हम उच्च throughput अनुक्रमण (DamID-सेक) के लिए डीएनए एडिनाइन मिथाइल पहचान (DamID) युग्मन द्वारा इस के साथ साथ एक परख का वर्णन है। यह बेहतर तरीका एक उच्च संकल्प है और एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान करता है, और अनुमति देता है आदि चिप seq, आरएनए-सेक के रूप में अन्य उच्च throughput अनुक्रमण डेटा के साथ संयोजन के रूप में DamID-सेक डेटा का विश्लेषण
The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.
डीएनए एडिनाइन मिथाइल पहचान (DamID) 1,2 विवो में प्रोटीन, डीएनए बातचीत का पता लगाने के लिए एक विधि है और chromatin immunoprecipitation (चिप) 3 के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। यह कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत कम राशि का उपयोग करता है और डीएनए या एक अति विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन की रासायनिक पार से जोड़ने की आवश्यकता नहीं है। लक्ष्य प्रोटीन शिथिल या परोक्ष रूप से डीएनए के साथ जुड़ा हुआ है जब उत्तरार्द्ध विशेष रूप से उपयोगी है। DamID सफलतापूर्वक परमाणु लिफाफा प्रोटीन 4-10, क्रोमेटिन जुड़े प्रोटीन 11-13, क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों 14, प्रतिलेखन कारक है और 15-18 सह कारकों और आरएनएआई मशीनरी 19 सहित प्रोटीन की एक किस्म के बंधन साइटों नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विधि एस सहित कई जीवों में लागू है cerevisiae 13, एस pombe 7, सी एलिगेंस 9,17, डी मेलानोगास्टर 5,11,18,20, ए 21,22 और साथ ही माउस और मानव कोशिका लाइनों 6,8,10,23,24 thaliana।
DamID परख के विकास अंतर्जात एडिनाइन मिथाइलेशन 2 की कमी है कि कोशिकाओं में एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े की विशिष्ट पहचान के आधार पर किया गया था। ब्याज और ई के डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन से मिलकर एक व्यक्त संलयन प्रोटीन, कोलाई डीएनए एडिनाइन मिथाइल (बांध), स्थानिक निकटता में (सबसे महत्वपूर्ण 1 केबी के भीतर और ऊपर लगभग 5 केबी) कर रहे हैं जीनोम 2 में प्रोटीन की बाध्यकारी साइटों के लिए कि GATC दृश्यों में एडिनाइन आधार methylate सकते हैं। संशोधित डीएनए टुकड़े विशेष रुचि 1,25,26 के प्रोटीन के जीनोमिक बाध्यकारी साइटों का पता लगाने के प्रोटीन को परिलक्षित और संकरित जा सकता है। यह मूल DamID विधि प्रोटीन की उपलब्धता और पूर्व निर्धारित जांच के घनत्व द्वारा सीमित था। इसलिए हम में उच्च throughput अनुक्रमण एकीकृत हैDamID 10 और DamID-सेक के रूप में विधि नामित। कम से बड़ी संख्या में DamID-सेक से उत्पन्न पढ़ता जीनोम चौड़ा प्रोटीन डीएनए बातचीत की सटीक स्थानीयकरण सक्षम बनाता है। हम DamID-सेक जीनोम परमाणु पटल (एनएल) संघों 10 के अध्ययन के लिए माइक्रोएरे द्वारा DamID तुलना में एक उच्च संकल्प है और एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान की है कि पाया। यह बेहतर तरीका जीन संरचनाओं 10 के भीतर नाथन संघों की जांच कर रही अनुमति देता है और इस तरह के चिप seq और आरएनए seq के रूप में अन्य उच्च throughput अनुक्रमण डेटा, साथ तुलना की सुविधा।
यहाँ वर्णित DamID-सेक प्रोटोकॉल शुरू में मानचित्रण जीनोम नाथन संघों 10 के लिए विकसित किया गया था। हम ई करने के लिए माउस या मानव Lamin बी 1 tethering द्वारा एक संलयन प्रोटीन उत्पन्न कोलाई डीएनए एडिनाइन मिथाइल और C2C12 माउस (डेटा प्रकाशित नहीं) 10 और IMR90 मानव भ्रूण फेफड़ों fibroblasts myoblasts, 3T3 माउस भ्रूण fibroblasts में प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। इस प्रोटोकॉल में, हम ग के साथ शुरूवैक्टर onstructing और स्तनधारी कोशिकाओं 24 में lentiviral संक्रमण से बांध सीमित संलयन प्रोटीन व्यक्त। अगला, हम एडिनाइन-methylated डीएनए टुकड़े amplifying और अन्य जीवों में लागू किया जाना चाहिए कि अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी की विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of …
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
Tris | brand not critical | ||
EDTA | brand not critical | ||
200 Proof EtOH | brand not critical | ||
Isopropanol | brand not critical | ||
Sodium Acetate | brand not critical | ||
DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow Fragment (3’ -> 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 11.2; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5X KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10mM dNTP mix |
agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
Spectrophotometer | brand not critical | ||
0.45 um PVDF Filter | brand not critical | ||
25 ml Seringe | brand not critical | ||
10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
Vortex Mixer | brand not critical | ||
Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
Microcentrifuge | brand not critical | ||
Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
UV transilluminator | brand not critical | ||
E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |