Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

Published: February 18, 2016 doi: 10.3791/53637
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology, Biophysics and Neurosciences, Center for Research and Advanced Studies (CINVESTAV-IPN), 2Department of Experimental Pathology, Nacional Institute of Neurology and Neurosurgery

Abstract

يوصف أسلوب ثقافة ثلاثي الأبعاد التي تزرع خلايا الورم الحميد في الغدة النخامية الأولية في حبات الجينات. الجينات هو بوليمر المستمدة من الطحالب البحرية البني. لفترة وجيزة، يتم قطع نسيج الورم إلى أجزاء صغيرة وتقديمها إلى الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز والتربسين. بعد ذلك، يتم الحصول على تعليق خلية. يتم خلط تعليق خلية الورم مع 1.2٪ الجينات الصوديوم وانخفض إلى 2 حل CaCl، وتبلور تعليق الجينات / الخلية على اتصال مع CaCl 2 لتشكيل حبات كروية. يتم تزويد الخلايا جزءا لا يتجزأ من الخرز الجينات مع المواد الغذائية التي تقدمها وسائل الإعلام الثقافة المخصب بنسبة 20٪ FBS. ثقافة ثلاثي الأبعاد في حبات الجينات يحافظ على سلامة خلايا الورم الحميد لفترات طويلة من الزمن، تصل إلى أربعة أشهر. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا يمكن أن تتحرر من الجينات عن طريق غسل الخرز مع سترات الصوديوم والمصنفة على coverslips الزجاج لإجراء المزيد من التحليلات immunocytochemical. استخدام سلنموذج الثقافة ل يسمح لتثبيت والتصور من الهيكل الخلوي الأكتين مع الحد الأدنى من الفوضى. وباختصار، توفر الخرز الجينات نظام الثقافة موثوق للحفاظ على خلايا ورم الغدة النخامية.

Introduction

وقد استخدمت السقالات ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع في زراعة الخلايا لأنها توفر الدعم الهيكلي ثلاثي الأبعاد للخلايا المستزرعة والحفاظ على خلية الى خلية الاتصال 1. وقد استخدمت مواد البوليمر المشتقة من الطبيعي أن يجعل السقالات ثلاثية الأبعاد بما في ذلك النوع الأول الكولاجين، الشيتوزان والجينات. الجينات هو بوليمر طبيعي مشتق من Macrocystispyrifera الطحالب البني البحر (عشب البحر). ويتكون هذا البوليمر وحدات متكررة من حمض β-D-mannuronic (M) وα-L-guluronic حمض (G) (2) وأشكال المواد الهلامية مستقرة في وجود بعض الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مثل الكالسيوم والباريوم. وتستخدم (CaCl 2) حلول كلوريد الكالسيوم عموما باسم كاشف يشابك لتشكيل الخرز الجينات. انخفضت حلول الجينات في CaCl 2 تشكيل الفور المواد الهلامية كروية ثلاثية الأبعاد. عندما يتم خلط حل الجينات مع الخلايا، يتم تغليف الخلايا في الجينات باي ايه دي اس 3.

لديها الجينات الخصائص التي مكنته من أن تستخدم مصفوفة لتغليف مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك غضروفية 4، myoblasts الهيكل العظمي 5 والخلايا الجذعية العصبية 6. ومن المواد الخاملة ويسمح للنشر المواد المغذية والأكسجين ومنتجات الأيض التي تحافظ على بقاء الخلية ووظيفتها. علاوة على ذلك، على عكس الأنظمة الأخرى التي تعتمد على ثقافة هلام، والخلايا مثقف داخل حبات الجينات يمكن أيضا أن تتحرر من السقالة باستخدام chelators الكالسيوم، مثل سترات الصوديوم، ويمكن بعد ذلك الخلايا أن تحصد لمزيد من التحقيقات 7.

أورام الغدة النخامية عادة أورام حميدة مع معدلات انتشار منخفضة. وكانت الفئران خطوط الخلايا ورم الغدة النخامية مثقف بنجاح في نظام ثنائي الأبعاد 8. ومع ذلك، هذه الثقافة من إفرازية أورام الخلايا النخامية الإنسان ليست تنمية كفاءة؛ فرقت الخلايا السرطانية في الغدة النخامية تنمو بشكل سيئفي الثقافة والخلايا يحمل المرفق محدود، ونشر، والخلايا عادة تشكل مجاميع العائمة في صحن الثقافة 9،10.

وقد بذلت عدة محاولات للحصول على تعليق ورم الخلايا النخامية، بما في ذلك النهج الأنزيمية وتشتت الميكانيكية 11، نهج تشتت الميكانيكية فقط 12 وزراعة من إإكسبلنتس ورم 10. مع هذه المناهج، والحصول على الكتاب مختلف الثقافات ملتصقة قابلة للحياة لفترات مختلفة من الزمن. قدرات الخلايا السرطانية إفرازية البقاء على قيد الحياة في هذه النظم ثنائية الأبعاد تعتمد على نوع الورم ومعدلات انتشارها 9. ومع ذلك، في الثقافات على المدى الطويل، والخلايا الليفية مع الظواهر تسود 11،13. وتصف هذه الورقة طريقة الحصول على ثقافة الأولية من خلايا الورم الحميد في الغدة النخامية مغلفة في حبات الجينات التي تحرر مزيد لهم من سقالة الجينات التي تمكن تحليلات مفصلة للجوانب بيولوجيا الخلية، وعلى سبيل المثال، ترتيباتها هيكل الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت هذه الدراسة لاستخدام المواد البشرية من قبل اللجان الأخلاقية المحلية للمؤسسة الطبية ومركز البحوث والدراسات المتقدمة في معهد البوليتكنيك الوطني.

1. ورم اكتساب عينة

  1. الحصول على خزعة الأنسجة ورم الغدة النخامية من المريض عن طريق الجراحة بطريق الوتدي 14.
  2. جمع عينة ورم الغدة النخامية ووضعه في زجاجة معقمة تحتوي على 50 مل من جديد 199 مستنبت (M199) المخصب بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.6 ملغ / مل بيكربونات الصوديوم، 2.4 ملغ / مل HEPES و 1٪ المضادات الحيوية (البنسلين / الستربتومايسين) في 7.4 درجة الحموضة. الحفاظ على عينة في زجاجة على الجليد.
    ملاحظة: نسيج الورم يمكن معالجة العديد من ساعة بعد الجراحة.
  3. نقل عينة الورم إلى المختبر في زجاجة على الجليد.

2. إعداد حلول الأنسجة تفارق الأنزيمية، والحل التربسين المانع وحلول الجيني

ملاحظة: قبل إجراء زراعة الخلايا إعداد الحلول التالية. تصفية كل الحلول باستخدام فلتر 0.22 ميكرون الغشاء، قبل الاستخدام.

  1. إعداد كولاجيناز 1٪ حل عن طريق إذابة 5 ملغ من كولاجيناز (النوع الأول) في 5 مل من M199 المصل مجانا.
  2. إعداد التربسين حل 0.01٪ عن طريق إذابة 0.01 غرام من التربسين في 10 مل من برنامج تلفزيوني-EDTA 0.3٪.
  3. تحضير 0.1٪ محلول التربسين المانع عن طريق إذابة 2 ملغ من مثبط التربسين فول الصويا في 20 مل من M199 المصل مجانا.
  4. يعد حل الدناز عن طريق تذويب 20 ميكرولتر من أنا الدناز 134 U / مل في 4 مل من محلول التربسين المانع.
  5. يعد حل EGTA (1.2 م) عن طريق إذابة 22.8 ملغ من EGTA في 40 مل من 155 ملي مول كلوريد الصوديوم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. الاستمرار في الحجم النهائي من 50 مل.
  6. يعد حل HEPES (20 ملم) عن طريق إذابة 238 HEPES ملغ في 50 مل من 155 ملي مول كلوريد الصوديوم.
  7. تحضير 1.2٪ حل الجينات عن طريق إذابة 1.2ز الجينات الصوديوم في 100 مل من محلول HEPES. الأوتوكلاف الحل الجينات.
  8. يعد حل الكالسيوم (102 ملم) عن طريق إذابة 750 ملغ من CaCl 2 في 50 مل من محلول HEPES، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4

