Introduction
Устранение конкретных клеток, не повреждая другие клетки крайне сложно, особенно в установленном ткани, и существует острая потребность в способе устранения клеток в тканевой инженерии области. В настоящее время в области регенеративной медицины, культуры тканей с использованием эмбриональных стволовых клеток (ES), плюрипотентные стволовые клетки (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПС) являются перспективными материалами 1 - 3.
Хотя эта регенерации тканей является перспективным, загрязнение нежелательных клеток является серьезной проблемой. Кроме того, существует беспокойство безопасности туморогенности после трансплантации 4,5. Хотя многие исследования были сосредоточены на этих вопросах , чтобы устранить специфические клетки, особенно в регенеративной медицине 6 - 8, ни один практический метод не был разработан.
Рядом с инфракрасной photoimmunotherapy (NIR-ИПН) является лечение, основанное на антитело-photoabsorber conjugatе (APC). АРС состоит из клеток-специфических моноклональных антител (монАТ) и photoabsorber, IR700. IR700 представляет собой гидрофильную производное кремнезем-фталоцианина и не вызывает фототоксичности сам по себе 9. IR700 ковалентно конъюгированный с антителом через амидные остатков в боковой цепи молекул лизина. АРС связывает молекулы-мишени на мембране клетки, а затем вызывает почти немедленное некроз клеток после воздействия NIR света при 690 нм. Во время воздействия NIR-света, клеточные мембраны разрывов , приводящих к клеточной смерти 9 - 14. NIR-PIT доказала свою эффективность с несколькими антител или фрагментов антител, в том числе анти-EGFR, анти-HER2, анти-PSMA, анти-CD25, анти-mesothelin, анти-GPC3, и анти-СЕА 15 - 21. Таким образом, БИК-PIT могут быть использованы против широкого спектра молекул-мишеней. Кроме того, NIR-PIT является хорошо контролируемое лечение, которое позволяет избирательно лечение конкретных регионов путем ограничения NIR-LIGHт облучение 18,22.
Здесь мы представляем метод устранения специфического клеточного использованием БИК-шахтное из смешанных 3D культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Следующий протокол описывает необходимые шаги для устранения конкретных клеток с использованием БИК-шахтное. Органы управления и другие сведения о NIR-шахтное и жизнеспособность клеток может быть найден в другом месте 18.
1. Сопряжение IR700 с моноклональными антителами (МКА)
- Подготовить МАБ интерес по 2-5 мг / мл в 0,1 (8,6 рН) М раствора Na 2 HPO 4.
- Смешайте 6,8 нмоль мАт с 30,8 нмоль 10 мМ IR700 в 0,1 М Na 4 раствор 2 HPO (рН 8,6) в микроцентрифужных трубки и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч, покрытые алюминиевой фольгой.
- Промыть колонку PD-10 (см Таблицу материалов / оборудования) с 15 мл PBS, дважды. Загрузите образец с шага 1.2.
- Очищают смесь через колонку PD-10 с помощью PBS элюирования в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Здесь элюции вдоль полосы цвета IR700. Для образца 300 мкл PBS, элюирование фракции обычно составляет от 2,5 мл до 4,4 мл. - ОбозначитьКонцентрацию белка с окрашиванием Кумасси путем измерения поглощения при 595 нм с помощью спектрофотометра 9. Определить концентрацию IR700 с поглощением при 689 нм , чтобы подтвердить количество молекул флуорофора конъюгированных с каждой молекулой монАТ 9.
Примечание: Важно, чтобы определить оптимальное число Конъюгирование молекул IR700 в 1 мАт с помощью спектрофотометра. Как правило, около 3 молекул IR700 в 1 молекуле мАт является оптимальным для как в пробирке и в естественных условиях работы. ВЭЖХ и SDS-PAGE методы могут быть использованы для подтверждения того, связаны или не мАт и IR700. - Хранить при температуре 4 ° С, после определения концентрации белка.
2. Получение смешанных 3D культуре клеток (смешанное Сфероид)
- Применить стерильную воду (около 1 мл) в резервуар секции пластины свисающими пластин.
- Подготовьте различные соотношения типов клеток, представляющих интерес - А431-Luc-GFP клетки и 3T3-RFP клетки -с каждой пробы, содержащей 5000 клеток общей сложности, суспендированных в 50 мкл культуральной среды.
Примечание: Приготовьте 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, и т.д. соотношения типов клеток , представляющих интерес в культуральной среде в зависимости от типа клеток. - Выдержите смесь в течение 5-7 дней в 96-луночный свисающими пластины в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% углекислого газа. Изменение медиакультуры каждые 2 дня. Примечание: Для того, чтобы сделать 3D сфероида точно, обрабатывать пластины аккуратно, как капли, содержащие клетки легко опадают до формирования 3D-фигур.
- Обратите внимание на морфологию и размер сфероидов с использованием инвертированного микроскопа при светлого 10х - 40-кратном увеличении. Примечание: Хотя это зависит от типа клеток и размером висячей капле, убедитесь, что диаметр сфероида составляет около 400-600 мкм, после 7 дней инкубации в 96-луночных свисающими пластину.
3. In Vitro NIR-PIT для смешанных 3D культуре клеток
- Изменение в СМИ гаnging падение пластин до 10 мкг / мл антитела-photoabsorber конъюгата (APC), содержащих средства массовой информации, и инкубируют в течение 6 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% углекислого газа.
- Через 6 часов инкубации, промыть сфероид дважды свежей культуральной среды (фенол красный свободный). Аккуратно перенести сфероида со стеклянным дном 50 мм блюдо с 100 мкл свежей фенола красного свободный культуральной среды с использованием стерильного 200 мкл кончиком пипетки с наконечником отрезаны. Поместите один сфероид в каждом блюде.
- Обратите внимание на сфероид с перевернутой светлопольному микроскопом, чтобы обнаружить изменение морфологии. Для наблюдения оптических репортеров (например, GFP и RFP) с помощью флуоресцентного микроскопа со следующими параметрами фильтра: GFP - фильтр возбуждения 469 нм и фильтр излучения 525 нм; RFP - 559 нм фильтр возбуждения и 630 нм фильтра выбросов.
- Поместите светоизлучающий диод (СИД) над стеклянным дном тарелки для облучения.
Примечание: Spheroids могут подвергаться НДКзажигать либо на микроскопе или в ламинарном шкафу.- Измерьте плотность мощности БИК-света с оптическим измерителем мощности 9. В соответствии с этим измерением, облучать NIR-свет с помощью светодиодов (LED) , которые излучают свет с длиной волны 670 710 нм при 2 Дж / см 2.
Примечание: Светодиодный свет может проникать максимальную глубину примерно 5 дюймов. Цитотоксические эффекты NIR-PIT зависит только от заданной энергии , независимо от плотности мощности и длительности воздействия 23.
- Измерьте плотность мощности БИК-света с оптическим измерителем мощности 9. В соответствии с этим измерением, облучать NIR-свет с помощью светодиодов (LED) , которые излучают свет с длиной волны 670 710 нм при 2 Дж / см 2.
- После облучения передавать сфероид в новую висячей капли пластины с 50 мкл свежей культуральной среды и инкубируют в течение 1 дня в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% углекислого газа.
- Аккуратно перенести сфероид стеклянным дном блюдо с 100 мкл свежей культуральной среды (фенол красный свободный), используя стерильный 200 мкл кончиком пипетки с наконечником отрезан. Обратите внимание на сфероид с помощью флуоресцентного микроскопа 1 день после NIR-PIT с использованием фиПараметры LTER описано на шаге 3.3.
- Обнаружение мертвые клетки путем добавления пропидий йодида в средствах массовой информации , в конечной концентрации 2 мкг / мл, или потерей цитоплазматического GFP-флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа (Фигура 2В) 14,18,22.
- Повторите шаги 3.1-3.6, если клетки-мишени не полностью устранены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы оптически наблюдать эффект NIR-PIT, в А431 клеточной линии, которая гиперэкспрессией EGFR, была генетически модифицированной также выразить GFP и люциферазу (А431-Luc-GFP). В качестве нецелевых БИК-шахтное, клеточная линия Balb / 3T3 был оптически изменен, чтобы выразить RFP (3T3-RFP). APC, панитумумаба-IR700 (пан-IR700), был синтезирован. Смешанные сфероиды, которые были составлены из различных соотношений клеток (А431-Luc-GFP и 3T3-RFP) были изготовлены в соответствии с этим протоколом (рисунок 1). Повторные NIR-PIT осуществляли с помощью инкубации пан-IR700 (см схему на рисунке 2А). Элиминация клеток мишени из этой смешанной 3D культуры была достигнута , и мониторинг с флуоресценцией и люциферазы деятельности (Фигура 2В, С). С другой стороны, нецелевые клетки продолжали расти.
Рисунок 2. устранение клеток - мишеней в сфероидов 3D клеток (смешанные сфероидов A431-Luc-GFP и RFP 3T3-клеток). (A) БИК-PIT (2 Дж / см 2) режим показан. (B) Многократное NIR-PIT полностью устранен клетки - мишени (А431-Luc-GFP) без вреда для нецелевых клеток (3T3-RFP), в смешанном 3D сфероида. Бар = 200 мкм. (С) Количественная люциферазы деятельности (соотношение РОС)продемонстрировал полное устранение клеток-мишеней (п = 10 сфероидов в каждой группе). Эта цифра была изменена с 18. Данные выражены в виде среднего ± СЭМ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Демонстрируется способ устранения специфического клеточного из смешанной 3D культуры клеток без ущерба для нецелевых клеток с использованием БИК-шахтное. До сих пор не существует практического метода элиминации клеток, как только будет установлено ткани или после трансплантации. Таким образом, NIR-PIT является перспективным методом для достижения этой цели. Этот метод также может быть использован в естественных условиях 18,22, так как АРС показывают подобную фармакокинетику , как и сама мАт. Типа клетка-мишень может быть адаптирована с различными APC. Различные антитела или фрагменты антител, в том числе анти-EGFR, анти-PSMA, анти-mesothelin и анти-CEA уже использовались в качестве АРС 15 - 21. Кроме того, изменение области NIR-облучения можно свести к минимуму область обработанную. Здесь, с квантификации активности люциферазы и флуоресценции на клетки-мишени, полное устранение специфических клеток была подтверждена.
NIR-PIT является свет терапия на основе, таким образом, критическая точка тон расстояние между источником NIR-света и цели, так как световой энергии и, следовательно, клеточного некроза уменьшается в соответствии с закону обратных квадратов (шаг 3.4). Для того, чтобы сделать 3D сфероида точно, пластина должна быть обработаны и инкубируют как можно более осторожно. Капли, содержащие клетки легко разрушаются или упасть с небольшим током до формирования 3D-фигур.
NIR-PIT имеет несколько уникальных преимуществ. Во-первых, NIR-PIT АРС демонстрируют аналогичные внутривенные фармакокинетики в родительских неконъюгированных антител, в связи с гидрофильными характеристиками IR700, которые приводят к весьма специфическое связывание с клетками-мишенями и минимальное накопление нецелевых. Таким образом, даже после пересадки ткани, БИК-ямку можно лечить клетки-мишени, с помощью внутривенной инъекции АРС с последующим воздействием области, представляющей интерес для НДК. Во-вторых, NIR-свет может проникать гораздо глубже в ткани, чем УФ или видимого света, поэтому, NIR-PIT может относиться не только поверхность, но и ENTIRe толщины пересаженной ткани за счет воздействия NIR на поверхности. Наконец, NIR-PIT могут быть повторно использованы для устранения клеток-мишеней без ограничений. Этот метод полезен , когда клетки - мишени выражают достаточное количество экземпляров молекул - мишеней на поверхности 18 клеток.
Тем не менее, существуют некоторые ограничения этой методики. Во-первых, проницаемость APC ограничено, так как оно представляет собой большую молекулу. Чтобы преодолеть эту проблему, повторил NIR-PIT лечения или фрагменты антител могут быть использованы 18,19,22. Другим ограничением является проникновение света. Хотя NIR-свет может проникать должным образом культуру в пробирке, перевод на лечение в естественных условиях, потребует адаптированных подходов , таких как пищеварительный эндоскопия, бронхоскопия, или прямой торакоскопии с световоды , чтобы переместить источник света ближе к целевой области.
Дополнительные приспособления NIR-PIT позволит использование этого метода в локальных и спецификацииустранение клеток IFIC во многих областях, таких как Иммуномодуляция или опухоли микросреды 24 - 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано исследовательской программой Intramural Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт рака, Центр по исследованию рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | |
| Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) | HDP1096-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumab) | Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) | ||
| 35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, USA) | D35-10-0-N |
References
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).
- Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).
- Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143 (4), 508-525 (2010).
- Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).
- Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).
- Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).
- Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12 (1), 345 (2012).
- Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).
- Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).
- Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).
- Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9 (11), 113276 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).
- Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
- Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).
- Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).
- Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).
- Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14 (1), 389 (2014).
- Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).
- Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
