Abstract
Et tredimensjonalt kulturmetode er beskrevet i hvilken primær hypofyse adenom-celler dyrkes i alginatkuler. Alginat er en polymer avledet fra brunalger sjø. Kort fortalt er svulstvev kuttet i små biter og sendt til en enzymatisk fordøyelse med kollagenase og trypsin. Deretter ble en cellesuspensjon erholdt. Tumorcellesuspensjonen ble blandet med 1,2% natriumalginat og satt dråpevis til en CaCl2-løsning, og alginat / cellesuspensjonen blir gelert ved kontakt med CaCl2 for å danne sfæriske kuler. Cellene innebygd i alginatkuler forsynes med næringsstoffer som tilbys av kulturmediet beriket med 20% FBS. Tredimensjonal kultur i alginatkuler opprettholder levedyktigheten av adenom celler i lange perioder, opp til fire måneder. Videre kan cellene bli frigjort fra alginat ved å vaske perlene med natriumcitrat og utsådd på dekkglass for videre immunocytokjemiske analyser. Bruken av en cell kulturmodell gjør det mulig for fiksering og visualisering av aktin cytoskjelettet med minimal uorden. I sammendrag, alginatkuler tilveiebringe en pålitelig kultursystem for vedlikehold av hypofyse adenom celler.
Introduction
Tredimensjonale stillasene har vært i utstrakt bruk i celledyrking, fordi de gir en tredimensjonal strukturell støtte for dyrkede celler og vedlikehold av celle-til-celle-kommunikasjon 1. Naturlig avledede polymere materialer har blitt brukt til å lage tre-dimensjonale stillasene inkludert type I kollagen, kitosan og alginat. Alginat er en naturlig polymer avledet fra brun sjø alger Macrocystispyrifera (Tare). Denne polymer består av gjentatte enheter av β-D-mannuronsyre (M) og α-L-guluronsyre (G) 2 og danner stabile geler i nærvær av visse toverdige kationer, slik som kalsium og barium. Kalsiumklorid (CaCl2) løsninger blir ofte brukt som tverrbindings reagens for å danne alginatkuler. Alginat løsninger falt i CaCl 2 umiddelbart danne tredimensjonale sfæriske geler. Når alginat oppløsningen blir blandet med celler, blir cellene innkapslet i alginat bEADS 3.
Alginat har egenskaper som har gjort det mulig at den kan brukes som en matriks for innkapsling av en rekke forskjellige celler, inkludert kondrocytter 4, skjelett myoblaster 5 og nevrale stamceller 6. Det er et inert materiale, og tillater diffusjon av næringsstoffer, oksygen og metabolske produkter som opprettholder celleoverlevelse og funksjon; Dessuten, i motsetning til andre gel-baserte kultursystemer, celler dyrket i alginatkuler kan også bli frigjort fra stillaset ved hjelp av kalsiumchelatorer, så som natriumcitrat, og cellene kan deretter bli høstet for videre undersøkelser 7.
Hypofyse adenomer er vanligvis godartede svulster med lave priser spredning. Rotte hypofyse adenom cellelinjene har blitt dyrket i et todimensjonalt system 8. Imidlertid er denne kulturen av sekretoriske humane hypofyse-cellesvulster ikke en effektiv utvikling; spredt svulst i hypofysen celler vokser dårligi kultur, cellene oppviser begrenset festing og utspredning, og cellene vanligvis danne flytende aggregater i dyrkningsskålen 9,10.
Flere forsøk har vært gjort for å oppnå en tumorcellesuspensjon hypofysen, herunder enzymatisk og mekanisk dispergering tilnærming 11, en utelukkende mekanisk dispersjon tilnærming 12 og dyrkning av tumor eksplantater 10. Med disse metodene har forskjellige forfattere fått levedyktige heft kulturer for ulike tidsperioder. Kapasiteten til tumor sekretoriske celler til å overleve i disse to-dimensjonale systemer er avhengig av tumortype og deres sprednings priser 9. Men i langsiktige kulturer, celler med fibroblast fenotyper dominerer 11,13. Dette dokumentet beskriver en fremgangsmåte for oppnåelse av en primær kultur fra hypofyse adenom celler innkapslet i alginatkuler som ytterligere frigjør dem fra alginat stillaset som muliggjør detaljerte analyser avaspekter av deres cellebiologi, f.eks deres cytoskeletal ordninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent for bruk av humant materiale av lokale etiske komiteer for medisinsk institusjon og Center for Forskning og Advance Studier av National Polytechnic Institute.
1. Tumor Sample Acquisition
- Skaff hypofyseadenom vev biopsi fra en pasient gjennom et trans-sphenoidal kirurgisk prosedyre 14.
- Samle hypofyse adenom prøven og plasser det i en steril glassflaske inneholdende 50 ml friskt 199 kulturmedium (M199) anriket med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,6 mg / ml natriumbikarbonat, 2,4 mg / ml HEPES og 1% antibiotika (penicillin / streptomycin) ved pH 7,4. Opprettholde prøven i en glassflaske på is.
Merk: svulstvev kan behandles flere timer etter operasjonen. - Transporter tumor prøven til laboratoriet i glassflaske på is.
2. Utarbeidelse av den enzymatiske Tissue dissosiasjon Solutions,Trypsin Inhibitor-løsningen og alginatløsninger
Merk: Før cellekulturen prosedyren forberede følgende løsninger. Filter alle løsninger ved hjelp av en 0,22 m membranfilter, før bruk.
- Fremstille kollagenase 1% oppløsning ved å oppløse 5 mg av kollagenase (type I) i 5 ml M199-serumfritt.
- Fremstille trypsin 0,01% oppløsning ved å oppløse 0,01 g trypsin i 10 ml PBS-EDTA 0,3%.
- Fremstille 0,1% trypsin inhibitor oppløsning ved å oppløse 2 mg av soya trypsin inhibitor i 20 ml M199-serumfritt.
- Fremstille DNAse oppløsning ved å oppløse 20 pl DNAse I 134 U / ml i 4 ml av den trypsin-inhibitor-løsning.
- Fremstille EGTA-løsning (1,2 M) ved å oppløse 22,8 mg av EGTA i 40 ml 155 mM NaCl. Juster pH-verdien til 7,4. Fortsett til et sluttvolum på 50 ml.
- Fremstille HEPES-løsning (20 mM) ved å oppløse 238 mg HEPES i 50 ml 155 mM NaCl.
- Forbered 1,2% alginat løsning ved å løse 1,2g natriumalginat i 100 ml av HEPES-løsning. Autoklav alginat løsning.
- Fremstille kalsiumoppløsning (102 mM) ved å oppløse 750 mg CaCl 2 i 50 ml HEPES-oppløsning, justere pH til 7,4
3. Primær Cellekultur og Alginat Innkapsling
- Inne i en laminær strømning skap, plasserer tumorvev i en 35 mm petriskål inneholdende ca. 20 ml PBS Ca 2+ og Mg2 + fri, pH 7,4 (PBS *).
- Ta vev med en kirurgisk pinsett og legg den i en annen petriskål inneholder frisk PBS * Vask forsiktig vevet. Gjenta dette trinnet til de røde blodcellene og rusk blir fjernet.
- Ved hjelp av en kirurgisk pinsett, hold hypofyseadenom vev, og med et lite kirurgisk saks, klippe den i små biter. Med en Pasteur-pipette med avrundede kanter, overføre vevfragmenter og PBS * inn i et 15 ml rør, Sentrifuger ved 68 xg i 10 min ved RT.
Merk: For å avrunde kantene av en Pasteurpipette, noe flamme spissen av pipetten på en Bunsen-brenner. - Fjern PBS * ved hjelp av en Pasteur-pipette og tilsett 3-5 ml av kollagenase oppløsning (ca. 5 ml for 65 mm 3 av vev), blande to til tre ganger ved å invertere. Inkuber vev i collagenase i 30 minutter ved 37 ° C i konstant rotasjon.
- Sentrifuger røret ved 68 xg i 10 min ved romtemperatur og fjern kollagenase med en Pasteur pipette.
- Tilsett 5 ml DNAse og blande to til tre ganger ved å snu, sentrifuger deretter røret ved 68 xg i 10 min ved RT.
Merk: Hvis vevet ikke er fullstendig dissosiert, utføre en andre enzymatisk fordøying med trypsin i 3 minutter ved 37 ° C. Stopp fordøyelse ved tilsetning av 2 volumdeler av trypsin-inhibitor-løsning. - Aspirer supernatanten med en Pasteur pipette og kast. Re-suspendere pelleten i ett volum av EGTA-løsning, og blandes med 2 volumdeler av alginatoppløsning.
- blande cellesuspensjonen og alginat forsiktigved pipettering med en Pasteur pipette. Ta en steril sprøyte med en 21 G nål, fjerne stempelet; bruke en pipette for å laste sprøyten med alginat og celleløsning.
- Forsiktig setter stempelet i sprøyten og forsiktig dispensere alginat-celleløsning slipp-for-dråpe i et glassbeger inneholdende omtrent 30 ml av den kalsium-rik oppløsning.
- Plassere nålen på sprøyten omtrent 5 cm opp til den CaCl2-løsning. De alginat-cellesuspensjonen geler i kontakt med CaCl2 for å danne sfæriske kuler. Hold alginatkuler i kalsiumløsning i 5 min.
Merk: Rør begerglass hvori perlene er utelatt. Beveg den med hånden i sirkulære bevegelser, for å hindre at de kleber seg til hverandre. - Fjern forsiktig kalsiumoppløsning med en Pasteur-pipette, og vaske perlene to ganger med 3-5 ml M199 anriket med 20% FBS.
- Overfør alginatkuler inn i en vanlig T25 vev kulturkolbe ved hjelp av en steril spatel, tilsett 4-5 ml M199 anriket med 20% FBS og inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO2. Endre kulturen medium hver tredje dag.
4. Frigjøre Celler fra Alginat
Bemerk: Før frigjøre cellene fra alginatkuler, frakk 13 mm diameter dekkglass med poly-D-lysin.
FORSIKTIG: svovelsyre er en svært etsende syre, and Apts KAN FØRE ØYNE OG HUD. Bruk latekshansker for å håndtere disse REAGENTS.
- I et avtrekksskap, med et punkt pinsett dyppe objektglassene i en glass Petri-skål inneholdende 20% vandig svovelsyre i 1 time ved RT.
- Dekanter svovelsyre, og vaske objektglassene fem ganger med destillert vann i 5 minutter hver. Ved hjelp av en pinsett punkt sted de rene Dekk i en petriskål inneholdende 0,1 M NaOH i 5 minutter ved RT 15.
- Dekanter NaOH og vaskes en gang med destillereledet vann, aspirer vann og tørk glassene.
- Bruk en mikropipette for å belegge dekkglass med APTS (aminopropyl-trietoksysilan) i 4 minutter (500 ul bruk til 6 dekk) svømme petriskål med destillert vann. Raskt å suge vannet og fortsette å vaske med destillert vann, beveger seg Dekkglass med punkt pinsett for å tillate vann å trenge inn under.
- Aspirer vann og tørk glassene, ved hjelp av et punkt pinsett sted glassene i en ren petriskål og sterilisere dem i mikrobølgeovn under 3 ganger, 45 sek hver. Legge til 1000 mikroliter sterilt vann til 100 ug av poly-D-lysin (0,1 mg / ml).
- Inkuber Dekkglass med ca. 50 ul av poly-D-lysin i 5 min ved RT. Aspirer poly-D-lysin helt.
Merk: Dette er viktig fordi oppløselig poly-D-lysin i kulturmediet kan hemme celleproliferasjon. - Skyll glassene fem ganger med sterilt vann i 5 min hver. Aspirer sterile vann og la Dekk tørke inne i en laminær kabinett.
- For å analysere aktin cytoskjelettet, frigjøre hypofyseceller fra alginat. Ta noen av alginatkuler fra kultur kolbe med en 1 ml pipette og plassere dem i en 15 ml tube.
- Tilsett 5 ml av 55 mM natriumcitrat (oppløse 323,6 mg Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O i 20 ml HEPES-løsning) og sentrifuger ved 68 xg i 10 min ved RT. Aspirer supernatanten og kast.
- Re-suspendere pellet i 1 ml varm M199 beriket med 20% FSB; forsiktig blande cellesuspensjonen med en Pasteur pipette.
FORSIKTIG: phalloidin OG DAPI ER GIFTIG. Bruk hansker for å håndtere disse REAGENTS. - For å telle cellene, overfør 125 pl av 0,4% trypanblått-løsning til et 1,5 ml rør. Legg 75 ul M199 og 50 ul av cellesuspensjonen oppnådd i det siste trinn (fortynningsfaktor = 5). Bland grundig.
- Bruk en mikropipette tips til Place ca. 10 ul av den Trypan blå-cellesuspensjon i hemocytometer kammeret.
- Tell cellene i hemocytometer telleren ved hjelp av et invertert mikroskop med fasekontrastbelysning. Tell alle cellene i en mm sentertorget og fire 1 mm hjørne firkanter. Skaff celletetthet per milliliter ved å multiplisere gjennomsnittlig telling per kvadrat med fortynningsfaktoren -. 10 4 For eksempel hvis de gjennomsnittlige tellinger per kvadrat er 45 celler x 5 x 104 = 2,25 x 106 celler / ml.
Merk: Tell cellene i ti firkanter av hemocytometer kammeret. Ikke telle celler berører den midterste linjen nederst og høyre side. - Seed 35.000 celler på 13 mm diameter dekkglass belagt med poly-D-lysin.
5. Actin Cytoskjelett Arrangement
- Etter 48 timer i kultur, fjerne kulturmediet med en Pasteur pipette og raskt legge til 500 mL per dekk PBS, umiddelbart fjerne PBS.
- Fiks og permeabilize than cellene med 500 ul pr dekkglass av fikseringsbuffer (0,1 M PIPES, pH 6,75, 4% PEG-6000, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 0,5% Triton X-100 og 2% formaldehyd) i 10 minutter ved 37 ° C
- Fjern fiksering buffer og tilsett 500 ul pr dekkglass på 3,5% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern paraformaldehyde løsning.
- Vask objektglassene tre ganger ved å tilsette 500 ul pr dekkglass av PBS i 5 min hver. Skyll glassene ved RT, i konstant omrøring.
- Inkuber cellene med 50 mM ammoniumklorid i 10 minutter, suge ammoniumkloridoppløsning og gjenta trinn 5.4.
- Inkuber cellene med 1% BSA (IgG-fri, proteaser-free) i PBS i 30 minutter, fjern BSA-oppløsning og gjenta trinn 5.4.
- Inkuber cellene med 50 M av rhodaminkonjugert phalloidin for 7 min ved RT, gjentar du trinn 5.4.
- Cellene inkuberes med 255 pM av DAPI fortynnet i PBS i 5 min ved RT, gjenta trinn 5.4. Endelig montere than Dekk med en monteringsmedium og forsegle dem med neglelakk.
- Hente bilder av aktin cytoskeletal arrangementer ved å bruke en konfokal laser scanning mikroskop med en 63X objektiv, på 541 nm eksitasjon bølgelengde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har blitt brukt med hell i kulturen og vedlikehold av adenom hypofyseceller i alginatkuler for forskjellige tidsperioder Figur 1 viser innleiret celler i alginatkuler etter tre måneder.; disse cellene utviser bi-brytnings avrundede former under en invertert lysmikroskop (figur 1). Figur 2 viser lokaliseringen av N-cadherin i rotte-hypofyse adenom celler innleiret i alginat. N-cadherin er lokalisert på celle-celle kontakter (Figur 2A og 2C) og kjernen viste kromatinet utvidet (figur 2B og 2C).
Tumorceller i alginatkuler forblir levedyktig opp til 4 måneder i kultur; Derfor, kan cellene bli frigjort fra de alginatkuler til forskjellige tider, noe som gjør det mulig for analysene av ulike sider avcellebiologi i den samme cellekulturen. For eksempel ble indeksen spredning erholdt fra ti ikke-fungerende humane hypofyse adenomer ved hjelp av immun-reaktivitet for Ki-67, og en midlere merking indeks på 19,2 ± 1,5% (gjennomsnitt ± SEM) ble oppnådd. Figur 3 viser dyrkede humane hypofyse adenom celler immunostained for Ki-67.
De actin cytoskeletons av celler av en ikke-invasiv ble farget i henhold til den immunocytokjemisk protokollen beskrevet ovenfor. Kultur celler utstilt langstrakte figurer med små aktin stress-fibre (Figur 4A) .De morfologi og aktin fila ordninger varierte med hypofysen adenom uavhengig av kultur system; for eksempel i en ikke-fungerende invasiv adenom, ble den dominerende formen blant disse cellene avrundet med en anordning av deres actin filamenter i diskontinuerlige kortikale ringer. (Figur 4B).
Figur 1. Cellene innebygd i alginatkuler i 3 måneder. Cells vise bi-brytnings avrundede former under en invertert lysmikroskop. I panelet til høyre invasiv macroadenoma celler innstøpt i alginat er vist, og i det venstre panelet ikke-invasive macroadenoma celler er vist. Scale bar = 15 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Immuno-cytokjemiske analyse av N-cadherin in Rat hypofyse adenom-celler (GH3) kultur i alginatkuler. GH3-celler ble dyrket i alginat, fast innleiret i alginat system farget for N-cadherin (rød) og kjernen (blå ). Cellene arrangere i en cumUlus viser N-cadherin på celle-celle grenser (A og C). Kjernen (B og C) er vist med den kromatin utvidet. Scale bar = 15 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Farging av kjernefysisk antigen ki-67 dyrkede humane hypofysen adenom celler. Etter 2,5 måneder i alginat perle kultur, ble invasive ikke-fungerende adenom cellene fiksert og deretter immunostained for Ki-67 (rød) og kjernen (blå). Noen adenom celler viser positiv farging for Ki-67. Scale bar = 15 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Actin cytoskjelett arrangementer av hypofyseadenom celler frigjort fra alginatkuler. Cellene ble fiksert og farget for aktin filamenter med TRITC-phalloidin. Celler fra en ikke-invasiv macroadenoma ble forlenget over substratet, som viser små aktin spennings fibre (A). Celler fra en invasiv macroadenoma viste en avrundet form med diskontinuerlige aktin ringer (B). Scale bar = 15 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen har flere kritiske trinn. Den første er perlestørrelse homogenitet, noe som er nødvendig for å opprettholde de samme betingelser for diffusjon av næringsstoffer og gasser i hele cellekulturen. I vår erfaring, bruk av en 21 G nål for å gjøre alginatkuler åpner for kjøp av en effektiv kultur uniform perle størrelse. Den andre viktige faktoren er avstanden fra nålen; denne avstand må ikke være mer enn 5 cm fra kalsium løsning for å unngå deformerte perler og døde celler på grunn av en kollisjon mellom strømmen av alginat / celleløsning med overflaten av kalsiumløsningen. Et tredje kritisk trinn er glassrøre hvori perlene er utelatt for å hindre at de kleber seg til hverandre. Stikker resulterer i ujevn celle innkapsling.
Noen endringer i denne protokollen kan utføres avhengig av problemstillingen, for eksempel, i vår erfaring løsningen av natrium alginat kan blandes wed en basalmembranprotein som type IV kollagen, og følge den protokoll som tidligere er beskrevet, oppnå en tredimensjonal alginat stillaset. En annen mulighet er å lage flytende alginat puter i diameter brønner 15 mm; innenfor disse gels, kan cellene bli seedet over eller inni dem. Feilsøking når du arbeider med alginat kan være nødvendig hvis en bestemt eksperiment trenger endringer i sine Ca 2+ eller Mg 2 + konsentrasjoner. Dette er fordi den hydrogel stabiliteten kan endres. Ba 2+ -og Cu 2+ -crosslinked alginatgelene er relativt stabile i vandige løsninger, dessverre, disse kationer er ofte cytotoksiske tre.
Når man arbeider med tumorvev som hypofyse adenom vev, en begrensning av denne teknikken er det liten vevsprøve tilgjengelig. Derfor kan antallet av alginatkuler som oppnås, avhenger av størrelsen av vevsprøve.
Tidligere et system for åopprettholde hypofyse adenom celler i en tredimensjonal kultur er blitt beskrevet. Forfatterne sendt cellene til gyratory risting for å danne aggregater og vedlikeholdt cellene i denne tilstanden for ulike perioder 16. Bruken av denne cellesuspensjonskultur krever roterende utstyr inne i kulturen kammeret. En fordel ved den protokoll som er beskrevet her er at det gir mulighet for dyrking av celler i et tredimensjonalt system uten behov for ekstra laboratorieutstyr. Cellene innebygd i den tre-dimensjonale alginat system blir opprettholdt i en vanlig inkubator i en vanlig kolbe. En annen fordel er at det alginat stillaset, i kontrast med andre tre-dimensjonale systemer tillater cellene å bli frigjort fra den hydrogel for videre undersøkelser 7. Videre er et viktig aspekt ved dyrkning av celler i alginatkuler at cellene innleiret i dette systemet er i stand til å syntetisere de novo ekstracellulær matriks. en alternativFremgangsmåte for studier av celler innebygd i alginat er festing av alginatkuler etterfulgt av deres dehydrering med økende konsentrasjoner av polyetylenglykol for etterfølgende seksjonering og Immuno-histokjemisk analyse 17.
Vi er interessert i fremtiden for å anvende den tredimensjonale alginatkuler system for å innleiret primær kultur normale rotte hypofyse celler for å analysere deres interaksjoner i et tredimensjonalt miljø, og også til kultur annen type hypofyse adenomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
