Abstract
Een driedimensionale kweekmethode beschreven waarbij primaire hypofyseadenoom cellen worden gekweekt in alginaatkorrels. Alginaat is een polymeer afgeleid uit bruine zeealgen. In het kort wordt het tumorweefsel in kleine stukjes gesneden en met collagenase en trypsine aan een enzymatische digestie ingediend. Vervolgens wordt een celsuspensie verkregen. De tumor celsuspensie wordt gemengd met 1,2% natriumalginaat en vallen in een CaCl2-oplossing, en de alginaat / cel suspensie wordt gegeleerd in contact met de CaCl 2 bolvormige korrels te vormen. De cellen ingebed in de alginaatkorrels voedingsstoffen aangeleverd door het kweekmedium aangevuld met 20% FBS. Driedimensionale kweek in alginaatkorrels de levensvatbaarheid van adenoom cellen voor langere tijd, tot vier maanden. Bovendien kunnen de cellen worden vrijgemaakt uit het alginaat door wassen van de bolletjes met natriumcitraat en gezaaid op glazen dekglaasjes voor verdere immunocytochemische analyse. Het gebruik van een cell cultuurmodel maakt de fixatie en visualisatie van het actine cytoskelet met minimale ontwrichting. Samengevat, alginaatkorrels een betrouwbare kweeksysteem voor het handhaven van hypofyseadenoom cellen.
Introduction
Driedimensionale steigers zijn uitgebreid gebruikt in celkweek omdat ze een driedimensionale structurele steun voor celcultuur en het onderhoud van cel-tot-cel communicatie 1. Natuurlijk verkregen polymere materialen zijn gebruikt om driedimensionale scaffolds inbegrip van type I collageen, chitosan en alginaat maken. Alginaat is een natuurlijk polymeer afkomstig van de bruine zeealgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dit polymeer bestaat uit herhaalde eenheden van β-D-mannuronzuur (M) en α-L-guluronzuur (G) 2 en vormt stabiele gels in de aanwezigheid van bepaalde divalente kationen, zoals calcium en barium. Calciumchloride (CaCl2) oplossingen worden vaak gebruikt als de crosslinking reagens alginaatkorrels vormen. Alginaat oplossingen liet zich in CaCl2 onmiddellijk vormen driedimensionale bolvormige gels. Wanneer de alginaat oplossing gemengd met cellen, worden de cellen ingekapseld in de alginaat beads 3.
Alginaat eigenschappen die het had kunnen worden gebruikt als matrix voor het inkapselen van verschillende cellen, waaronder chondrocyten 4, skeletmyoblasten 5 en 6 neurale stamcellen. Het is een inert materiaal en maakt de diffusie van voedingsstoffen, zuurstof en stofwisselingsproducten die cel overleving en functie te behouden; Bovendien, in tegenstelling tot andere op gel gebaseerde kweeksystemen, cellen gekweekt in alginaat kralen kunnen ook worden vrijgemaakt uit het skelet via calciumvangers, zoals natriumcitraat, en de cellen kunnen vervolgens voor verder onderzoek 7 worden geoogst.
Hypofyseadenomen zijn meestal goedaardige tumoren met een lage proliferatie tarieven. Rat hypofyse adenoma cellijnen met succes gekweekt in een tweedimensionaal systeem 8 is. Echter, deze cultuur secretoire humane hypofyse celtumoren geen efficiënte ontwikkeling; verspreide tumor hypofyse cellen groeien slechtin kweek werden de cellen vertonen beperkte hechting en spreiding en de cellen vormen typisch drijven aggregaten in de kweekschaal 9,10.
Verschillende pogingen zijn gedaan om een tumor hypofyse celsuspensie te verkrijgen, zoals een enzymatische en mechanische dispersie benadering 11, een uitsluitend mechanische dispersie benadering 12 en het kweken van tumor explantaten 10. Met deze benaderingen hebben verschillende auteurs levensvatbare adherente kweken verkregen voor verschillende tijdsperioden. De capaciteit van de tumor secretoire cellen overleven in deze tweedimensionale systemen zijn afhankelijk van het tumortype en de proliferatiesnelheden 9. In langdurige kweken, cellen van fibroblast fenotypes overheersen 11,13. Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het verkrijgen van een primaire kweek van hypofyseadenoom cellen ingekapseld in alginaatkorrels dat ze verder vrijmaakt uit het alginaat scaffold uitvoerige analyses steltaspecten van de celbiologie, bijvoorbeeld hun cytoskelet regelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd voor het gebruik van menselijk materiaal door de lokale ethische commissies van de medische instelling en het Centrum voor Onderzoek en Advance Studies van het Nationaal Polytechnisch Instituut.
1. Tumor Sample Acquisition
- Het verkrijgen van de hypofyseadenoom weefsel biopsie van een patiënt door middel van een trans-sphenoidal chirurgische ingreep 14.
- Verzamel de hypofyseadenoom monster af en breng het in een steriele glazen fles met 50 ml vers 199 kweekmedium (M199) verrijkt met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,6 mg / ml natriumbicarbonaat, 2,4 mg / ml HEPES en 1% antibiotica (penicilline / streptomycine) bij pH 7,4. Handhaving van het monster in een glazen fles op het ijs.
Opmerking: De tumorweefsel kan meerdere uren worden verwerkt na de operatie. - Vervoer de tumor monster naar het laboratorium in de glazen fles op ijs.
2. Bereiding van de enzymatische Tissue Dissociatie Solutions,Trypsineremmer Solution en Alginate Solutions
Opmerking: Voorafgaand aan de celkweek procedure bereid de volgende oplossingen. Filtreer alle oplossingen met een 0,22 urn membraanfilter, vóór gebruik.
- Bereid collagenase 1% oplossing door het oplossen van 5 mg collagenase (type I) in 5 ml M199-serumvrij.
- Bereid 0,01% trypsine-oplossing door het oplossen van 0,01 g trypsine in 10 ml PBS-EDTA 0,3%.
- Bereid 0,1% trypsineremmer oplossing door het oplossen van 2 mg soja trypsineremmer in 20 ml M199-serumvrij.
- Bereid DNAse-oplossing door oplossen van 20 ui DNAse I 134 U / ml in 4 ml trypsineremmer oplossing.
- Bereid EGTA-oplossing (1,2 M) door het oplossen van 22,8 mg EGTA in 40 ml 155 mM NaCl. Breng de pH op 7,4. Verder tot een eindvolume van 50 ml.
- Bereid HEPES-oplossing (20 mM) door het oplossen van 238 mg in 50 ml HEPES van 155 mM NaCl.
- Bereid 1,2% alginaatoplossing door het oplossen van 1,2g natriumalginaat in 100 ml HEPES oplossing. Autoclaaf de alginaatoplossing.
- Bereid calcium oplossing (102 mM) door het oplossen van 750 mg CaCl2 in 50 ml HEPES-oplossing, pH instellen op 7,4
3. Primaire Cell Cultuur en alginaat inkapseling
- Binnen een laminaire stroming kast, plaatst het tumorweefsel in een 35 mm petrischaal met ongeveer 20 ml PBS Ca 2+ en Mg 2+ gratis, pH 7,4 (PBS *).
- Neem het weefsel met een chirurgische pincet en plaats het in een andere petrischaaltje met verse PBS * voorzichtig het weefsel te wassen. Herhaal deze stap totdat de rode bloedcellen en vuil verwijderd.
- Met behulp van een chirurgische pincet, houdt u de hypofyseadenoom weefsel, en met een kleine chirurgische schaar, snijd deze in kleine stukjes. Met een Pasteur pipet met afgeronde hoeken, overdragen weefselfragmenten en PBS * in een 15 ml buis Centrifugeer bij 68 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Om de randen van een Pasteur rondenpipet, licht vlam de punt van de pipet in een bunsenbrander. - Verwijder de PBS * Met een Pasteur-pipet en voeg 3-5 ml collagenase oplossing (ongeveer 5 ml van 65 mm3 weefsel), meng 2-3 keer door omkeren. Incubeer het weefsel in de collagenase gedurende 30 minuten bij 37 ° C in constante rotatie.
- Centrifugeer de buis bij 68 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en verwijder de collagenase met een Pasteur pipet.
- Voeg 5 ml DNAse en meng 2-3 keer door het omkeren en centrifugeer de buis bij 68 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Als het weefsel niet volledig gedissocieerd uitvoeren van een tweede enzymatische digestie met trypsine gedurende 3 min bij 37 ° C. Stop de digestie door toevoeging van 2 volumina trypsineremmer oplossing. - Zuig het supernatant met een Pasteur pipet en gooi ze weg. Resuspendeer de pellet in 1 volume EGTA-oplossing en mengen met 2 volumes alginaatoplossing.
- Meng de celsuspensie en alginaatpipetteren met een pasteurpipet. Neem een steriele spuit met een 21 G naald, verwijder de plunjer; Gebruik een pipet om de spuit met het alginaat en celoplossing laden.
- Duw de plunjer in de spuit en zorgvuldig afzien het alginaat-celoplossing druppel voor druppel in een bekerglas met ca. 30 ml van de calcium-rijke oplossing.
- Plaats de naald van de spuit ongeveer 5 cm tot de CaCl 2-oplossing. De alginaat-celsuspensie gels bij contact met de CaCl 2 bolvormige korrels te vormen. Houd de alginaatkorrels in de calciumoplossing gedurende 5 min.
Let op: Roer het bekerglas waarin de korrels worden gedropt. Beweeg het langzaam met de hand in cirkelvormige bewegingen, om te voorkomen dat ze vasthouden aan elkaar. - Verwijder voorzichtig de calcium-oplossing met een Pasteur pipet, en was de kralen tweemaal met 3-5 ml M199 verrijkt met 20% FBS.
- Breng de alginaat kralen in een gewone T25 weefselkweekkolf met een steriele spatel, voeg 4-5 ml M199 aangevuld met 20% FBS en geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Verander het kweekmedium elke derde dag.
4. Bevrijd Cellen van het alginaat
Opmerking: Alvorens de cellen te bevrijden van de alginaatkorrels, laag 13 mm dekglaasjes met poly-D-lysine.
LET OP: Zwavelzuur is een sterk bijtend zuur en APTS KAN OGEN EN HUID. GEBRUIK latexhandschoenen om deze reagentia te behandelen.
- In een zuurkast met een punt pincet onderdompelen de dekglaasjes in een glazen petrischaaltje met 20% waterig zwavelzuur gedurende 1 uur bij KT.
- Giet het zwavelzuur en spoel de dekglaasjes vijfmaal met gedestilleerd water gedurende 5 minuten elk. Met een punt pincet plaats de schone dekglaasjes in een petrischaaltje met 0,1 M NaOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 15.
- Giet het NaOH en was één keer met Distilgeleid water, zuigen het water en droog de dekglaasjes.
- Met een micropipet het bekleden van de dekglaasjes met APTS (aminopropyltriethoxysilaan) gedurende 4 minuten (gebruik 500 ul voor 6 dekglaasjes) overspoelen de petrischaal met gedestilleerd water. Snel zuigen het water en blijven wassen met gedestilleerd water, het verplaatsen van de dekglaasjes punt pincet om het water naar beneden te dringen.
- Zuig het water en droog de dekglaasjes, met behulp van een punt pincet plaats de dekglaasjes in een schone petrischaal en steriliseer ze in de magnetron gedurende 3 keer, 45 seconden per stuk. Voeg 1.000 III steriel water tot 100 ug poly-D-lysine (0,1 mg / ml).
- Incubeer de dekglaasjes met ongeveer 50 pl poly-D-lysine gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het poly-D-lysine volledig.
Opmerking: Dit is belangrijk omdat oplosbaar poly-D-lysine in het cultuurmedium celproliferatie kunnen remmen. - Spoel de dekglaasjes vijf keer met steriel water gedurende 5 minuten elk. Zuig het sterile water en laat de dekglaasjes te drogen in een laminaire stroming kast.
- Om het actine cytoskelet te analyseren, te bevrijden van de hypofyse cellen van het alginaat. Neemt een deel van de alginaatparels van de kolf met een 1 ml pipet en plaats ze in een 15 ml buis.
- Voeg 5 ml 55 mM natriumcitraat (los 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O in 20 ml HEPES-oplossing) en gecentrifugeerd bij 68 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en gooi.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml warm M199 verrijkt met 20% FSB; meng de celsuspensie met een Pasteur pipet.
LET OP: Phalloidin EN DAPI ZIJN giftig. GEBRUIK handschoenen om deze reagentia te behandelen. - Om de cellen te tellen, overdracht 125 ul van 0,4% trypan blauwe oplossing met een 1,5 ml buis. Voeg 75 gl M199 en 50 pi van de celsuspensie verkregen in de laatste stap (verdunningsfactor = 5). Meng goed.
- Gebruik een micropipet tip om place ongeveer 10 gl van de trypan blauw-celsuspensie in de hemocytometer kamer.
- Tel de cellen in de hemocytometer teller met behulp van een omgekeerde microscoop met een fasecontrastmicroscoop. Tel alle cellen in de 1 mm centrum plein en vier 1 mm hoek pleinen. Verkrijgen van de celdichtheid per milliliter met het gemiddelde aantal per vierkante vermenigvuldigen met de verdunningsfactor -. 10 4 Bijvoorbeeld als de gemiddelde tellingen per vierkante cellen is 45 x 5 x 104 = 2,25 x 106 cellen / ml.
Let op: Tel de cellen in tien pleinen van de hemocytometer kamer. Weet cellen raken de middelste lijn onderaan en rechts niet mee. - Zaad 35.000 cellen op 13 mm diameter glazen dekglaasjes bedekt met poly-D-lysine.
5. actine cytoskelet Arrangement
- Na 48 uur in de cultuur, verwijder het kweekmedium met een Pasteur pipet en snel toe te voegen 500 ul per dekglaasje van PBS, onmiddellijk verwijderen van de PBS.
- Fix en permeabilize thij cellen met 500 ul per dekglaasje van fixatie buffer (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 0,5% Triton X-100 en 2% formaldehyd) gedurende 10 min bij 37 ° C
- Verwijder de fixatie buffer en voeg 500 ul per dekglaasje van 3,5% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de paraformaldehyde oplossing.
- Was de dekglaasjes driemaal door toevoeging van 500 ul per dekglaasje van PBS gedurende 5 minuten elk. Spoel de dekglaasjes bij kamertemperatuur, voortdurend roeren.
- Incubeer de cellen met 50 mM ammoniumchloride gedurende 10 min, zuigen de ammoniumchlorideoplossing en herhaal stap 5,4.
- Incubeer de cellen met 1% BSA (IgG-vrij, proteases-vrij) in PBS gedurende 30 minuten, verwijder de BSA-oplossing en herhaal stap 5,4.
- Incubeer de cellen met 50 uM rhodamine geconjugeerde phalloidin gedurende 7 min bij RT, herhaalt u stap 5.4.
- Incubeer de cellen met 255 uM DAPI verdund in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur Herhaal stap 5,4. Tot slot zet thij coverslips met een montage medium en verzegelen ze met nagellak.
- Acquire beelden van het actine cytoskelet regeling met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 63x doelstelling, bij 541 nm excitatie golflengte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol werd met succes in de cultuur en het onderhoud van adenoom hypofysecellen in alginaatkorrels voor verschillende tijdsperioden toegepaste Figuur 1 toont cellen ingebed in alginaatkorrels na drie maanden.; deze cellen vertonen bi brekingsindex afgeronde vormen onder een omgekeerde lichtmicroscoop (figuur 1). Figuur 2 toont de lokalisatie van N-cadherine in ratten hypofyse adenoma cellen ingebed in alginaat. De N-cadherine is gelokaliseerd bij cel-cel contacten (Figuur 2A en 2C) en de kern bleek de chromatine verlengd (figuur 2B en 2C).
Tumorcellen in alginaatkorrels blijven nog gedurende maximaal 4 maanden in kweek; derhalve kunnen de cellen worden vrijgemaakt uit de alginaatkorrels op verschillende tijdstippen, waardoor voor de analyse van verschillende aspecten van decelbiologie in dezelfde celkweek. Zo werd de proliferatie-index verkregen uit tien niet-functionerende humane hypofyse adenomen met de immuun-reactiviteit voor Ki-67, en een gemiddelde etikettering index van 19,2 ± 1,5% (gemiddelde ± SEM) werd verkregen. Figuur 3 toont gekweekte menselijke hypofyse adenoom cellen immunostained voor Ki-67.
De actine cytoskeletons van cellen van een niet-invasieve werden gekleurd volgens de immunocytochemische protocol hierboven beschreven. Kweekcellen tentoongesteld langgerekte vormen met kleine actine stress-vezels (Figuur 4A) .De morfologie en actine filament afspraken gevarieerd met de hypofyseadenoom onafhankelijk van het cultuur-systeem; bijvoorbeeld in een niet-werkende invasief adenoom, de overheersende vorm tussen deze cellen werd afgerond met een rangschikking van de actine filamenten in discontinue corticale ringen. (Figuur 4B).
Figuur 1. Cellen ingebed in alginaatkorrels gedurende 3 maanden. Cellen vertonen bi brekingsindex afgeronde vormen onder een omgekeerde lichtmicroscoop. In het rechter paneel invasieve macro- adenoom cellen ingebed in alginaat worden weergegeven, en in het linkerpaneel non-invasieve macro- adenoom cellen worden getoond. Schaal bar = 15 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Immuno- cytochemische analyse van N-cadherine in Rat hypofyseadenoom cellen (GH3) cultuur in alginaatkorrels. GH3-cellen werden gekweekt in alginaat, vast verankerd in het alginaat systeem gekleurd voor N-cadherine (rood) en de kern (blauwe ). De cellen zijn te regelen in een cumulus geeft N-cadherine op de cel-cel grenzen (A en C). De kern (B en C) zijn met de chromatine verlengd. Schaal bar = 15 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Immunokleuring nucleair antigeen Ki-67 gekweekte menselijke hypofyse adenoma cellen. Na 2,5 maanden alginaat kraal cultuur invasieve niet-functionerende adenoom cellen werden gefixeerd en immunologisch gekleurd voor Ki-67 (rood) en de kern (blauw). Sommige adenoom cellen vertonen positieve immunokleuring voor Ki-67. Schaal bar = 15 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. actine cytoskelet arrangementen van hypofyseadenoom cellen bevrijd van alginaat kralen. De cellen werden gefixeerd en gekleurd voor actine filamenten met TRITC-phalloidin. Cellen van een niet-invasieve macro- adenoom uitgebreid over het substraat, showing actine stressvezels (A). Cellen van een invasieve macro- adenoom liet een ronde vorm met discontinue actine ringen (B). Schaal bar = 15 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol heeft een aantal kritische stappen. De eerste is korrelgrootte homogeniteit, die nodig is om dezelfde voorwaarden van diffusie van voedingsstoffen en gassen in alle van de celcultuur te behouden. In onze ervaring, het gebruik van een 21 G naald om de alginaatkorrels maken maakt het verkrijgen van een efficiënte kweek van uniforme grootte kraal. De tweede belangrijke factor is de afstand van de naald; deze afstand mag maximaal 5 cm van de calciumoplossing misvormde parels en dode cellen als gevolg van de botsing van de stroom van de alginaat / cel oplossing met het oppervlak van de calciumoplossing voorkomen. Een derde belangrijke stap is het glas roeren waarin de korrels worden gedropt om ze te plakken aan elkaar. Steken resultaten in ongelijke cel inkapseling.
Sommige aanpassingen aan dit protocol kan worden uitgevoerd, afhankelijk van de onderzoeksvraag, bijvoorbeeld, in onze ervaring de oplossing van natriumalginaat kan worden gemengd wet een basale membraan eiwit zoals het type IV collageen, en volgens het protocol hiervoor beschreven, het verkrijgen van een driedimensionale alginaat scaffold. Een andere mogelijkheid is om drijvend alginaat kussens in 15 mm putjes; binnen deze gels kunnen cellen boven of erin worden gezaaid. Problemen oplossen bij het werken met het alginaat kan nodig zijn als een bepaald experiment moet wijzigingen in hun Ca 2+ of Mg 2+ concentraties. Dit komt omdat de hydrogel stabiliteit kan worden gewijzigd. Ba2 + -en Cu2 + -crosslinked alginaatgels relatief stabiel in waterige oplossingen, helaas, deze kationen vaak cytotoxisch 3.
Bij het werken met tumorweefsels zoals hypofyseadenoom weefsels, een beperking van deze techniek is de kleine weefselmonster ontvangen. Daarom is het aantal alginaatparels verkregen afhankelijk van de grootte van het weefselmonster.
Voorheen, een systeemonderhouden hypofyseadenoom cellen in een driedimensionale kweek is beschreven. De auteurs de cellen ingediend rondgaand schudden aggregaten en de cellen gehandhaafd in deze toestand gedurende verschillende perioden 16. Het gebruik van dit celsuspensiecultuur vereist ronddraaiende apparatuur binnen de cultuur kamer. Een voordeel van de hier beschreven protocol is dat het zorgt voor het kweken van cellen in een driedimensionaal systeem zonder de noodzaak van extra laboratoriumapparatuur. De cellen ingebed in de driedimensionale alginaat systeem gevoerd regelmatig incubator in een gewone fles. Een ander voordeel is dat het alginaat steiger, in tegenstelling tot andere driedimensionale systemen, maakt de cellen bevrijd van de hydrogel voor verder onderzoek 7. Een bijkomend belangrijk aspect van het kweken van cellen in alginaatkorrels is dat de cellen ingebed in dit systeem kunnen de novo extracellulaire matrix synthetiseren. Een alternatiefwerkwijze voor de studie van cellen ingebed in alginaat is de vastlegging van de alginaatparels gevolgd door de dehydratie met toenemende concentraties polyethyleenglycol voor daaropvolgende snijden en Immuno-histochemische analyses 17.
We geïnteresseerd in de toekomst de driedimensionale alginaatkorrels systeem ingesloten primaire kweek normale hypofyse rattencellen toepassen om hun interacties te analyseren in een driedimensionale omgeving, en ook cultuur ander type hypofyse adenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R.
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