3. خلية الابتدائي الثقافة والجيني تغليف

  1. داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي، ضع نسيج الورم في 35 مم طبق بتري تحتوي على ما يقرب من 20 مل من برنامج تلفزيوني الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ مجانا، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS *).
  2. أخذ الأنسجة مع منتاش جراحية ووضعه في طبق بتري أخرى تحتوي جديدة برنامج تلفزيوني *، وغسل بلطف الأنسجة. كرر هذه الخطوة حتى يتم إزالة خلايا الدم الحمراء والحطام.
  3. باستخدام الملقط الجراحي، وعقد أنسجة ورم الغدة النخامية، ومع مقص جراحي صغير، تقطع الى قطع صغيرة. مع ماصة باستور مع حواف مدورة، ونقل أجزاء الأنسجة وبرنامج تلفزيوني * في أنبوب 15 مل، الطرد المركزي في 68 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    ملاحظة: لتدوير حواف باستورماصة، لهب قليلا غيض من ماصة في موقد بنسن.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني * باستخدام ماصة باستور وإضافة 3-5 مل من محلول كولاجيناز (حوالي 5 مل لمدة 65 ملم 3 من الأنسجة)، مزيج 2-3 مرات من قبل قلب. احتضان الأنسجة في كولاجيناز لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في دوران مستمر.
  5. أنبوب الطرد المركزي في 68 x ج لمدة 10 دقيقة في RT وإزالة كولاجيناز مع ماصة باستور.
  6. إضافة 5 مل من الدناز وتخلط 2-3 مرات من قبل قلب، ثم الطرد المركزي الأنبوب في 68 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    ملاحظة: إذا لم يتم فصل الأنسجة تماما، إجراء عملية الهضم الأنزيمي الثاني مع التربسين لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. وقف عملية الهضم عن طريق إضافة وحدات التخزين 2 من حل مثبط التربسين.
  7. نضح طاف مع ماصة باستور وتجاهل. إعادة تعليق بيليه في حجم 1 من حل EGTA وتخلط مع 2 مجلدات من حل الجينات.
  8. المزيج بلطف تعليق الخلية والجيناتبواسطة pipetting مع ماصة باستور. خذ محقنة معقمة مع 21 G إبرة، وإزالة المكبس. استخدام ماصة لتحميل المحاقن مع الحل الجينات والخلايا.
  9. إدراج بلطف على المكبس إلى حقنة والاستغناء بعناية الحل الجينات خلية إسقاط تلو قطرة في كوب زجاجي يحتوي على حوالي 30 مل من محلول الغنية بالكالسيوم.
  10. وضع إبرة الحقنة حوالي 5 سم وحتى حل CaCl 2. المواد الهلامية تعليق الجينات الخلية على اتصال مع CaCl 2 لتشكيل حبات كروية. الحفاظ على حبات الجينات في حل الكالسيوم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: تحريك الدورق الزجاجي الذي يتم إسقاط الخرز. تحرك ببطء مع اليد في حركات دائرية، لمنعها من الالتصاق ببعضها البعض.
  11. إزالة بعناية حل الكالسيوم مع ماصة باستور، وتغسل حبات مرتين مع 3-5 مل من M199 المخصب بنسبة 20٪ من FBS.
  12. نقل حبات الجينات في زراعة الأنسجة T25 العاديةقارورة معقمة باستخدام ملعقة، إضافة 4-5 مل من M199 المخصب بنسبة 20٪ FBS وحضنت عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم الثالث على التوالي.

4. حرروا خلايا من الجينات

ملاحظة: قبل تحرير الخلايا من الخرز الجينات، ومعطف 13 coverslips مم مع بولي-D-ليسين.

تنبيه: حامض الكبريتيك هو الأكالة ACID، وAPTS يمكن أن يسبب تهيج العين والجلد. يستعمل قفازات مطاطية للتعامل مع هذه الكواشف.

