Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

DamID-seq: Genome-wide Kartlegging av Protein-DNA Interaksjoner med høy gjennomstrømning Sekvensering av adenin-metylert DNA-fragmenter

Published: January 27, 2016 doi: 10.3791/53620
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

Vi beskriver her en analyse ved kobling DNA adenin metyltransferase identifikasjon (DamID) til høy throughput sekvensering (DamID-seq). Denne fremgangsmåte gir en høyere oppløsning og et større dynamisk område, og gjør det mulig å analysere DamID-seq data i forbindelse med andre høy gjennomstrømning sekvenseringsdata, for eksempel chip-seq, RNA-seq, etc.

Introduction

DNA adenin metyltransferase identifikasjon (DamID) 1,2 er en metode for å påvise protein-DNA interaksjoner in vivo og er en alternativ tilnærming til kromatin immunoutfelling (chip) 3. Den bruker en forholdsvis lav mengde av celler og krever ikke kjemisk kryssbinding av proteiner med DNA eller et høyt spesifikt antistoff. Sistnevnte er spesielt nyttig når målproteinet er løst eller indirekte er assosiert med DNA. DamID har blitt brukt for å kartlegge bindingssteder for en rekke proteiner inkludert atom envelopeproteiner 4-10, kromatin forbundet proteiner 11-13, kromatin modifisering enzymer 14, transkripsjonsfaktorer og co-faktorer 15-18 og RNAi machineries 19. Metoden er anvendelig i flere organismer inkludert S. cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 samt mus og menneskelig cellelinjer 6,8,10,23,24.

Utviklingen av DamID analysen var basert på spesifikk påvisning av adenin-metylerte DNA-fragmenter i eukaryote celler som mangler endogen adenin metylering 2. Et uttrykt fusjonsprotein som består av den DNA-bindende protein av interesse og E. coli DNA adenin metyltransferase (Dam), kan metylat den adenin base i GATC-sekvenser som er i romlig nærhet (mest signifikant i løpet av 1 kb og opp til omtrent 5 kb) til bindingssetene av proteinet i genomet 2. De modifiserte DNA-fragmenter kan være spesielt forsterkes og hybridisert til microarray for å detektere de genomiske bindingsseter av proteinet av interesse 1,25,26. Denne originale DamID metoden er begrenset av tilgjengeligheten av mikromatriser og tettheten av forutbestemte prober. Vi har derfor integrert høy gjennomstrømming sekvensering itil DamID 10 og betegnet den fremgangsmåte som er DamID-seq. Det store antallet kort leser generert fra DamID-seq muliggjør presis lokalisering av protein-DNA interaksjoner genom-wide. Vi fant ut at DamID-seq gitt en høyere oppløsning og større dynamisk omfang enn DamID av microarray for å studere genom-atom plate (NL) assosiasjoner 10. Denne forbedrede metoden gjør sondering NL foreninger innenfor genet strukturer 10 og muliggjør sammenligninger med andre high throughput sekvense data, for eksempel ChIP-seq og RNA-seq.

Den DamID-seq protokollen beskrevet her ble opprinnelig utviklet for kartlegging av genom-NL foreninger 10. Vi ga en fusjonsprotein med tethering musen eller menneskelig Lamin B1 til E. coli DNA adenin metyltransferase og testet protokollen i 3T3 mus embryonale fibroblaster, C2C12 mus myoblaster 10 og IMR90 humane foster lungefibroblaster (data ikke publisert). I denne protokollen, starter vi med constructing vektorer og uttrykker Dam-tethered fusjonsproteiner etter lentiviral infeksjon i pattedyrceller 24. Deretter beskriver vi de detaljerte protokoller forsterke adenin-metylert DNA-fragmenter og forbereder sekvense bibliotekene som bør være aktuelt i andre organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generasjon og Expression of Fusion Proteiner og Free Dam Proteiner

  1. Clone protein av interesse inn i DamID vektor.
    1. Amplifisere cDNA for proteinet av interesse (POI) ved hjelp av den ønskede høye nøyaktighet DNA-polymerase og passende primere i henhold til produsentens protokoll. Eksperimentelt bestemme optimale amplifikasjonsbetingelser å sikre riktig forsterkning av innsatser.
    2. Kjør en agarosegel og rense forsterket cDNA av POI av gelen utvinning kit i henhold til produsentens protokoll.
    3. Clone cDNA av POI inn i pDONR201 vektor bruker BP Clonase II i henhold til produsentens protokoll.
    4. Klone cDNA av POI fra donor vektoren inn i pLGW-RFC1-V5-EcoDam destinasjon vektor eller pLGW-EcoDam-V5-RFC1 reisemålet vektor 27 bruker LR Clonase II i henhold til produsentens protokoll, avhengig av ønsket retning av fusing POI til N-terminalen eller the C-enden av E. coli DNA adenin metyltransferase (EcoDam) 27.
    5. Kontroller ved sekvense at klonet cDNA har en riktig rekkefølge og skjemaer i-frame fusjon til EcoDam.
  2. Generere lentiviral aksjer.
    1. Generere lentiviral aksjer uttrykker Dam-V5-POI og V5-Dam (fra pLGW-V5-EcoDam vektor 27) bruker lentivirale ekspresjonssystemer. Bruk fremover transfeksjon måten i henhold til produsentens protokoll.
      1. Bruk 293T celler og lipofeksjon å generere lentivirale aksjer i henhold til produsentens protokoll for transfeksjon.
      2. Inkluder 0,45 PVDF filter trinn.
  3. Infisere celler med lentivirus.
    1. Dagen før infeksjon (dag 0), passerer adherente celler dyrket i passende vekstmedium for denne celletype til en 6-brønns vevskulturplate ved hjelp av den samme vekstmediet uten antibiotika tiloppnå 50% konfluens på infeksjonsdagen. Plasser cellene i et 37 ° C inkubator.
    2. På dagen for infeksjon (dag 1), fjerne 2 cryovials av både Dam-V5-POI og V5-Dam lentivirale supernatanter fra en -80 ° C fryser og plass i en 37 ° C vannbad for å tine.
      1. Fjern vekstmedier fra cellene og erstatte med 0,5 ml friskt vekstmedium uten antibiotika.
      2. Tilsett 1 ml av tint lentivirus til hver brønn (2 brønner med V5-Dam og 2 brønner med Dam-V5-POI). Tilsett 1 ml vekstmedium uten antibiotika til de gjenværende brønnene 2-dette vil tjene som en negativ kontroll. Rist 6-brønns plate for å blande og plassere tilbake i en 37 ° C inkubator O / N.
    3. Dagen etter infeksjon (Dag 2), fjerne virus suspensjoner fra celler og erstatte med 2 ml vekstmedier uten antibiotika. Plasser cellene tilbake i en 37 ° C inkubator i 48 timer.
  4. Isoler gDNA.
    1. Sug media fra hver brønn og deTach celler ved hjelp av 250 mL 0,05% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 2 min.
    2. Vask celler av platen med 1 ml vekstmedier og pipette celler fra hver brønn inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Pellet celler ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Vask pelleterte cellene med 500 ul PBS og sentrifuger ved 200 xg i 2 min ved RT.
    4. Suspender pelleterte cellene i 200 mL PBS.
    5. Isolere gDNA av blod og vev kit ifølge produsentens protokoll. Elute gDNA i 200 mL buffer AE og bestemme konsentrasjonen ved å måle OD 260 ved hjelp av et spektrofotometer.
      Merk: gDNA fra infiserte eller mock-infiserte celler kan bli isolert som negative kontroller. Fremskynde gDNA til høyere konsentrasjoner for langtidslagring.
      1. Tilsett 3 volumer av 100% etanol og 0,1 volum 3 M natriumacetat (pH 5,5), og bland ved å snu rørene 4-6 ganger.
      2. Oppbevares ved -20 ° CO / N.
      3. Sentrifuger ved 16.000 xg i 15 min ved 4 ° C.
      4. Fjern forsiktig supernatanten. Vask pellets med 70% (volum / volum) etanol og sentrifuger ved 16 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
      5. Fjern forsiktig ethanol og la pellets lufttørke i 3 minutter ved RT.
      6. Oppløs gDNA i T 10 E 0,1 (pH 7,5) til omtrent 1 pg / pl. Pool gDNA fra hver forsøksprøve eller den negative kontroll, og måle konsentrasjonen. Oppbevar ved -20 ° C.

2. Forsterke adenin-metylert DNA-fragmenter

  1. Digest gDNA med DpnI som bare kutter adenin-metylert GATCs.
    1. Sett opp en reaksjon på is med 2,5 ug gDNA, 1 pl 10 x buffer, 0,5 ul DpnI (20 U / pl) og fyll med H2O til et totalt volum på 10 pl. For hver gDNA prøve, forberede tre reaksjoner - en uten DpnI ("no DpnI", erstatte DpnI med 0,5 mL H 2 O) og to with DpnI ("med DpnI").
    2. Digest O / N ved 37 ° C og inaktiverer DpnI ved 80 ° C i 20 min.
  2. Ligere DamID adaptere.
    1. Forbered DamID adaptere.
      1. Resuspender hver av de to adapter DamID oligoene 24 i H2O til en endelig konsentrasjon på 100 uM.
      2. Kombiner like volumer av de to DamID adapter oligos, bland og legg i en tett lukket rør. Forsegle røret med Parafilm, sitte i et rack og sted i et beger fylt med vann ved 90 ° C. Holde vannivået under lokket av røret (for å unngå at vann trenger inn i røret), men over overflaten av oligo blandingen.
      3. La vannet kult å RT slik at adaptere gløding sakte.
      4. Delmengde de glødet adaptere (50 mm) og oppbevares ved -20 ° C.
    2. Sett opp en reaksjon på is. I hvert rør fra 2.1.2, tilsett 6,2 mL H 2 O, 2 ul 10x ligation buffer, 0,8 ul 50 mikrometer DamID annonseaptors (tint på is) og 1 pl T4 DNA-ligase (5 U / ul). Det totale volum er 20 pl. I en av de to "med DpnI" rør, erstatte ligase med en ul H 2 O ("no ligase") Merk at hver gDNA prøven har to negative kontroller -. "Nei DpnI" og "nei ligase".
    3. Ligere O / N ved 16 ° C og inaktiverer ligase ved 65 ° C i 10 min.
  3. Digest DNA med DpnII å ødelegge fragmenter som inneholder unmethylated GATCs.
    1. Sett opp en reaksjon på is. I hvert rør fra 2.2.3, legger 24 mL H 2 O, 5 pl 10x DpnII buffer og en ul DpnII (10 U / mL). Det totale volum er 50 pl.
    2. Digest ved 37 ° C i 2-3 timer og inaktiverer DpnII ved 65 ° C i 20 min.
  4. Forsterke adenin-metylert DNA-fragmenter.
    1. Sett opp en reaksjon på isen med 5 pl DpnII fordøye fra 2.3.2, 5 μl 10x PCR-buffer, 12,5 mL 5 mikrometer DamID PCR primer 24, 4 pl 10 mM dNTP mix, 1 ul 50x polymerase mix og 22,5 mL H 2 O. Det totale volum er 50 pl.
    2. Kjør PCR som følger: 68 ° C i 10 min; 94 ° C i 1 minutt, 65 ° C i 5 min, 68 ° C i 15 min; 4 sykluser ved 94 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 minutt, 68 ° C i 10 min; 17 sykluser ved 94 ° C i 1 min, 65 ° C i 1 minutt, 68 ° C i 2 min.
    3. Analyser 5 ul av PCR-produkter fra hver reaksjon på en 1% agarose gel. PCR-produktene skal vises som en smøre som strekker seg fra 0,2 til 2 kb (figur 2). De "no DpnI" og "nei ligase" kontroller bør ha noe eller klart mindre forsterkning.
    4. Hvis resultatet fra trinn 2.4.3 er tilfredsstillende, gjenta trinn 2.4.1-2.4.3 med to eller tre reaksjoner for den eksperimentelle prøven og en reaksjon for hver av de to negative kontroller.
    5. Pool og rense PCR-produkter fra sammeeksperimentell prøve å bruke PCR rensing kits eller Solid Phase Reversibel Immobilization (SPRI) perler i henhold til produsentens protokoll. Ikke rense "nei DpnI" eller "nei ligase" kontroller. Eluere DNA med buffer EB.
    6. Måle konsentrasjonen av det rensede DNA ved å måle OD 260 ved hjelp av et spektrofotometer, som bør være rundt 0,1 ug / mL eller høyere. Samle minst 10 ug DNA for hver prøve. Hvis du bruker PCR rensing kits, rense hver 50 mL PCR-produkter med én kolonne, elueres i 30 mL buffer EB og basseng eluatene.
  5. Digest DNA med DpnII å hindre DamID PCR primere blir sekvensert.
    1. Sett opp en reaksjon på isen med 5 mikrogram renset DNA fra 2.4.6, 5 pl 10x DpnII buffer, en ul DpnII (10 U / mL) og fyll med H 2 O til et totalt volum på 50 ul. Forbered to eller tre reaksjoner for hver prøve.
    2. Fordøye ved 37 ° C i 2-3 timerog inaktivere DpnII ved 65 ° C i 20 min.
    3. Pool og rense de fordøyer fra samme prøven med PCR rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA med buffer EB.
    4. Måle konsentrasjonen av det rensede DNA som bør være rundt 0,06 ug / mL eller høyere. Samle minst 6 mikrogram DNA for hver prøve. Hvis du bruker PCR rensing kits, rense hver 50 ul fordøye med én kolonne, elueres i 30 mL buffer EB og basseng eluatene.

3. Bibliotek Forberedelse for High-throughput sekvensering

  1. Fragment DNA
    1. Eksperimentelt finne riktig fordøyelsen tid for hver ny gruppe med dsDNA Fragmentase. Som enzymaktiviteten kan reduseres over tid, gjenta testen før du utfører et nytt eksperiment. For å lagre DNA fra 2.5.4 for selve fragmentering, bruke rensede metyl PCR-produkter fra 2.4.6 eller ekstra DNA fra forrige experiments på dette trinnet.
      1. Sett opp en master mix med 6 mikrogram DNA, 12 mikroliter 10x Fragmentase buffer og fyll med H 2 O til et totalt volum på 114 mL.
      2. Vortex Fragmentase lager hetteglasset i 3 sekunder, tilsett 6 mL inn i master mix og virvle master mix for 3 sek. Det totale volum er 120 ul.
      3. Alikvoter 20 ul masterblanding til hver av 5 nye rør. Inkuber alle 6-rør ved 37 ° C i 5 til 55 min ved en økning på 10 min. Tilsett 5 ul 0,5 M EDTA for å stoppe reaksjonen.
      4. Analyser 12,5 ul fordøye (0,5 ug DNA) av hver reaksjon, så vel som 0,5 ug ufordøyd DNA på en agarosegel (figur 3). Bestem minimal tid (T 0.2kb) trengs for å fordøye det meste av smøre til rundt 0,2 kb. Velg 6 tidsvarigheter mellom 5 min og T 0.2kb (inkludert 5 min og T 0.2kb) med like store mengder for selve fragmentering.
    2. Sette opp selve fragmentering som beskrevet i 3.1.1.1-3.1.1.3. Inkuber reaksjoner ved 37 ° C for de tidsvarig fastsatt i 3.1.1.4.
    3. Pool 6 reaksjoner og rense de fordøyer med PCR rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA i 51 mL buffer EB. Den endelige eluatet er ~ 50 pl.
  2. Reparasjon ender av fragmentert DNA
    1. Sett opp en reaksjon på is med eluatet fra 3.1.3, 25 pl H2O, 10 pl 10 x T4 DNA-ligase-buffer med 10 mM ATP, 4 pl 10 mM dNTP blanding, 5 pl T4 DNA-polymerase (3 U / mL) , 1 pl Klenow DNA-polymerase (5 U / ul), og 5 pl T4 polynukleotidkinase. Det totale volum er 100 ul. Bland godt med pipette. Unngå skum og bobler.
    2. Inkuber ved 20 ° C i 30 min.
    3. Rense DNA med PCR rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA i 33 mL buffer EB. Den endelige eluatet er ~ 32 & #181; l.
  3. Legg "A" overheng
    1. Sett opp en reaksjon på isen med eluatet fra 3.2.3, 5 pl 10x Klenow buffer, 10 pl 1 mM dNTP, og 3 mL Klenow (3 '→ 5' ekso-) (5 U / mL). Det totale volum er 50 pl. Bland godt med pipette. Unngå skum og bobler.
    2. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.
    3. Rense DNA med PCR rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA i 22 mL buffer EB. Den endelige eluatet er ~ 21 mL.
  4. Ligere sekvense adaptere
    1. Forbered sekvense adaptere 28.
      1. Resuspender hver adapter oligonukleotidet til en konsentrasjon på 100 pM i 10 mM Tris-Cl (pH 7,8), 0,1 mM EDTA (pH 8,0) og 50 mM NaCl.
      2. Bland like mengder universaladapter 28 og en indeksert adapter 28.
      3. Anneale adapterne i en termosykler med følgendeprogram: 95 ° C i 2 minutter; 140 sykluser for 30 sekunder som starter ved 95 ° C og reduseres med 0,5 ° C for hver syklus; hold ved 4 ° C.
      4. Alikvote adaptere og butikken ved -20 ° C.
    2. Sett opp en reaksjon på is med eluatet fra 3.3.3, 25 ul 2 x ligeringsbuffer, 1,5 ul 50 uM glødet sekvense adaptere (tint på is) fra 3.4.1.4, og 2,5 pl T4 DNA-ligase. Bland godt med pipette. Unngå skum og bobler. Hvis multiplex sekvensering er ønskelig, bruke en annen indeksert adapter for hver prøve.
    3. Inkuber ved RT i 1 time.
    4. Rense DNA med PCR rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA i 24 mL buffer EB. Den endelige eluatet er ~ 23 mL.
  5. Konverter Y-formede adaptere til dsDNA å aktivere nøyaktig bestemme DNA fragment størrelser 28
    1. Sett opp en reaksjon på isen med eluatet fra 3.4.4, 12,5 mL H 2 O, 1 ul 25 uM primer 1 28, 1 ul 25 uM primer 2 28, 1,5 pl 10 mM dNTP, 10 ul 5 x PCR-buffer og 1 pl DNA-polymerase (1 U / pl).
    2. Kjør PCR som følger: 95 ° C i 3 minutter; 5 sykluser med 98 ° C i 15 sek, 63 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sekunder; 72 ° C i 1 min; 4 ° C på vent.
    3. Rense DNA med PCR rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA i 11 mL buffer EB. Den endelige eluatet er ~ 10 mL.
  6. Størrelse velger biblioteket
    1. Forberede en 2% agarosegel med 1x TAE buffer. Legg etidiumbromid (OBS!) Til en sluttkonsentrasjon på 500 ng / ml når den smeltede agarose-TAE-løsning er avkjølt for å unngå innånding av etidiumbromid. Sørg for å ha nok baner for alle prøvene, DNA stigen og tomme gater.
    2. Tilsett 8 mL 6x lasting fargestoff til eluatet fra 3.5.3.
      3. <li> Forbered DNA stige ved å blande 1 kb i tillegg til DNA-stige (1,0 ug / ul), 6x lasting fargestoff og H 2 O i et forhold på 1: 1: 4.
    3. Last 6 mL DNA ladder, prøvene fra 3.6.2 og en annen 6 mL DNA ladder, hver i et eget kjørefelt og med minst ett tomt kjørefelt fra tilstøtende samples / stiger.
    4. Kjør gelen ved 120 V i 60 min.
    5. Se gelen på en UV-transilluminator (minimalisere eksponeringstiden for UV). Bruk vernebriller og ansiktsskjerm. Sørg for at minst én av de DNA stiger kjøre godt med passende mellomrom (nok for excising 3 gel skiver) mellom 300 bp og 400 bp band. Smale mellomrom øker vanskelighetene med å excising flere gel skiver, mens brede mellomrom øker volumet av skåret gel skiver.
    6. Bruk en ny skalpell eller et barberblad for hvert kjørefelt. Vesenet tre tynne gel skiver mellom 300 og 400 bp fra hvert kjørefelt (figur 4) og plassere dem hver i en mikro tube. Holde volumet av hver gel slus så lavt som mulig (<100 ul).
    7. Måle volumet av hver gel skive (1 ul gel veier ca. 1 mg), tilsett 6x volumer av QG buffer og inkuber ved 50 ° C.
    8. Vortex QG-gel blandingen hver 2-3 min før gelstykket er helt oppløst. Legg 2x gel volumer av isopropanol og bland.
    9. Fra dette trinnet, følger protokollen fra gel utvinning kits. Eluere DNA i 51 mL buffer EB. Den endelige eluatet er ~ 50 pl.
  7. Berik sekvense adapter modifisert DNA-fragmenter
    1. Optimalisere antall PCR-sykluser 29.
      1. Sett opp en reaksjon på isen med en ul eluatet fra 3.6.10, en ul 25 mikrometer primer en 28, en ul 25 mikrometer primer 2 28, 7 mL H 2 O og 10 mL SYBR Grønn Supermix. Det totale volum er 20 pl.
      2. Kjør qPCR som følger: 95 ° C i 3 minutter; 20 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 63 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sek, lese plate.
      3. Analysere data ved hjelp av en qPCR analyse programvare og bestemme Kvantifisering Cycle (Cq) eller Threshold Cycle (Ct) for hver prøve å bruke produsentens protokoll. Fortsett med prøvene som har Cq / Ct ≤ 14. Bruk maksimal Cq (CQ 0) minus 1 (avrundet opp til neste høyere tall) som den endelige PCR syklus nummer (N PCR).
      4. Juster mengder av DNA-templater, slik at forskjellige prøver vil bli amplifisert i omtrent like mengder etter å ha kjørt samme antall PCR-sykluser. Bruk 8 ul templat for prøven med den høyeste Cq (Cq 0), og beregne volumet av andre prøver med følgende formel malen:
        Vol i = 8 x 1,8 Cq jeg -Cq 0
    2. Sett opp PCR reaksjoner på isen med malen volumer beregnet fra 3.7.1.4: 1 ul 25 mikrometer primer en 28, en ul 25 mikrometer primer 2 28 1.5pl 10 mM dNTP, 10 ul 5x buffer, 1 pl DNA-polymerase (1 U / pl) og fyll med H2O til et totalvolum på 50 ul.
    3. Kjør PCR som følger: 95 ° C i 45 sekunder; N PCR-sykluser (bestemt i 3.7.1.3) på 98 ° C i 15 sek, 63 ° C i 30 sek, 72 ° C i 30 sekunder; 72 ° C i 1 min; 4 ° C på vent.
    4. Analyser 5 pl PCR-produktene på en 2% agarosegel (figur 5A). En klar "single" band indikerer at de amplifiserte DNA-fragmenter er innenfor et smalt lengdeområde, og at DNA-bibliotek kan bli utsatt for videre analyse.
    5. Gjenta én reaksjon for utvalgte prøver og bassenget på amplifiserte DNA-bibliotekene fra samme prøve.
    6. Rense utvalgte DNA-biblioteker for sekvensering.
      1. Hvis primer / adapter dimerene er ikke synlig i 3.7.4, rense DNA biblioteker med PCR-rensing kits eller Spri perler i henhold til produsentens protokoll. Eluere DNA i 21 mL buffer EB. Deendelige eluatet er ~ 20 pl. Hvis brukerens sekvense anlegget har spesifikke instruksjoner om elueringsbufferen, siste bind, etc., forberede prøver deretter.
      2. Hvis primer / adapter dimerene er godt synlig i 3.7.4, rense bibliotekene som følger.
        1. Load DNA fra 3.7.5 og DNA Stige i en 2% agarosegel forhåndsstøpt. Prøver kan bli renset som beskrevet i 3.7.6.1 for å redusere volumet eller kan legges i flere brønner. Plasser agarosegel i en passende kraftsystem. La gelen løpe i 15 min.
        2. Ved hjelp av en passende transilluminator, kuttet ut den ønskede band med en ren skalpell / barberblad for hver prøve og plassere gelstykket i en 1,5 ml mikro tube.
        3. Isolere DNA ved gel ekstraksjon sett i henhold til produsentens protokoll med to modifikasjoner: inkuber buffer QG-gel-blandingen i en termo-blander ved 37 ° C og 1000 opm i 30 minutter, og tilsett 2 x gel volumdeler isopropanol.
  8. Send rensede DNA-bibliotekene til en sekvensestudio. Følg alle retningslinjene anlegget.
    Merk: En kvalitetsanalyse av en Bioanalyzer (figur 5B) bør utføres før sekvensering for å bestemme den nøyaktige størrelsesområdet, og konsentrasjonen av et DNA-bibliotek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

The Dam-V5-LmnB1 fusjonsprotein ble bekreftet å være samlokalisert med den endogene Lamin B protein ved immunfluorescens farging (figur 1).

Den vellykkede PCR-amplifisering av adenin-metylerte DNA-fragmenter er et viktig skritt for DamID-seq. De eksperimentelle prøvene skal forsterke en smøre på 0,2 - 2 kb mens negative kontroller (uten DpnI, uten ligase eller uten PCR mal) bør resultere i ingen eller klart mindre forsterkning (figur 2).

De metylerte DNA-fragmenter som er i området fra 0,2 til 2 kb, mens den ønskede innskuddsstørrelse for en NGS-bibliotek er 200 til 300 bp. Derfor er det viktig å fragmentere de methyl PCR produktene inn i det passende størrelsesområde. Ikke desto mindre ble det funnet å være upraktisk å samtidig bryte større DNA-fragmenter ned til passende størrelses og holde flertallet av små DNA-fragmenter intakte i en enkel fragmentering varighet. Derfor ble tidsforløpseksperimenter utføres for å bestemme den minimale tid (T 0.2kb) som er nødvendig for å fragment 1 ug DNA til en smøre sentrert på 200 bp (figur 3). Deretter ble valgt 6 tid varigheten i like store mengder mellom 5 min og T 0.2kb for selve fragmentering. Den enzymatiske aktivitet av dobbeltkjedet DNA Fragmentase kan variere fra parti til parti, og kan avta over tid, så er det anbefalt å gjenta dette trinnet for en ny gruppe med Fragmentase eller etter lagring i en periode.

Den ønskede innskuddsstørrelse er mellom 200 og 300 bp DNA-fragmenter svarende til mellom 300 og 400 bp (121 bp inkludert sekvense adaptere) på agarosegel. Tre tynne skiver innenfor dette området ble skåret ut fra hver eksperimentell prøve å begrense størrelsen rekkevidde av et bibliotek og øke mulighetenå oppnå i det minste en kvalifisert sekvense bibliotek (figur 4).

En porsjon av 5 ul av hver amplifiserte DNA-bibliotek ble analysert på en agarosegel for å bestemme hvilke bibliotek kan kvalifisere for sekvensering. Som vist i figur 5A, bør en klar enkelt bånd av samme størrelse som det utskårede gelstykket være synlig på agarose gel (trinn 3.7.4). Deretter ble valgt bibliotekene undersøkt av en Bioanalyzer (Figur 5B) for å fastslå den eksakte størrelsen rekkevidde og konsentrasjoner før sekvensering. Hvis ønskelig, kan amplifiserte DNA-biblioteker bli direkte undersøkt av en Bioanalyzer uten gelanalyse. Når flere biblioteker er av god kvalitet, er det anbefalt å sekvensere biblioteker av lignende størrelse varierer for et par eksperimentelle (celler som uttrykker Dam-V5-POI) og kontroll (celler uttrykker V5-Dam) prøver.

Den korte leser generert avsekvense systemer ble først kartlagt tilbake til den tilsvarende genomet. Unikt justert leser ble deretter overført til påfølgende analyser. En rørledning for å behandle kort leser, konstruere et genom-NL interaksjon kart og analysere gen-NL assosiasjoner ble beskrevet i detalj i vårt tidligere arbeid 10. Representative resultater er vist i figur 6.

Figur 1
Figur 1. Validering subnuclear lokaliseringer av fusjonsproteinene ved immunofluorescens farging. IMR90 humane lunge fibroblastceller ble transient transfektert med et plasmid som uttrykker Dam-V5-LmnB1 og ble farget med anti-Lamin B (A, rød) og anti-V5 (B, grønn). (C) Slå sammen bilder i A og B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av thans skikkelse.

Figur 2
Figur 2. PCR amplifisering av adenin-metylert DNA-fragmenter. En porsjon av 5 pl fra hver PCR-reaksjon ble analysert på en 1% agarose gel. En smøre spenner fra 0,2 til 2 kb ble forsterket fra hver eksperimentell prøve, men ingen forsterkning ble observert i negative kontroller (ingen DpnI i trinn 2.1, ingen Ligase i trinn 2.2, eller ingen PCR mal). Til Klikk her for større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Bestemme optimale fragmentering varigheter. Purified metyl PCR produktene ble utsatt for fragmentering for tidsvarig 5-55 min ved en tilvekst på 10 min (ufordøyd DNA , Merket som "0 min"). 1 ug av DNA-stige og 0,5 ug av hver fragmentert DNA-prøve ble analysert på en agarosegel. Minimal tid til å fordøye det meste av DNA smøre til rundt 200 bp var fast bestemt på å være rundt 35 min, derfor seks jevnt fordelt tidsvarigheter mellom 5 og 35 min (5 og 35 min inkludert) ble valgt til å utføre selve fragmentering. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Størrelse velge DNA-bibliotekene. DNA-prøver av Dam-V5-LmnB1 og V5-Dam fra trinn 3.6 ble kjørt på en 2% agarosegel, og tre like store gel skiver (L, M og H tilsvarende lav, medium og høy i størrelse) ble skåret ut mellom 300 og 400 bp, som vist med gule linjer. om / filer / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. amplifiserte DNA-biblioteker for high throughput-sekvensering. (A) amplifiserte DNA-biblioteker ble analysert på en agarosegel. PCR-templater ble renset fra gel skiver er vist på figur 4 (B). Bioanalyzer resultatene av V5-Dam (L) prøven og Dam-V5-LmnB1 (L) prøve som ble understreket i (A). Disse to bibliotekene hadde lignende smal størrelsesområder og dermed kvalifisert for høy gjennomstrømming sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

jpg "/>
Figur 6. NGS dataene som vises i UCSC genom nettleser. Mouse kromosom 1 er vist som et eksempel. Sekvensdata ble produsert fra mus C2C12 myoblaster 10. Tracks "MB.LmnB1.w2k" og "MB.Dam.w2k", tilsvarende data fra celler som uttrykker Dam-V5-LmnB1 og V5-Dam henholdsvis leser tomt normalisert lese tettheter (per kilobase per million entydig kartlagt leser, eller RPKM ) i ikke-overlappende sammenhengende 2 kb vinduer langs kromosomet. Track "MB.log2FC.w2k" tomter genom-NL foreninger, dvs. log2 RPKM prosenter av LmnB1 enn Dam, ved 2 kb oppløsning. Spor "MB.sLADs" maling sekvensebaserte Laminerte Associated Domains (slads, dvs. genomiske regioner som har høyere lese tettheter av LmnB1 løpet Dam med statistisk signifikans) i Svart, ikke-slads i grå og ubestemte regioner i hvitt. Vennligst klikk her for å Download denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViraPower Lentiviral Expression Systems Life Technologies K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Life Technologies 11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) QIAGEN 69506 or 69504  
Gateway pDONR 201 Life Technologies 11798-014
293T cells American Type Culture Collection CRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Life Technologies 25300-054
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-065
Fetal Bovine Serum Sigma F4135
Tris brand not critical
EDTA brand not critical
200 Proof EtOH brand not critical
Isopropanol brand not critical
Sodium Acetate brand not critical
DpnI New England Biolabs R0176 supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA Ligase Roche Life Science 10481220001 supplied with buffer
DpnII New England Biolabs R0543 supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR" Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set New England Biolabs N0446 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase Mix Clontech 639201 supplied with buffer
1Kb Plus DNA Ladder Life Technologies 10787018 1.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 or 28106
MinElute PCR Purification Kit QIAGEN 28004 or 28006 for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880 apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EB QIAGEN 19086
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348 supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210
T4 Polynuleotide Kinase New England Biolabs M0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) New England Biolabs M0212 supplied with buffer
sequencing adaptors Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
Quick Ligation Kit New England Biolabs M2200 used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2 Integrated DNA Technologies sequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR Kit Kapa Biosystems KK2101 or KK2102 supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agarose Sigma Aldrich A4679
ethidium bromide Sigma Aldrich E1510-10ML 10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad Laboratories 1725121 or 1725122
Spectrophotometer brand not critical
0.45 μm PVDF Filter brand not critical
25 ml Seringe brand not critical
10 cm Tissue Culture Plates brand not critical
6-well Tissue Culture Plates brand not critical
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories for qPCR
Vortex Mixer brand not critical
Dry Block Heater or Thermomixer brand not critical
Microcentrifuge brand not critical
Gel electrophoresis system with power supply brand not critical
Magnet stand for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminator brand not critical
E-gel electrophoresis system Life Technologies G6400, G6500, G6512ST

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. DamID mammalian vectors. , Available from: http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm (2015).
  28. Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015).
  29. Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015).
  30. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  31. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
  32. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  33. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  34. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
  35. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
  36. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  37. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  38. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  39. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Tags

Molecular Biology DNA adenin metyltransferase identifikasjon (DamID) DamID-seq neste generasjons sekvensering høy gjennomstrømming sekvensering protein-DNA interaksjoner kjernekraft lamina
DamID-seq: Genome-wide Kartlegging av Protein-DNA Interaksjoner med høy gjennomstrømning Sekvensering av adenin-metylert DNA-fragmenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, F., Olson, B. G., Yao, J.… More

Wu, F., Olson, B. G., Yao, J. DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments. J. Vis. Exp. (107), e53620, doi:10.3791/53620 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter