।
  8. । एक अनुक्रमण की सुविधा के लिए शुद्ध डीएनए पुस्तकालयों प्रस्तुत सभी सुविधा के दिशा-निर्देशों का पालन करें।
    नोट: एक Bioanalyzer (चित्रा 5 ब) द्वारा एक गुणवत्ता विश्लेषण सटीक आकार रेंज और एक डीएनए पुस्तकालय की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए आदेश में पूर्व अनुक्रमण करने के लिए किया जाना चाहिए।

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Representative Results

बांध-वी 5-LmnB1 संलयन प्रोटीन immunofluorescence धुंधला द्वारा अंतर्जात Lamin बी प्रोटीन (चित्रा 1) के साथ सह-अनुवादित किया जा करने के लिए सत्यापित किया गया था।

एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े के सफल पीसीआर प्रवर्धन DamID-सेक के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। कोई-या स्पष्ट रूप से कम प्रवर्धन (चित्रा 2) में परिणाम चाहिए (ligase के बिना या पीसीआर टेम्पलेट के बिना, DpnI के बिना) नकारात्मक नियंत्रण है, जबकि 2 केबी - प्रयोगात्मक नमूने 0.2 की एक धब्बा बढ़ाना चाहिए।

एक NGS पुस्तकालय के लिए वांछित डालने आकार 200 से 300 बीपी के लिए है, जबकि डीएनए methylated टुकड़े, 0.2 से 2 केबी से रेंज में हैं। इसलिए, यह उपयुक्त आकार सीमा में मिथाइल पीसीआर उत्पादों टुकड़ा करने के लिए आवश्यक है। बहरहाल, इसके साथ ही उपयुक्त आकार के नीचे बड़ा डीएनए टुकड़े को तोड़ने के लिए अव्यावहारिक हो पाया थाs और एक भी विखंडन अवधि में बरकरार छोटे डीएनए टुकड़े के बहुमत रहते हैं। इसलिए, समय बेशक प्रयोगों 200 बीपी (चित्रा 3) पर केन्द्रित एक धब्बा करने के लिए टुकड़ा 1 ग्राम डीएनए करने की जरूरत कम से कम समय (टी 0.2kb) निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया। फिर बराबर वेतन वृद्धि में 6 समय अवधियों वास्तविक विखंडन के लिए 5 मिनट और टी 0.2kb के बीच चयन किया गया था। डबल कतरा डीएनए Fragmentase के enzymatic गतिविधि बैच बैच से भिन्न हो सकते हैं और समय के साथ कम हो सकती है, तो यह Fragmentase के एक नए बैच के लिए या समय की अवधि के लिए भंडारण के बाद इस कदम को दोहराने के लिए सिफारिश की है।

वांछित डालने आकार agarose जेल पर 300 और (121 बीपी अनुक्रमण एडेप्टर सहित) 400 बीपी के बीच डीएनए टुकड़े करने के लिए इसी बीच 200 और 300 बी पी है। इस सीमा के भीतर तीन पतले स्लाइस में एक पुस्तकालय के आकार सीमा संकीर्ण और संभावना बढ़ाने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना से excised थेकम से कम एक योग्य अनुक्रमण पुस्तकालय (चित्रा 4) प्राप्त करने का।

प्रत्येक प्रवर्धित डीएनए पुस्तकालय के 5 μl के एक विभाज्य अनुक्रमण के लिए अर्हता प्राप्त कर सकता है जो पुस्तकालय निर्धारित करने के लिए agarose जेल पर विश्लेषण किया गया था। चित्रा 5 ए में दिखाया गया है, excised जेल टुकड़ा के रूप में एक ही आकार का एक स्पष्ट एकल बैंड agarose जेल (कदम 3.7.4) पर दिखाई जानी चाहिए। इसके बाद, चयनित पुस्तकालयों अनुक्रमण करने से पहले सटीक आकार रेंज और सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक Bioanalyzer (चित्रा 5 ब) द्वारा जांच की गई। अगर वांछित, प्रवर्धित डीएनए पुस्तकालयों सीधे जेल विश्लेषण के बिना एक Bioanalyzer द्वारा जांच की जा सकती। कई पुस्तकालयों अच्छी गुणवत्ता के हैं, जब वह इसी तरह के आकार के पुस्तकालयों के नमूने (वी 5-बांध व्यक्त कोशिकाओं) प्रयोगात्मक (बांध-वी 5-POI व्यक्त कोशिकाओं) और नियंत्रण की एक जोड़ी के लिए पर्वतमाला अनुक्रम करने के लिए सिफारिश की है।

कम से उत्पन्न पढ़ताअनुक्रमण सिस्टम को सबसे पहले इसी जीनोम के लिए मैप किया गया। विशिष्ट तो बाद के विश्लेषण के लिए पारित किए गए पढ़ता गठबंधन। लघु प्रक्रिया के लिए एक पाइप लाइन के एक जीनोम नाथन बातचीत नक्शे का निर्माण और जीन-नाथन संघों हमारे पिछले काम 10 में विस्तार से वर्णित किया गया विश्लेषण, पढ़ता है। प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 6 में दिखाया जाता है।

आकृति 1
Immunofluorescence धुंधला द्वारा संलयन प्रोटीन की subnuclear स्थानीयकरण मान्य चित्रा 1.। IMR90 मानव फेफड़े fibroblast कोशिकाओं, क्षणिक बांध-वी 5-LmnB1 व्यक्त एक प्लाज्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे और विरोधी Lamin बी (ए, लाल) और एंटी-वी 5 (बी द्वारा दाग थे हरा)। (सी) ए और बी में छवियों के मर्ज टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा।

चित्र 2
एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े amplifying चित्रा 2 पीसीआर। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया से 5 μl का एक विभाज्य एक 1% agarose जेल पर विश्लेषण किया गया था। 0.2 से 2 केबी को लेकर एक धब्बा प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना से परिलक्षित किया गया था, लेकिन कोई प्रवर्धन नकारात्मक नियंत्रण में मनाया गया (2.1 कदम में कोई DpnI, 2.2 कदम, या कोई पीसीआर टेम्पलेट में कोई Ligase)। कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यह आंकड़ा की।

चित्र तीन
चित्रा 3. इष्टतम विखंडन अवधियों का निर्धारण। शुद्ध मिथाइल पीसीआर उत्पादों 10 मिनट की एक वेतन वृद्धि पर 5 से 55 मिनट के लिए समय अवधि के लिए विखंडन के अधीन थे (पचाया डीएनए "0 मिनट") के रूप में चिह्नित किया। 1 डीएनए सीढ़ी के माइक्रोग्राम और प्रत्येक खंडित डीएनए नमूने के 0.5 माइक्रोग्राम एक agarose जेल पर विश्लेषण किया गया। लगभग 200 बीपी के लिए डीएनए स्मियर के बहुमत को पचाने के लिए कम से कम समय में 5 और 35 मिनट (5 और 35 मिनट शामिल है) के बीच छह समान रूप से स्थान समय अवधियों वास्तविक विखंडन प्रदर्शन करने के लिए चयन किया गया था इसलिए करीब 35 मिनट, होने के लिए निर्धारित किया गया था। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. आकार 3.6 कदम एक 2% agarose जेल पर चलाए जा रहे थे से। बांध-वी 5-LmnB1 और वी 5-बांध के डीएनए के नमूने डीएनए पुस्तकालयों का चयन, और तीन समान रूप से आकार जेल स्लाइस (एल, एम और एच कम करने के लिए इसी मध्यम पीले रंग की लाइनों के रूप में दिखाया और) आकार में उच्च 300 और 400 बीपी के बीच excised थे। ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,620 / 53620fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एक agarose जेल पर विश्लेषण चित्रा उच्च throughput अनुक्रमण के लिए 5. प्रवर्धित डीएनए पुस्तकालयों। (ए) प्रवर्धित डीएनए पुस्तकालयों। पीसीआर टेम्पलेट्स चित्रा 4 पर दिखाया जेल स्लाइस से शुद्ध किया गया। (बी) वी 5-बांध (एल) नमूना और (ए) में रेखांकित किया गया है कि बांध-वी 5-LmnB1 (एल) नमूने के Bioanalyzer का परिणाम है। इन दो पुस्तकालयों समान संकीर्ण आकार पर्वतमाला था और उच्च throughput अनुक्रमण के लिए इस प्रकार योग्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

JPG "/>
UCSC जीनोम ब्राउज़र। माउस गुणसूत्र 1 में दिखाया चित्रा 6 NGS डेटा एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। अनुक्रम डेटा माउस C2C12 myoblasts 10 से तैयार किए गए। क्रमशः बांध-वी 5-LmnB1 और वी 5-बांध व्यक्त कोशिकाओं से डेटा के लिए इसी पटरियों "MB.LmnB1.w2k" और "MB.Dam.w2k", साजिश सामान्यीकृत पढ़ें घनत्व (मिलियन विशिष्ट पढ़ता है, या RPKM मैप किए प्रति kilobase प्रति पढ़ता ) गुणसूत्र के साथ गैर अतिव्यापी लगातार 2 केबी खिड़कियों में। ट्रैक "MB.log2FC.w2k" भूखंडों जीनोम नाथन संघों, यानी log2 2 केबी संकल्प पर बांध पर LmnB1 की RPKM अनुपात,। अनुक्रमण आधारित पत्ता एसोसिएटेड डोमेन (sLADs, सांख्यिकीय महत्व के साथ बांध पर LmnB1 के उच्च पढ़ें घनत्व है यानी कि जीनोमिक क्षेत्रों) सफेद में ग्रे और अनिर्धारित क्षेत्रों में काला, गैर sLADs में पेंट "MB.sLADs" ट्रैक। के लिए यहां क्लिक करें downloaइस फ़ाइल घ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems Life Technologies K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) QIAGEN 69506 or 69504  
Gateway pDONR 201 Life Technologies 11798-014
293T cells American Type Culture Collection CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies 25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-065
Fetal Bovine Serum Sigma F4135
Tris brand not critical
EDTA brand not critical
200 Proof EtOH brand not critical
Isopropanol brand not critical
Sodium Acetate brand not critical
DpnI New England Biolabs R0176 supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase Roche Life Science 10481220001 supplied with buffer
DpnII New England Biolabs R0543 supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England Biolabs N0446 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix Clontech 639201 supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787018 1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit QIAGEN 28004 or 28006 for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880 apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB QIAGEN 19086
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348 supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210
T4 Polynuleotide Kinase New England Biolabs M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) New England Biolabs M0212 supplied with buffer
sequencing adaptors Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200 used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2 Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit Kapa Biosystems KK2101 or KK2102 supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose Sigma Aldrich A4679
ethidium bromide Sigma Aldrich E1510-10ML 10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725121 or 1725122
Spectrophotometer brand not critical
0.45 μm PVDF Filter brand not critical
25 ml Seringe brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates brand not critical
6-well Tissue Culture Plates brand not critical
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories for qPCR
Vortex Mixer brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer brand not critical
Microcentrifuge brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply brand not critical
Magnet stand for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator brand not critical
E-gel electrophoresis system Life Technologies G6400, G6500, G6512ST

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References

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

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DamID-सेक: Adenine-methylated डीएनए टुकड़े के उच्च throughput अनुक्रमण द्वारा प्रोटीन डीएनए सहभागिता के जीनोम चौड़ा मानचित्रण
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Wu, F., Olson, B. G., Yao, J. DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments. J. Vis. Exp. (107), e53620, doi:10.3791/53620 (2016).

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