  1. في غطاء الدخان، مع منتاش نقطة تزج لل coverslips في طبق بتري زجاجي يحتوي على 20٪ مائي حامض الكبريتيك لمدة 1 ساعة على RT.
  2. صب حامض الكبريتيك، وغسل لل coverslips خمس مرات مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما. عن طريق مكان نقطة منتاش لل coverslips نظيفة في طبق بتري تحتوي على 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 5 دقائق على RT 15.
  3. صب هيدروكسيد الصوديوم ويغسل مرة واحدة مع استخلاصالمياه أدى، نضح الماء وتجفيف coverslips.
  4. استخدام micropipette إلى معطف لل coverslips مع APTS (أمينو-triethoxysilane) لمدة 4 دقائق (استخدام 500 ميكرولتر لمدة 6 coverslips) إغراق طبق بيتري مع الماء المقطر. نضح الماء بسرعة والاستمرار في غسل بالماء المقطر، والانتقال لل coverslips مع ملاقط نقطة للسماح للماء بالنفاذ إلى تحت.
  5. نضح الماء وتجفيف coverslips، وذلك باستخدام مكان نقطة منتاش لل coverslips في طبق بيتري نظيفة وتعقيم لهم داخل الميكروويف خلال 3 مرات، في كل 45 ثانية. إضافة 1000 ميكرولتر من الماء المعقم إلى 100 ميكروغرام من بولي-D-ليسين (0.1 ملغ / مل).
  6. لاحتضان coverslips مع ما يقرب من 50 ميكرولتر من بولي-D-ليسين لمدة 5 دقائق على RT. نضح بولي-D-يسين تماما.
    ملاحظة: هذا مهم جدا لأنه قابل للذوبان بولي-D-ليسين في مستنبت يمكن أن تمنع تكاثر الخلايا.
  7. شطف لل coverslips خمس مرات مع الماء المعقم لمدة 5 دقائق لكل منهما. نضح الحاديerile coverslips المياه والسماح ليجف داخل مجلس الوزراء تدفق الصفحي.
  8. تحليل الهيكل الخلوي الأكتين، وتحرير خلايا الغدة النخامية من الجينات. تأخذ بعض حبات الجينات من القارورة ثقافة باستخدام 1 مل ماصة ووضعها في أنبوب 15 مل.
  9. إضافة 5 مل من 55 ملي سيترات الصوديوم (حل 323.6 ملغ من الصوديوم 3 C 6 H 5 O 7، 2 H 2 O في 20 مل HEPES الحل) وأجهزة الطرد المركزي في 68 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نضح طاف وتجاهل.
  10. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من M199 دافئ المخصب بنسبة 20٪ FSB. المزيج بلطف تعليق الخلية مع ماصة باستور.
    تنبيه: PHALLOIDIN ودابي سامة. • استخدمي قفازات للتعامل مع هذه الكواشف.
  11. عد الخلايا، ونقل 125 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان حل الأزرق إلى أنبوب 1.5 مل. إضافة 75 ميكرولتر من M199 و 50 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة الأخيرة (عامل التخفيف = 5). تخلط جيدا.
  12. استخدام غيض micropipette إلى PLACه ما يقرب من 10 ميكرولتر من تعليق الزرقاء خلايا التريبان في غرفة عدادة الكريات.
  13. عدد الخلايا في عداد عدادة الكريات باستخدام مجهر مقلوب مع إضاءة على النقيض من المرحلة. عدد جميع الخلايا في ساحة مركز 1 ملم وأربعة مربعات الزاوية 1 مم. الحصول على كثافة الخلية في الملليمتر الواحد بضرب متوسط ​​عدد لكل متر مربع من قبل عامل التخفيف - 10 4 على سبيل المثال إذا كان متوسط ​​التهم لكل متر مربع 45 خلايا × 5 × 104 = 2.25 س 106 خلية / مل.
    ملاحظة: عدد الخلايا في عشرة مربعات من الغرفة عدادة الكريات. لا تعول الخلايا لمس خط الوسط في القاع والجانبين الأيمن.
  14. البذور 35،000 الخلايا على 13 ملم coverslips قطر الزجاج مغطاة بولي-D-ليسين.

5. الهيكل الخلوي أكتين ترتيب

  1. بعد 48 ساعة في الثقافة، وإزالة مستنبت مع ماصة باستور بسرعة وإضافة 500 ميكرولتر في ساترة من برنامج تلفزيوني، وعلى الفور إزالة برنامج تلفزيوني.
  2. إصلاح وpermeabilize رانه الخلايا مع 500 ميكرولتر في ساترة من العازلة تثبيت (0.1 M أنابيب، ودرجة الحموضة 6.75، 4٪ PEG-6000، 1 ملي EGTA، 1 ملي MgSO 4، 0.5٪ تريتون X-100 و 2٪ الفورمالديهايد) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة C
  3. إزالة المنطقة العازلة تثبيت وإضافة 500 ميكرولتر في ساترة من 3.5٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة حل لامتصاص العرق.
  4. غسل لل coverslips ثلاث مرات وذلك بإضافة 500 ميكرولتر في ساترة من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. شطف لل coverslips في RT، في التحريض المستمر.
  5. احتضان الخلايا مع كلوريد الأمونيوم 50 ملم لمدة 10 دقيقة، ونضح محلول كلوريد الأمونيوم وكرر الخطوة 5.4.
  6. احتضان الخلايا مع 1٪ BSA (مفتش خالية، خالية البروتياز) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة، وإزالة حل جيش صرب البوسنة وكرر الخطوة 5.4.
  7. احتضان الخلايا مع 50 ميكرومتر من phalloidin-رودامين مترافق لمدة 7 دقائق على RT، كرر الخطوة 5.4.
  8. احتضان الخلايا مع 255 ميكرومتر من دابي المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على RT، كرر الخطوة 5.4. وأخيرا جبل رانه coverslips مع تصاعد المتوسط ​​وختم لهم بطلاء الأظافر.
  9. الحصول على صور من الترتيبات الأكتين هيكل الخلية باستخدام متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر مع الهدف 63X، في 541 نانومتر الطول الموجي الإثارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح في الثقافة والحفاظ على خلايا ورم الغدة النخامية في حبات الجينات لفترات مختلفة من الزمن يبين الشكل 1 خلايا جزءا لا يتجزأ من الخرز الجينات بعد ثلاثة أشهر؛ هذه الخلايا يحمل أشكالا دائرية ثنائية الانكسار تحت ضوء المجهر المقلوب (الشكل 1). يبين الشكل 2 توطين N-كادهيرين في خلايا الورم الحميد الفئران الغدة النخامية جزءا لا يتجزأ من الجينات. يتم ترجمة N-كادهيرين في الاتصالات خلية خلية (الشكل 2A و 2C) وأظهر نواة لونين الموسعة (الشكل 2B و2C).

تبقى الخلايا السرطانية في حبات الجينات قابلة للحياة لمدة تصل إلى 4 أشهر في الثقافة؛ ولذلك، فإن الخلايا يمكن أن تتحرر من الخرز الجينات في أوقات مختلفة، والذي يسمح لتحليل الجوانب المختلفة لل بيولوجيا الخلية في زراعة الخلايا نفسها. على سبيل المثال، تم الحصول على مؤشر انتشار من عشرة غير عاملة أورام الغدة النخامية الإنسان باستخدام-التفاعل المناعي للكي-67، ومؤشر متوسط ​​وسم 19.2 ± 1.5٪ (يعني ± SEM) والتي تم الحصول عليها. ويبين الشكل 3 النخامية البشرية المستزرعة خلايا الورم الحميد immunostained لكي-67.

كانت ملطخة cytoskeletons الأكتين من خلايا غير الغازية وفقا لبروتوكول immunocytochemical وصف أعلاه. الخلايا ثقافة أظهرت الأشكال ممدود مع ألياف صغيرة الأكتين الإجهاد (الشكل 4A). والأشكال التضاريسية والترتيبات خيوط الأكتين اختلفت مع ورم الغدة النخامية مستقلة عن نظام الثقافة؛ على سبيل المثال، في الورم الحميد الغازية غير عاملة، وتقريب الشكل السائد بين هذه الخلايا مع هذا الترتيب من خيوط الأكتين في حلقات القشرية متقطعة. (الشكل 4B).

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل 1
الشكل 1. الخلايا جزءا لا يتجزأ من الخرز الجينات لمدة 3 أشهر. خلايا يحمل أشكالا دائرية ثنائية الانكسار تحت المجهر ضوء مقلوب. في اللوحة اليمنى خلايا macroadenoma الغازية جزءا لا يتجزأ من الجينات تظهر، وفي اللوحة اليسرى وتظهر خلايا macroadenoma غير الغازية. شريط مقياس = 15 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
كان الشكل 2. تحليل المناعية cytochemical من N-كادهيرين في الجرذ خلايا ورم الغدة النخامية (GH3) الثقافة في حبات الجينات الخلايا GH3 مثقف في الجينات، الثابتة جزءا لا يتجزأ من نظام الجينات الملون لN-كادهيرين (أحمر) ونواة (الأزرق ). وخلايا ترتيب في نائب الرئيسأولوس تبين N-كادهيرين على الحدود خلية خلية (A و C). وتظهر نواة (B و C) مع لونين الموسعة. شريط مقياس = 15 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المناعية للمستضد النووي كي 67-خلايا ورم الغدة النخامية البشرية المستزرعة بعد 2.5 أشهر في الثقافة حبة الجينات، كانت ثابتة الغازية غير عاملة خلايا الورم الحميد ثم immunostained لكي-67 (الأحمر) والنواة (الأزرق). وتشير بعض خلايا الورم الحميد المناعية إيجابية لكي-67. شريط مقياس = 15 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<الطبقة ص = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (4)
الشكل 4. ترتيبات أكتين الهيكل الخلوي للخلايا ورم الغدة النخامية تتحرر من الخرز الجينات. تم إصلاح الخلايا وملطخة للالأكتين خيوط مع TRITC-phalloidin. تم تمديد خلايا من macroadenoma غير الغازية على الركيزة، والتي تبين ألياف الأكتين الإجهاد الصغيرة (A). وأظهرت الخلايا من macroadenoma الغازية شكل مستدير مع حلقات الأكتين متقطعة (B). شريط مقياس = 15 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول لديه العديد من الخطوات الهامة. الأول هو حجم حبة التجانس، وهو مطلوب للحفاظ على نفس شروط نشر المواد المغذية والغازات في كل من زراعة الخلايا. في تجربتنا، واستخدام إبرة 21 G لجعل الخرز الجينات يسمح لاكتساب ثقافة كفاءة موحدة حجم حبة. العامل الثاني المهم هو المسافة من الإبرة. ويجب أن تكون هذه المسافة لا يزيد عن 5 سم من محلول الكالسيوم لتجنب اللؤلؤ المشوهة والخلايا الميتة بسبب اصطدام تيار الحل الجينات / الخلية التي تحتوي على السطح من الحل الكالسيوم. والخطوة الثالثة الحاسمة هي التحريك الزجاج التي يتم إسقاط حبات لمنعها من الالتصاق ببعضها البعض. التمسك النتائج في تغليف الخلايا متفاوتة.

بعض التعديلات على هذا البروتوكول يمكن القيام بها تبعا لسؤال البحث، على سبيل المثال، في تجربتنا حل الجينات الصوديوم يمكن أن تكون مختلطة ثإيث بروتين الغشاء القاعدي مثل النوع الرابع الكولاجين، وبعد بروتوكول سبق وصفها، الحصول على سقالة الجينات ثلاثية الأبعاد. والاحتمال الآخر هو لجعل العائمة وسائد الجينات في بئر قطرها 15 مم؛ داخل هذه المواد الهلامية، وخلايا يمكن المصنف أعلى أو داخلها. يمكن استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند العمل مع الجينات يكون ضروريا إذا أي تجربة معينة تحتاج تعديلات في كا 2+ أو المغنيسيوم 2+ تركيزاتها. وذلك لأن الاستقرار هيدروجيل يمكن تغييرها. با 2+-والنحاس 2+ -crosslinked المواد الهلامية الجينات مستقرة نسبيا في المحاليل المائية، للأسف، هذه الكاتيونات وغالبا ما تكون السامة للخلايا 3.

عند العمل مع أنسجة الورم مثل أنسجة الورم الحميد في الغدة النخامية وتحديد واحد من هذه التقنية هو عينة الأنسجة الصغيرة المقدمة. ولذلك، فإن عدد من الخرز الجينات التي تم الحصول عليها يعتمد على حجم عينة الأنسجة.

سابقا، نظام لالحفاظ على خلايا الورم الحميد النخامية في ثقافة ثلاثية الأبعاد وصفت. قدمت الكتاب الخلايا للفاف تهتز لتشكيل وحدات العمل والحفاظ على الخلايا في هذه الحالة لفترات مختلفة (16). استخدام هذه الثقافة تعليق خلية يتطلب معدات المحورية داخل غرفة الثقافة. ميزة واحدة من بروتوكول صفها هنا هو أنه يتيح لزراعة الخلايا في نظام ثلاثي الأبعاد دون الحاجة إلى معدات مختبر إضافية. يتم الاحتفاظ الخلايا جزءا لا يتجزأ من نظام الجينات ثلاثي الأبعاد في حاضنة العادية داخل القارورة العادية. ميزة أخرى هي أن سقالة الجينات، على النقيض من الأنظمة الثلاثة الأبعاد الأخرى، يسمح للخلايا أن تتحرر من هيدروجيل لمزيد من التحقيق 7. وعلاوة على ذلك، جانبا هاما من جوانب زراعة الخلايا في حبات الجينات هو أن الخلايا جزءا لا يتجزأ من هذا النظام هي قادرة على synthetize دي نوفو المصفوفة خارج الخلية. بديلطريقة لدراسة الخلايا جزءا لا يتجزأ من الجينات هو تثبيت من الخرز الجينات تليها الجفاف مع زيادة تركيزات من البولي ايثيلين جلايكول لباجتزاء لاحق والمناعية كيميائي نسيجي يحلل 17.

ونحن مهتمون في المستقبل لتطبيق الجينات الخرز نظام ثلاثي الأبعاد لثقافة الأولية خلايا الغدة النخامية الفئران العادية جزءا لا يتجزأ من أجل تحليل التفاعلات في بيئة ثلاثية الأبعاد، وأيضا إلى ثقافة نوع آخر من أورام الغدة النخامية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent 
199 culture medium  Invitrogen  31100-027 For culture, warm in a 37 °C water bath before use 
Fetal bovine serum  PAA A15-751
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma  H-4034
Penicillin/Streptomycin PAA P11-010
PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Invitrogen  21600-044
Collagenase type I Worthington 4176
Trypsin  Invitrogen  27250-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Research Organics 3002E
Sorbean trypsin inhibitor  Invitrogen  17075-029
DNAse Worthington 2139
Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) Sigma  A-2158
Calcium chloride (CaCl2) J.T. Baker 1332
Sodium citrate (Na3C6H5O7) J.T. Baker 3646
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Organics 9624P
Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) Calbiochem 528877
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Research Organics 9574E
Magnesium Sulfate (MgSO4) J.T. Baker 2500
Triton-X 100 Sigma X100
Formaldehyde J.T. Baker 2106
Paraformaldehyde Sigma P6148
Ammonium chloride (NH4Cl) J.T. Baker 660
BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free Jackson Immuno Research 001-000-161
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 Toxic. Use gloves to handle this reagent 
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Invitrogen  D1306 Toxic. Use gloves to handle this reagent 
Sulfuric acid (H2SO4) J.T. Baker 9681 Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent 
Sodium hydroxide (NAOH) Merck 1.06498 Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent 
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) Sigma A-3648
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
Trypan blue solution Sigma T8154 
Name   Company  Catalog Number  Comments
Equipment  Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent 
Rotator  Boekel Scientific Model 230300
Centrifuge DuPont Corporation  Model sorvall TC6
shaker  Lab-line Instruments Model 314-820 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
  3. Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
  4. Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
  5. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  6. Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
  7. Wee, S., Gombotz, W. R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
  8. Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
  9. Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
  10. Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
  11. Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
  12. Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
  13. Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
  14. Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
  15. Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
  16. Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
  17. Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).

Tags

الطب، العدد 108، ثقافة ثلاثي الأبعاد، وأورام الغدة النخامية، والثقافة الخلية الأولية، والخرز الجينات، neuroendocrinology
ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Avila-Rodríguez, D.,… More

Avila-Rodríguez, D., Paisano-Cerón, K., Valdovinos- Ramírez, I., Solano-Agama, C., Ortiz-Plata, A., Mendoza-Garrido, M. E. Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells. J. Vis. Exp. (108), e53637, doi:10.3791/53637 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter