Abstract
三次元培養法が記載されている主要な下垂体腺腫細胞をアルギネートビーズ中で増殖させます。アルギン酸塩は茶色の海藻由来ポリマーです。簡潔には、腫瘍組織を小片に切断し、コラゲナーゼ及びトリプシンで酵素消化に供します。次に、細胞懸濁液を得ました。腫瘍細胞懸濁液を1.2％アルギン酸ナトリウムと混合し、 塩化カルシウム溶液に滴下し、そしてアルギネート/細胞懸濁液を球状ビーズを形成するためのCaCl 2と接触してゲル化されます。アルギン酸ビーズに埋め込まれた細胞を、20％FBSを富化培地によって提供栄養分が供給されます。アルギン酸ビーズ内の三次元培養物は、4ヶ月まで、長期間腺腫細胞の生存率を維持します。また、細胞は、クエン酸ナトリウムでビーズを洗浄することにより、アルギン酸塩から遊離し、さらに免疫細胞化学的分析のためにカバーガラス上に播種することができます。 CELの使用リットル培養モデルは、最小限の解体とアクチン細胞骨格の固定と可視化を可能にします。要するに、アルギン酸ビーズは、下垂体腺腫細胞の維持のための信頼できる培養系を提供します。
Introduction
それらは、培養細胞および細胞-細胞コミュニケーション1の維持のための三次元構造的支持を提供するための三次元足場は、広範囲の細胞培養に使用されてきました。天然由来のポリマー材料は、I型コラーゲン、キトサンおよびアルギン酸塩を含む三次元の足場を作るために使用されています。アルギン酸塩は、褐色海藻Macrocystispyrifera（昆布）に由来する天然高分子です。このポリマーは、β-D-マンヌロン酸（M）及びα-L-グルロン酸（G）は、カルシウム及びバリウムのような特定の二価カチオンの存在下で、2及びフォーム安定なゲルの反復単位で構成されています。 塩化カルシウム（CaCl 2）溶液は、一般的にアルギン酸ビーズを形成するために、架橋試薬として使用されます。アルギン酸ソリューションは、すぐに3次元球状ゲルを形成するのCaCl 2に低下しました。アルギン酸塩溶液を細胞と混合されると、細胞は、アルギネートBに封入されていますEADS 3。
アルギン酸塩は、軟骨4を含む細胞、骨格筋芽細胞5及び神経幹細胞6の種々のカプセル化のためのマトリックスとして使用することを可能にしている特性を有します。これは、不活性材料であり、栄養素、酸素及び細胞の生存および機能を維持する代謝産物の拡散を可能にします。また、他のゲルベースの培養系とは異なり、アルギン酸ビーズ内の培養細胞は、例えば、クエン酸ナトリウムなどのカルシウムキレート化剤を使用して、骨格から遊離することができ、次いで細胞をさらに調査7のために回収することができます。
下垂体腺腫は、典型的には、低増殖速度と良性腫瘍です。ラット下垂体腺腫細胞系は、二次元系8で正常培養しました。しかし、分泌ヒト下垂体細胞腫瘍のこの文化は、効率的な開発ではありません。分散した腫瘍下垂体細胞は成長が悪いです培養において、細胞は、制限された付着および拡散を示し、細胞は、典型的には、培養皿9,10浮遊凝集体を形成します。
いくつかの試みは、酵素的、機械的分散手法11、単に機械的分散法12と腫瘍外植片10の培養を含む、腫瘍、下垂体細胞懸濁液を得るために行われています。これらのアプローチでは、別の著者は、異なる期間のために実行可能な接着培養を得ました。これらの2次元系で生き残るために腫瘍分泌細胞の能力は、腫瘍の種類とそれらの増殖率9に依存します。しかし、長期培養において、線維芽細胞の表現型を有する細胞が11,13が優勢 。本論文では、さらに以下の詳細な分析を可能にアルギン酸足場からそれらを遊離アルギン酸ビーズ中にカプセル化された下垂体腺腫細胞からの初代培養を得るための方法を説明しその細胞生物学、 例えば 、それらの細胞骨格の配置の側面。
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Protocol
この研究は、医療機関と国立工科大学の研究アドバンス研究センターの地域の倫理委員会によるヒト材料の使用が承認されました。
1.腫瘍サンプル取得
- トランス蝶形骨の外科処置14を介して患者から下垂体腺腫の組織生検を取得します。
- 下垂体腺腫サンプルを採取し、新鮮な10％ウシ胎児血清（FBS）で富化199培地（M199）、0.6 mg / mlで、炭酸水素ナトリウム、2.4 mg / mlでHEPESおよび1％の50 mlを含む滅菌ガラス瓶に置きpH7.4での抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）。氷の上のガラス瓶にサンプルを維持します。
注：腫瘍組織は、手術後数時間を処理することができます。 - 氷の上のガラス瓶で研究室に腫瘍サンプルを輸送します。
酵素組織解離ソリューションの調製、トリプシン阻害剤溶液とアルギン酸ソリューション
注：前の細胞培養プロシージャに次の溶液を調製します。使用前に、0.22μmのメンブレンフィルターを使用して、すべてのソリューションをフィルタリングします。
- M199-無血清5mlにコラゲナーゼ（タイプI）5mgを溶解させることによりコラゲナーゼ1％溶液を準備します。
- PBS-EDTA、0.3％の10mlのトリプシン0.01グラムに溶解することによりトリプシン0.01％の溶液を調製します。
- M199-無血清20mlに大豆トリプシンインヒビターの2ミリグラムを溶解し、0.1％トリプシン阻害剤溶液を準備します。
- トリプシン阻害剤溶液の4ミリリットルでのDNAse I 134 U / mlの20μlのを溶解することによりDNase溶液を準備します。
- 155 mMのNaClを40ミリリットルにEGTAの22.8ミリグラムを溶解することによりEGTA溶液（1.2 M）を準備します。 pHを7.4に調整します。 50ミリリットルの最終容量に進みます。
- 155 mMのNaClを50ミリリットルで238ミリグラムのHEPESを溶解させることによってHEPES溶液（20 mm）を準備します。
- 1.2を溶解して1.2％のアルギン酸塩溶液を調製しますHEPES溶液100mlのGアルギン酸ナトリウム。アルギン酸塩溶液をオートクレーブ。
- pHを7.4に調整する50mlのHEPES溶液中のCaCl 2の750ミリグラムを溶解させることによってカルシウム溶液（102ミリモル）を準備
3.初代細胞培養およびアルギン酸塩カプセル化
- クリーンベンチ内部には、約20ミリリットルを含まないPBSのCa 2+およびMg 2+、pH7.4の（PBS *）のを含む35ミリメートルペトリ皿に腫瘍組織を置きます。
- 手術用ピンセットで組織を取り、新鮮なPBS *を含む別のペトリ皿に置き、静かに組織を洗います。赤血球および破片が削除されるまで、この手順を繰り返します。
- 手術用ピンセットを使用して、下垂体腺腫の組織を保持し、小さな手術用ハサミで小片にそれをカット。丸みを帯びたエッジをパスツールピペットを用いて、RTで10分間68×gで、15mlチューブに遠心分離した組織フラグメントおよびPBS *を転送します。
注：パスツールのエッジを丸くするにはピペットは、わずかにブンゼンバーナーでピペットの先端を火炎。 - パスツールピペットを使用して、* PBSを削除し、コラゲナーゼ溶液（組織の65ミリメートル3に対して約5ミリリットル）3〜5mlのを追加し、反転させて2〜3回混ぜます。一定の回転で37℃で30分間コラゲナーゼで組織をインキュベートします。
- RTで10分間、68×gでチューブを遠心し、パスツールピペットでコラゲナーゼを削除します。
- DNアーゼの5ミリリットルを追加し、反転させることにより2〜3回混ぜ、次いで、室温で10分間68×gでチューブを遠心します。
注：組織が完全に解離していない場合は、37℃で3分間トリプシンで第二の酵素消化を行います。トリプシン阻害剤溶液の2倍量の添加によって消化を停止します。 - パスツールピペットで上清を吸引し、廃棄します。 EGTA溶液の1体積でペレットを再懸濁し、アルギン酸塩溶液の2倍量と混合。
- 静かに細胞懸濁液とアルギン酸塩を混ぜますパスツールピペットでピペッティングすることもできます。 21 G針で無菌注射器を取り、プランジャーを削除します。アルギン酸塩および細胞溶液で注射器をロードするためにピペットを使用しています。
- ゆっくりシリンジにプランジャーを挿入し、慎重に約30ミリリットルのカルシウムが豊富なソリューションのを含有するガラスビーカーにアルギン酸細胞液滴ずつを分注します。
- 約5cmまでのCaCl 2溶液に注射器の針を置きます。球状のビーズを形成するためのCaCl 2と接触するアルギネート細胞懸濁液ゲル。 5分間カルシウム溶液中にアルギン酸ビーズを保管してください。
注：ビーズがドロップされたガラスビーカーをかき混ぜます。互いに付着するのを防ぐために、円を描くように手でゆっくりと移動します。 - 慎重にパスツールピペットでカルシウム溶液を除去し、FBSの20％で強化されたM199 3〜5ミリリットルで二回ビーズを洗浄します。
- 定期的なT25組織培養にアルギン酸ビーズを転送無菌スパチュラを用いてフラスコを5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でM199 4-5ミリリットル、20％FBSで富化インキュベート加えます。二日おきに培地を変更します。
4.アルギン酸からの細胞を解放します
注：前のアルギン酸ビーズから細胞を遊離するために、ポリ-D-リジンでコート直径13mmのカバースリップを。
注意：SULPHURIC ACIDは、腐食性の高い酸であり、APTSは目と皮膚への炎症を引き起こす可能性があります。これらの試薬を処理するためにゴム手袋を使用しています。
- 、ドラフト内でポイントピンセットを用いて室温で1時間、20％の硫酸水溶液を含むガラスペトリ皿にカバースリップを浸します。
- 硫酸をデカントし、5分毎に、蒸留水でカバーガラスを5回洗浄します。ポイントピンセット場所RT 15で5分間、0.1MのNaOHを含むペトリ皿の中のきれいなカバーグラスを使用。
- NaOHをデカントし、蒸留で1回洗います水を吸引し、カバースリップを乾燥、水を導きました。
- 4分間のAPTS（アミノプロピルトリエトキシシラン）で被覆するためにカバーグラスをマイクロピペットを使用して蒸留水でペトリ皿をフラッディング（6カバースリップのための500μLを使用します）。すばやく水を吸引し、水が下に浸透することを可能にする点ピンセットでカバースリップを移動し、蒸留水で洗浄し続けています。
- 水を吸引し、カバースリップを乾燥、清潔なペトリ皿にカバースリップをポイントピンセットの場所を使用し、3回、45秒のそれぞれの間にマイクロ波の内側にそれらを滅菌します。ポリ-D-リジン（0.1 mg / mlで）を100μgに滅菌水1000μLを加えます。
- 室温で5分間、ポリ-D-リジンの約50μlのカバースリップをインキュベートします。完全にポリ-D-リジンを吸引します。
注：培地中の可溶性ポリ-D-リシンが細胞増殖を阻害することができるので、これは重要です。 - 5分ごとにカバースリップを滅菌水で5回洗浄します。目を吸引erile水とカバースリップは、クリーンベンチ内部に乾燥させます。
- アクチン細胞骨格を分析するために、アルギン酸塩から下垂体細胞を遊離させます。 1ミリリットルピペットチップを用いて培養フラスコからアルギン酸ビーズの一部を取り、15mlチューブに入れます。
- 55 mMクエン酸ナトリウムの5 mlを加え、室温で10分間、68×gで遠心分離（323.6のNa 3 C 6 H 5 O 7 mgの、2 H 2 O 20 mLのHEPES溶液を溶解します）。上清を吸引し、廃棄します。
- 20％FSBで富化暖かいM199の1ミリリットル中にペレットを再懸濁;静かにパスツールピペットで細胞懸濁液を混ぜます。
注意：ファロイジンおよびDAPIは有毒です。これらの試薬を扱うために手袋を使用します。 - 細胞をカウントし、1.5ミリリットルチューブに0.4％トリパンブルー溶液の125μlのを転送します。 M19975μlのと最後のステップ（希釈係数= 5）で得られた50μlの細胞懸濁液を追加します。完全に混合。
- PLACするためにマイクロピペットチップを使用します血球計数器チャンバー内のトリパンブルー細胞懸濁液の電子約10μlの。
- 位相コントラスト照明付き倒立顕微鏡を用いて、血球計数器カウンターで細胞をカウントします。 1ミリメートルの中央広場、4 1ミリメートル角の正方形のすべてのセルを数えます。希釈係数により平方あたりの平均数を乗算してミリリットル当たりの細胞密度を得る- 。10 4、例えば平方あたりの平均数は45セル×5×104 = 2.25×10 6細胞/ mlである場合。
注：血球計数器室の10乗で細胞をカウントします。下と右の両側に中央の線に触れて細胞をカウントしないでください。 - ポリ-D-リジンで被覆された直径13mmのカバーガラス上で35,000細胞をシード。
5.アクチン細胞骨格のアレンジメント
- 培養48時間後、パスツールピペットで培地を除去し、素早くPBSのカバースリップあたり500μlを添加、直ちにPBSを削除します。
- トンを修正し、透過処理37℃で10分間固定緩衝液（0.1M PIPES、pHが6.75、4％PEG-6000、1mMのEGTA、1mMの硫酸マグネシウム、0.5％トリトンX-100および2％ホルムアルデヒド）のカバースリップあたり500μlの彼の細胞C言語
- 固定バッファを削除し、RTで30分間、PBS中の3.5％パラホルムアルデヒドのカバースリップあたり500μlを添加します。パラホルムアルデヒド溶液を除去します。
- 5分ごとに、PBSのカバースリップあたり500μLを添加することにより、カバーグラスを3回洗浄します。一定の撹拌で、室温でカバースリップを洗い流します。
- 、10分間、50mMの塩化アンモニウムで細胞をインキュベート塩化アンモニウム溶液を吸引し、ステップ5.4を繰り返します。
- 、30分間、PBS中の1％BSA（IgGのフリー、プロテアーゼフリー）で細胞をインキュベートし、BSA溶液を除去し、ステップ5.4を繰り返します。
- RT、リピートステップ5.4で7分間、ローダミン結合ファロイジンの50μMで細胞をインキュベートします。
- RT、リピートステップ5.4で5分間、PBSで希釈したDAPIの255μMで細胞をインキュベートします。最後にトンをマウント彼は、封入剤でカバースリップし、マニキュアでそれらを封印。
- 541 nmの励起波長で63X対物レンズを用いて共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、アクチン細胞骨格の構成の画像を取得します。
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Representative Results
このプロトコルは、異なる期間のためアルギン酸ビーズに腺腫下垂体細胞の培養および維持に正常に適用された3ヶ月後、アルギン酸ビーズ中の細胞を埋め込 ま1に示す図 。これらの細胞は、倒立光学顕微鏡（ 図1）の下で、双屈折丸みを帯びた形状を示す。 図2は、アルギン酸塩に埋め込 まれたラット下垂体腺腫細胞におけるN-カドヘリンの局在を示します。 N-カドヘリンは、細胞-細胞接触（ 図2A および 2C）に局在し、核は（ 図2B および 2C）拡張クロマチンを示しました。
アルギン酸ビーズ中の腫瘍細胞は、培養中の最大4ヶ月間生存し続けます。従って、細胞は、さまざまな側面の分析を可能にする、異なる時間にアルギン酸ビーズから遊離させることができます同じ細胞培養物中の細胞生物学。例えば、増殖指数は、のKi-67のための免疫反応性を用いて、10非機能性のヒト下垂体腺腫から得られ、19.2±1.5％の平均標識率は、（平均±SEM）を得た。 図3は図ヒト下垂体を培養しましたKi-67に対して免疫染色腺腫細胞。
非侵襲性の細胞のアクチン細胞骨格は、上述の免疫細胞化学プロトコルに従って染色しました。培養細胞は、小さなアクチンストレスファイバー（ 図4A）培養システムの独立した下垂体腺腫と変化させ選択図形態とアクチンフィラメントの手配を備えた細長い形状を示しました。例えば、非機能侵襲性腺腫で、これらの細胞の中で支配的な形状は、不連続皮質リングにおけるそれらのアクチンフィラメントの配置で四捨五入しました。 （ 図4B）。
図1. 3ヶ月間のアルギン酸ビーズに埋め込 まれた細胞。細胞は、倒立光学顕微鏡下で双屈折丸みを帯びた形状を呈します。右側のパネルで、アルギン酸塩に埋め込ま侵襲巨大腺腫細胞が示されており、左側のパネルで、非侵襲的巨大腺腫細胞が示されています。スケールバー=15μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アルギン酸ビーズ中のラット下垂体腺腫細胞におけるN-カドヘリン（GH3）文化の図2.免疫細胞化学的分析。GH3細胞は、アルギン酸中で培養した、N-カドヘリン（赤）について染色したアルギン酸塩システムに埋め込 まれて固定され、核（青）。細胞は絶頂に配置されていますウルスは、細胞間の境界線（AとC）でN-カドヘリンを示します。核は、（B及びC）拡張クロマチンで示されています。スケールバー=15μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
核抗原のKI-67の図3.免疫染色培養したヒト下垂体腺腫細胞。アルギン酸ビーズ培養における2.5ヶ月後、侵襲性の非機能性腺腫の細胞を固定し、その後のKi-67（レッド）と核（青）のために免疫染色しました。いくつかの腺腫細胞はのKi-67のための免疫染色陽性を示しました。スケールバー=15μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図アルギン酸ビーズから遊離した下垂体腺腫細胞の4アクチン細胞骨格の手配 。細胞はTRITCファロイジンでのアクチンフィラメントのために固定し、染色しました。非侵襲性の巨大腺腫からの細胞は、小さなアクチンストレス繊維（A）を示し 、基板上に延長しました。侵襲性の巨大腺腫からの細胞は、不連続アクチンリング（B）と丸みを帯びた形状を示しました。スケールバー=15μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初は、細胞培養のすべての中の栄養素とガスの拡散の同じ条件を維持するために必要とされるビーズサイズの均一性です。我々の経験では、アルギン酸ビーズを作るために21 G針の使用は、均一なビーズサイズの効率的な文化の取得を可能にします。第二の重要な要素は、針からの距離です。この距離は、カルシウム溶液の表面にアルギン酸塩/細胞溶液の流れの衝突による変形真珠や死細胞を回避するために、カルシウム溶液からわずか5センチメートルでなければなりません。第三の重要なステップは、ビーズが互いに付着するのを防止するために廃棄されるガラス撹拌あります。不均一な細胞カプセル化に結果を貼り付けます。
このプロトコルにいくつかの変更は、当社の経験では、例えば、研究の質問に依存wを混合することができるアルギン酸ナトリウムの溶液を行うことができますIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質番目、および前述のプロトコルに従って、三次元アルギネート足場を得ます。別の可能性は、直径15mmのウェル中に浮遊アルギン酸クッションを作ることです。これらのゲルの内部に、細胞は、上またはその中に播種することができます。任意の特定の実験が自分のCa 2+又はMg 2+濃度での修正が必要な場合は、アルギン酸塩での作業時のトラブルシューティングが必要である可能性があります。ヒドロゲルの安定性を変化させることができるからです。 Ba 2+ -andのCu 2+ -crosslinkedアルギン酸塩ゲルは、水溶液中で比較的安定している、残念ながら、これらの陽イオンはしばしば3細胞毒性です。
このような下垂体腺腫の組織としての腫瘍組織で作業する場合、この技術の一つの制限は設けられた小組織サンプルです。したがって、得られたアルギン酸ビーズの数は、組織試料の大きさに依存します。
以前は、システムへの三次元培養における下垂体腺腫細胞を維持することは記載されています。著者らは、凝集体を形成するために揺れ旋回する細胞を提出し、異なる期間16については、この状態で細胞を維持しました。この細胞懸濁培養の使用は、培養室内の旋回装置を必要とします。ここで説明されたプロトコルの1つの利点は、余分な実験装置を必要とせずに三次元系での細胞の培養を可能にすることです。 3次元アルギン酸システムに埋め込まれた細胞は、通常のフラスコ内の正規のインキュベーター中で維持されています。別の利点は、アルギネート足場は、他の三次元のシステムとは対照的に、細胞は、さらなる調査のために7ヒドロゲルから放出されることを可能にすることです。また、アルギン酸ビーズ中で細胞を培養することの重要な側面は、このシステムに埋め込 まれた細胞は、 新規細胞外マトリックスをsynthetizeすることができることです。代替案アルギネートに埋め込 まれた細胞の研究のための方法は、後続の切片および免疫組織化学17を分析するためのポリエチレングリコールの濃度を増加させて、その脱水したアルギン酸ビーズの固定です。
我々は、3次元環境でのそれらの相互作用を分析するために、また、下垂体腺腫の文化の他のタイプに埋め込まれた初代培養正常な下垂体ラット細胞に3次元アルギン酸ビーズシステムを適用することは、将来に興味を持っています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R.
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
