Introduction
Eliminering specifikke celler uden at beskadige andre celler er yderst vanskeligt, især i etablerede væv, og der er et presserende behov for en celle eliminationsmetode i vævet ingeniørområdet. Dag inden for regenerativ medicin, vævskulturer benytter embryonale stamceller (ES), pluripotente stamceller (PSC) eller induceret pluripotente stamcelle (IPS) er lovende materialer 1 - 3 ud.
Selvom denne vævsregeneration er lovende, kontaminering med uønskede celler er et stort problem. Desuden er der en sikkerhedsrisiko for tumorgenicitet efter transplantation 4,5. Skønt mange undersøgelser har fokuseret på disse emner for at fjerne specifikke celler, især i regenerativ medicin 6 - 8, er blevet udviklet nogen praktisk metode.
I nærheden af infrarød photoimmunotherapy (NIR-PIT) er en behandling baseret på et antistof-fotoabsorberende conjugate (APC). En APC består af en celle-specifikt monoklonalt antistof (mAb) og et fotoabsorberende, IR700. IR700 er et hydrofilt silica-phthalocyanin derivat og inducerer ikke fototoksicitet af sig selv 9. IR700 er kovalent konjugeret til antistoffet via amidresterne på sidekæden af lysin molekyler. APC binder målmolekyler på cellemembranen og derefter inducerer næsten øjeblikkelig celle nekrose efter udsættelse for NIR lys ved 690 nm. Under udsættelsen for NIR-lys, cellemembranen brister fører til celle Død 9 - 14. NIR-PIT har vist sig at være effektiv med flere antistoffer eller antistoffragmenter, herunder anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesothelin, anti-GPC3, og anti-CEA 15 -. 21 Derfor kan NIR-PIT anvendes mod en bred vifte af målmolekyler. Desuden NIR-PIT er en velkontrolleret behandling, der muliggør selektiv behandling af specifikke regioner ved at begrænse NIR-light bestråling 18,22.
Her præsenteres en metode til specifik celle eliminering hjælp NIR-PIT fra blandede 3D kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Følgende protokol beskriver de nødvendige skridt til at fjerne specifikke celler ved hjælp af NIR-PIT. Kontrol og andre detaljer om NIR-PIT og cellernes levedygtighed kan findes andre steder 18.
1. Konjugering af IR700 til monoklonale antistoffer (mAb)
- Forbered mAb af interesse på 2-5 mg / ml i 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) opløsning.
- Bland 6,8 nmol mAb med 30,8 nmol 10 mM IR700 i 0,1 M Na 2 HPO 4-opløsning (pH 8,6) i et mikrocentrifugerør og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time, dækket med aluminiumsfolie.
- Vask PD-10 søjle (se tabel Materialer / udstyr) med 15 ml PBS, to gange. Læg prøven fra trin 1.2.
- Oprens blandingen via PD-10 søjle af PBS eluering ifølge producentens instruktioner.
Bemærk: Her elueringen var langs bandet farve IR700. For en 300 pi prøve, PBS elueringsfraktion er typisk mellem 2,5 ml til 4,4 ml. - Bestemproteinkoncentration med Coomassie-farvning ved måling af absorptionen ved 595 nm med et spektrofotometer 9. Bestem koncentrationen af IR700 med absorption ved 689 nm for at bekræfte antallet af fluoroforen molekyler konjugeret til hver mAb molekyle 9.
Bemærk: Det er vigtigt at fastslå et optimalt konjugation antal IR700 molekyler i en mAb med et spektrofotometer. Generelt omkring 3 IR700 molekyler i 1 mAb molekyle er optimalt for både in vitro og in vivo arbejde. HPLC og SDS-PAGE metoder kan anvendes til at bekræfte, om mAb'et og IR700 er bundet eller ej. - Opbevar ved 4 ° C efter bestemmelse af protein koncentration.
2. Udarbejdelse af Blandet 3D Cell Culture (Mixed Sfæroide)
- Påfør sterilt vand (ca. 1 ml) ind i pladen reservoir sektion af hængende dråbe plader.
- Forbered forskellige forhold i de celletyper af interesse - A431-luc-GFP celler og 3T3-RFP celler -med hver prøve indeholdende 5000 celler total suspenderet i 50 pi dyrkningsmedier.
Bemærk: Der fremstilles 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, osv forhold mellem celletyper af interesse i dyrkningsmedier afhængigt af celletype. - Inkuber blandingen i 5-7 dage i 96 brønd hængende dråbe plade i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% carbondioxid. Skift dyrkningsmedier hver 2 dage. Bemærk: For at gøre 3D klumpformet præcist håndtere pladen forsigtigt, som dråber, der indeholder celler falde let, inden den 3D-figurer.
- Observere morfologi og størrelse af sfæroiderne anvendelse af et omvendt mikroskop ved lysfelt 10X - 40X forstørrelse. Bemærk: Selvom det afhænger af celletyper og størrelsen af hængende-dråbe, sørge for, at diameteren af sfæroid er omkring 400-600 um efter 7 dages inkubering i 96 brønd hængende dråbe plade.
3. In Vitro NIR-PIT for Blandet 3D Cell Culture
- Skift medierne i hanging drop plader til 10 ug / ml antistof-fotoabsorberende konjugat (APC), der indeholder medier, og inkuberes i 6 timer i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% carbondioxid.
- Efter 6 timers inkubation, vaskes sfæroid to gange med frisk dyrkningsmedium (phenolrødtfrit). overføre forsigtigt sfæroid til en glas-bund 50 mm skål med 100 pi frisk phenolrødt frit dyrkningsmedium under anvendelse af en steril 200 gl pipettespids med spidsen skåret af. Placer en klumpformet i hver skål.
- Observere sfæroid med en omvendt lysfelt mikroskop for at detektere ændringen af morfologi. At observere de optiske reportere (f.eks GFP og RFP) bruger fluorescens mikroskop med følgende filterindstillinger: GFP - 469 nm excitation filter, og 525 nm emission filter; RFP - 559 nm excitation filter, og 630 nm emission filter.
- Placer lysemitterende diode (LED) over glas-bund skål for bestråling.
Bemærk: Sfæroider kan blive udsat for NIRlys enten på mikroskopet eller i laminar hætte.- Mål effekttæthed af NIR-lys med en optisk effektmåler 9. Ifølge denne måling, bestråle NIR-lys via lysemitterende dioder (LED), der udsender lys ved bølgelængder af 670 til 710 nm ved 2 J / cm2.
Bemærk: LED-lys kan trænge maksimal dybde på ca. 5 inches. Cytotoksiske virkninger af NIR-PIT kun afhænger given energi uanset effekttæthed og varigheden af eksponeringen 23.
- Mål effekttæthed af NIR-lys med en optisk effektmåler 9. Ifølge denne måling, bestråle NIR-lys via lysemitterende dioder (LED), der udsender lys ved bølgelængder af 670 til 710 nm ved 2 J / cm2.
- Efter bestråling overføre sfæroid til en ny hængende dråbe-plade med 50 pi friske dyrkningsmedier og inkuberes i 1 dag i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% carbondioxid.
- overføre forsigtigt sfæroid til en glasbund fad med 100 pi frisk dyrkningsmedium (phenolrødtfrit) under anvendelse af en steril 200 gl pipettespids med spidsen skåret af. Overhold sfæroiden med et fluorescensmikroskop 1 dag efter NIR-PIT hjælp filter indstillinger beskrevet i trin 3.3.
- Detect døde celler ved at tilsætte propidiumiodid til medierne til en slutkoncentration på 2 ug / ml, eller ved tab af cytoplasmiske GFP-fluorescens ved anvendelse af et fluorescensmikroskop (figur 2B) 14,18,22.
- Gentag trin 3,1-3,6 hvis målcellerne ikke er fuldstændig afskaffet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For optisk at overvåge effekten af NIR-PIT, at A431-cellelinje, der overudtrykker EGFR, blev genetisk modificeret til at også at udtrykke GFP og luciferase (A431-luc-GFP). Som en ikke-mål for NIR-PIT blev Balb / 3T3 cellelinje optisk modificeret til at udtrykke RFP (3T3-RFP). APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), blev syntetiseret. Blandede sfæroider, som blev sammensat af forskellige forhold af celler (A431-luc-GFP og 3T3-RFP) blev fremstillet i overensstemmelse med denne protokol (figur 1). Gentagen NIR-PIT blev udført med inkubation af pan-IR700 (se regime i figur 2A). Målcelle eliminering fra denne blandede 3D kultur blev opnået og overvåget med fluorescens og luciferaseaktiviteter (figur 2B, C). På den anden side, ikke-målceller fortsatte med at vokse.
Figur 2. Target celleeliminering i 3D-celle sfæroider (blandede sfæroider af A431-luc-GFP og 3T3-RFP-celler). (A) NIR-PIT (2 J / cm2) regime er vist. (B) Gentagen NIR-PIT helt elimineret target-celler (A431-luc-GFP) med ingen skade til uden for målgruppen celler (3T3-RFP), i en blandet 3D sfæroid. Bar = 200 um. (C) Kvantificering af luciferaseaktiviteter (RLU-forhold)demonstreret fuldstændig eliminering af målceller (n = 10 sfæroider i hver gruppe). Dette tal er blevet ændret fra 18. Data er udtrykt som middelværdi ± sem Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en fremgangsmåde til specifik celle eliminering fra en blandet 3D cellekultur uden beskadigelse ikke-målceller ved hjælp af NIR-PIT. Hidtil er der ingen praktisk metode til celleeliminering når vævet er etableret, eller efter transplantation. Således NIR-PIT er en lovende metode til at opnå dette. Denne teknik kan også anvendes in vivo 18,22, eftersom APC'er viser samme farmakokinetik som mAb selv. Målcelletypen kan tilpasses med forskellige APC. Forskellige antistoffer eller antistoffragmenter, herunder anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mesothelin, og anti-CEA blev allerede anvendt som APC'er 15 -. 21 Derudover kan ændre regionen NIR-bestråling minimere regionen behandles. Her, med kvantificering af luciferaseaktivitet og fluorescens på målceller, blev fuldstændig eliminering af specifikke celler bekræftes.
NIR-PIT er en lys baseret terapi, således et kritisk punkt er than afstand mellem NIR-lyskilden og målet, idet lysenergi og derfor cellenekrose fald ifølge en AFSTANDSKVADRATLOVEN (trin 3.4). At gøre 3D sfæroid præcist pladen skal behandles og inkuberes så skånsomt som muligt. Dråberne indeholder celler let ødelægges eller falde af en lille chok, inden den 3D-figurer.
NIR-PIT har flere unikke fordele. Først NIR-PIT APC'er demonstrerer lignende intravenøse farmakokinetik til parentale ikke-konjugerede antistoffer, på grund af de hydrofile egenskaber ved IR700, der fører til yderst specifik binding til målceller og minimal ikke-mål akkumulering. Selv efter transplantation af vævet, kan NIR-PIT behandle målceller via intravenøs injektion af APC efterfulgt af udsættelse af området af interesse til NIR. For det andet kan NIR-lys trænge langt dybere ind i vævet end UV eller synligt lys, kunne derfor NIR-PIT behandle ikke kun overfladen men også entire tykkelsen af det transplanterede væv ved udsættelse for NIR ved overfladen. Endelig kan NIR-PIT anvendes gentagne gange til at eliminere målceller uden begrænsning. Denne metode er nyttig, når målceller udtrykker tilstrækkelige kopier af målmolekyler på celleoverfladen 18.
Der er dog nogle begrænsninger for denne teknik. For det første er permeabiliteten af APC begrænset, da det er et stort molekyle. For at overvinde dette problem, gentages NIR-pit behandling eller antistoffragmenter kan udnyttes 18,19,22. En anden begrænsning er lysgennemtrængning. Selvom NIR-lys korrekt kan trænge in vitro kultur, oversættelse til in vivo-behandling vil kræve tilpassede tilgange som fordøjelsessystemet endoskopi, bronkoskopi, eller direkte thoracoskopi med fiberoptik til at bevæge lyskilden tættere på målområdet.
Yderligere tilpasninger af NIR-PIT vil muliggøre brugen af denne fremgangsmåde i både lokale og specSp ec ifik celle elimination på mange områder, såsom immunmodulation eller tumor mikromiljøer 24 - 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | |
| Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) | HDP1096-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumab) | Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) | ||
| 35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, USA) | D35-10-0-N |
References
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).
- Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).
- Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143 (4), 508-525 (2010).
- Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).
- Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).
- Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).
- Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12 (1), 345 (2012).
- Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).
- Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).
- Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).
- Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9 (11), 113276 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).
- Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
- Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).
- Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).
- Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).
- Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14 (1), 389 (2014).
- Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).
- Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
