Summary
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمية، وحيدة الخلية في التحليل الموقعي للتعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في أجنة الفئران قبل الغرس. الإجراءات اللازمة لتحصيل الكيسات الأريمية، بكل جبل كشف مناعي للبروتينات، وصفت التصوير العينات على المجهر متحد البؤر، وتجزئة النووية وتحليل الصور.
Abstract
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمي، واحدة من الخلايا في الموقع تحليلات التعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في الأجنة قبل الغرس الماوس. ووصف الإجراءات اللازمة لتحصيل الجنين، المناعي، والتصوير على المجهر متحد البؤر، وتقسيم الصور وتحليلها. وتسمح هذه الطريقة الكميات من التعبير عن علامات نووية متعددة والمكانية (XYZ) تنسق جميع الخلايا في الجنين. ويستفيد من MINS، أداة البرمجيات تجزئة الصورة وضعت خصيصا لتحليل الصور مبائر من الأجنة قبل الغرس والخلايا الجذعية الجنينية المستعمرات (ESC). MINS ينفذ تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة عبر X، Y و Z الأبعاد، وينتج من المعلومات حول موقف خلية في الفضاء ثلاثي الأبعاد، فضلا عن مستويات مضان النووية لجميع القنوات مع إدخال المستخدم الحد الأدنى. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل الصورمن سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع تحليل أي عينات أخرى اظهار جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وحيث الكثافة النووية العالية تشكل عقبة أمام تجزئة الصورة (على سبيل المثال، تحليل التعبير عن الخلايا الجذعية الجنينية (ESC ) المستعمرات، تمييز الخلايا في الثقافة والأجنة من الأنواع أو في مراحل أخرى، وما إلى ذلك).
Introduction
جنين الفأر سابق للانغراس هو نموذج لدراسة نشوء وصيانة تعدد القدرات في الجسم الحي، وكذلك نموذجا لدراسة مواصفات مصير الخلايا ودي نوفو الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في الثدييات. حريصون على مراحل سابق للانغراس التنمية الثدييات لإنشاء الأنساب الخلية الثلاثة التي تشكل الكيسة الأريمية، وهي الأديم الظاهر المحفزة - الذي يؤدي إلى معظم الأنسجة الجسمية والخلايا الجرثومية - واثنين من الأنساب خارج الجنين، الأديم الظاهر الغاذي (TE) و الأديم الباطن البدائي (قبل) (الشكل 1A) 1،2. يصف هذا البروتوكول إجراءات ل(1) الأجنة الحصاد وتحديد المرحلة سابق للانغراس الماوس، (2) أداء المناعي لتسمية البروتينات من الفائدة، (3) تنفيذ كامل جبل التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر مع قدرات باجتزاء ض و (4) أداء تجزئة النووية من الصور مبائر ويحلل صورة الكمية اللاحقة. هذا الخط يسمح رانه متحيز قياس مستويات البروتين لتعيين هوية الخلية لوصف مجموعات سكانية فرعية من الخلايا في الموقع. يمكن أن يتم هذا البروتوكول في اقل من 3-4 أيام للحصول على القمامة واحدة (عادة ما يصل الى 10 أجنة الفئران)، من جمع الأجنة لتحليل البيانات (الشكل 1B). إن التحليل المتزامن لعدة جراء زيادة التصوير وتحليل البيانات عبء الزمن، وبالتالي تمديد الطول الإجمالي للبروتوكول.
الجنين قبل الغرس مرحلة الماوس هو نظام لين العريكة تجريبيا التي، نظرا لصغر حجم والتشكل النمطية 3، هي مناسبة تماما لفي التصوير توتو من العمليات الخلوية لقرار وحيدة الخلية. لإجراء وتحليل غير متحيز على مستوى نظم عدد هام إحصائيا من الأجنة، وهو خط أنابيب التحليل الكمي الآلي هو مرغوب فيه. ولكن نظرا لكثافة النووية عالية من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) من الكيسة الأريمية (
خط أنابيب التحليل المقدم هنا يدور حول أداة تقطيع الصورة مقرها MATLAB-وحدات التفاعلية الإنقسام النووية (دقيقة) 4. MINS صerforms تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة على دفعات كبيرة من مبائر Z-مداخن بعد أنشأت المستعمل أقل عدد ممكن من خصائص الصورة، وذلك باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) (الجدول 1) (4). وقد ثبت هذا الخط فعالة لتوليد بيانات عالية الإنتاجية على التعبير البروتين وتوطين خلية في كل من النوع البري، وتعامل بشكل تجريبي والمعدلة وراثيا الأجنة والمجالس الاقتصادية والاجتماعية 5-7. في هذا البروتوكول، وصفنا تطبيق MINS إلى تقسيم الصور الجنين قبل الغرس المرحلة. للحصول على أمثلة من أداء MINS على المجالس الاقتصادية والاجتماعية، يرجى الرجوع إلى 4،7. الخطوة تجزئة النووية الآلي يقلل بشكل ملحوظ من عبء الوقت عملية تحديد الهوية الخلية، في حين أن قياسات كثافة المكانية ومضان تسمح للتقرير متحيز الهويات خلية وتوليد خرائط ثلاثية الأبعاد من مجالات التعبير الجيني وموقف الخلايا في الجنين (الشكل 1C 5،6. MINS غير متاحة بحرية في http://katlab-tools.org (البرنامج يتطلب ترخيص MATLAB).
أي نهج ضعت حتى الآن يسمح للجيل هذه البيانات متعمقة بشأن تعبير البروتين وتوطين الخلايا في أجنة الفئران قبل الغرس. كل المحاولات حتى الآن في قياس هذه الأنواع من البيانات قد يقتصر على تقرير اليدوية والكميات من أرقام الهواتف المحمولة لمجموعات سكانية مختلفة في الجنين (إما كليا يدويا، أو البرمجيات بمساعدة) 9-19. وقد تم تصميم هذا النهج (دمج البرمجيات دقيقة) لواختبارها على الأجنة قبل الغرس الماوس والمجالس الاقتصادية والاجتماعية. ومع ذلك أدائها على أنظمة أخرى ذات الكثافة النووية عالية، على الرغم من بعد لم تختبر، ومن المتوقع أن يكون معادلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: كل عمل الحيوانية، بما في ذلك تربية، تربية والتضحية وتمت الموافقة من قبل لجنة ميموريال سلون كيترينج للسرطان في الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC)، بروتوكول # 03-12-017.
مجموعة 1. الأجنة
ملاحظة: يجب أن يكون قد وافق كل عمل الحيوانية السلطات المؤسسية والمحلية وتتوافق مع القواعد المحلية والمؤسسية.
- ماتي الماوس الإناث البكر مع عشيق الذكور الخصبة من المورثات المطلوب.
ملاحظة: إذا وضع التزاوج الطبيعي، واختيار الإناث في المرحلة شبق للدورة estral يزيد من فرص الجماع على التاريخ المطلوب. إذا حمل فرط الإباضة، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المذكورة في 20. - تحقق من وجود المكونات المهبلي في الصباح باستخدام مسبار حادة. من الناحية المثالية، القيام بذلك قبل الظهر (12:00)، كما خسر المقابس الجماع طوال اليوم. النظر NOOن من الكشف عن يوم الجنينية المكونات المهبلية (E) 0.5.
- في اليوم المطلوب والوقت من التطور الجنيني، الاحماء M2 أو احمرار عقد المتوسطة (FHM) إلى RT، أو يفضل، 37 درجة مئوية. ملاحظة: إما M2 أو FHM يمكن استخدامها لالتنظيف والتعامل مع الأجنة. عندما لا تكون قيد الاستعمال، وتخزين هذه الوسائط في 4 درجة مئوية. تقدير استخدام ~ 2 مل من المتوسط لكل الرحم.
- ذوبان المجمدة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو إعداد بعض حل جديد. تقدير 500 ميكرولتر من 4٪ حل PFA لكل بئر من لوحة 4 بشكل جيد. إصلاح القمامة واحدة على كل جانب من لوحة 4 بشكل جيد. ملاحظة: بدلا من ذلك، لوحة 96-جيدا يمكن أن تستخدم لإصلاح والأجنة المخزن. في حالة استخدام لوحة 96-جيدا، استخدم 100 ميكرولتر من محلول PFA لكل بئر.
- سحب ماصة باستير الزجاج باستخدام اللهب المكشوف لرسم نهاية الشعرية على الحافة.
- التضحية أنثى خلع عنق الرحم أو CO 2 الاستنشاق، أو كما هو مطلوب من قبل الأنظمة المحلية والمؤسسية. غالبا ما يكون desirablالبريد لتأكيد القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
- رش بطن الحيوان مع الايثانول 70٪ للحد من سفك الشعر وإجراء شق في البطن، أولا من خلال الجلد وبعد ذلك من خلال جدار الجسم (البريتوني) لكشف الأحشاء.
ملاحظة: تصف الخطوات التالية إجراء لجمع الكيسات الأريمية من رحم فئران الحوامل في أي مرحلة بين E3.25 وE4.5 (الشكل 1A). لبروتوكولات على مجموعة من الأجنة سابق للانغراس في وقت سابق من E3.25، راجع إلى 20. - حدد موقع الرحم وإزالة من الحيوان. عقد نهاية عنق الرحم مع زوج من ملقط، قطع طريق عنق الرحم وسحب ما يصل بلطف على امتداد كل من قرون الرحم.
- خفض الدهون من الرحم، مع الحرص على عدم اختراق جدار الرحم. ويمكن القيام بذلك بسهولة في وقت الإزالة، في حين لا تزال تعلق على جسم الحيوان، كما يمكن أن تمتد الرحم خارج. بدلا من ذلك،ويمكن أن يتم في وقت لاحق، تحت المجهر تشريح، في RT برنامج تلفزيوني. لبروتوكول أكثر تفصيلا عن تشريح الرحم، انظر بروتوكولات 5 و 8 20
- قطع فوق ناقلة البيضات، تحت المبيضين، للافراج عن الرحم بأكمله، وضعها على طبق بتري، وتغطي مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: هذه الخطوة كما يسمح غسل الدم الزائد أو غيرها من الحطام من الرحم، مما يسهل الحصاد الكيسة لاحق. - قرون منفصلة كلا الرحم من خلال قطع نهاية الداني، على كلا الجانبين من عنق الرحم والتخلص من عنق الرحم. فصل كل قناة البيض من الرحم عن طريق خفض تحت البرزخ الذي يربط منها (الشكل 1A). نقل كل من قرون إلى قطرة من التلاعب المتوسطة (إما M2 أو FHM) لجمع الأجنة والتلاعب.
- تحت المجهر تشريح، الكيسات الأريمية دافق من الرحم وفي المتوسط عن طريق إجبار 0،5-1 مل من M2 أو FHM خلال كل قرن الرحم من فتح عنق الرحم. استخدام 1مل حقنة بإبرة تحت الجلد. ملاحظة: إبرة يمكن قلل باستخدام الحجر الايداع لتجنب تمزق الرحم، على الرغم من أن هذه ليست حرجة. رسم تخطيطي مفصل عن التنظيف الرحم يمكن العثور عليها في 21.
- باستخدام مجهر تشريح، حدد موقع الكيسات الأريمية، والتي سوف تكون مبعثرة في جميع أنحاء قطرة من المتوسط. السماح تصل إلى 1-2 دقيقة لالكيسات الأريمية لتنزل الى قاع الطبق بعد التنظيف. باستخدام والزجاج ماصة باستير التي تسيطر عليها الفم مع نهاية الشعرية، وجمع كل الكيسات الأريمية ونقل إلى تراجع جديد من وسائل الإعلام.
- شطف الكيسات الأريمية عن طريق نقلها من خلال 2-3 قطرات من M2 الطازجة أو FHM. نقل الأجنة في مجموعات من 5-10 الكيسات الأريمية في وقت واحد.
ملاحظة: نقل مجموعات كبيرة في وقت واحد سوف تسرع هذه العملية، ولكنه سوف يزيد أيضا من فرص دون قصد تفقد العديد من الأجنة. إذا غير مدربين على استخدام ماصات التي تسيطر عليها الفم، وممارسة التلاعب الجنين ونقل ينبغي النظر فيها قبل بeginning التجربة. - إزالة المنطقة الشفافة (ZP) من الكيسات الأريمية لم يفقس (عموما <E4.0) من خلال غسلها لفترة وجيزة في المحاليل الحمضية تايرود. بمجرد ZP لم تعد مرئية، ونقل الكيسات الأريمية إلى وسائل الإعلام التلاعب. تبقي فقط الأجنة في حمض في تايرود لطالما الضرورة القصوى، وذلك لمنع تلف الخلايا.
- أخذ الحيطة والحذر عند التعامل مع الكيسات الأريمية الجرداء، كما أنها تلتزم بسهولة جدا على الزجاج والبلاستيك السطوح. التلاعب المتوسطة تحتوي على 4 ملغ / مل من الزلال المصل البقري (BSA) لمنع التعلق، ولكن حامض على تايرود أو برنامج تلفزيوني لا، لذلك، للحد من خطر وقوع أضرار أو خسائر الأجنة لا تلتقط أكثر من 2-5 الكيسات الأريمية الجرداء في الوقت الذي التلاعب بها في برنامج تلفزيوني BSA خالية أو خالية من المصل أو حامض في تايرود.
ملاحظة: بدلا من ذلك، ومعطف ماصة الزجاج مع 1٪ BSA قبل استخدامها للحد من التزام الأجنة إلى سطح الزجاج.
- أخذ الحيطة والحذر عند التعامل مع الكيسات الأريمية الجرداء، كما أنها تلتزم بسهولة جدا على الزجاج والبلاستيك السطوح. التلاعب المتوسطة تحتوي على 4 ملغ / مل من الزلال المصل البقري (BSA) لمنع التعلق، ولكن حامض على تايرود أو برنامج تلفزيوني لا، لذلك، للحد من خطر وقوع أضرار أو خسائر الأجنة لا تلتقط أكثر من 2-5 الكيسات الأريمية الجرداء في الوقت الذي التلاعب بها في برنامج تلفزيوني BSA خالية أو خالية من المصل أو حامض في تايرود.
- معطف أسفل كل بئرمن 4 جيدا طبق زراعة الأنسجة مع طبقة رقيقة من 1٪ أجار، 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمنع الأجنة من الانضمام إلى البلاستيك. بدلا من ذلك، إضافة 4 ملغ / مل من جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني (PBS-BSA).
- شغل أيضا واحدة من 4 جيدا طبق زراعة الأنسجة المغلفة مع 500 ميكرولتر من RT برنامج تلفزيوني (أو برنامج تلفزيوني BSA) وكذلك مع 500 ميكرولتر آخر من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني.
- شطف الكيسات الأريمية في RT برنامج تلفزيوني وإصلاح في PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. نقل إلى برنامج تلفزيوني (أو برنامج تلفزيوني BSA) بعد التثبيت.
- إذا الأجنة لن تتم معالجتها فورا، تغطية برنامج تلفزيوني تحتوي على أجنة بطبقة من الزيت المعدني لمنع التبخر (مما يؤدي إلى جفاف العينة) وتخزين لوحة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: طرق التثبيت مختلفة وأوقات يمكن استخدام اعتمادا على التجربة، والحواتم الفائدة والأجسام المضادة لاستخدامها. أيهما طريقة الاختيار، أن تكون متسقة في جميع أنحاء التجارب تعادل لتسهيل المقارنة اللاحقة من نتائج تلطيخ.
ملاحظة: وقفةويمكن تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى عدة أسابيع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية: نقطة. ضمان PBS معقمة و / أو إضافة 100 U / مل من البنسلين + 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (القلم بكتيريا) لمنع التلوث البكتيري (وخاصة عند استخدام برنامج تلفزيوني BSA) إذا توقع تخزين لفترات طويلة.
2. المناعي
- أداء المناعي باستخدام أي بروتوكول الذي سبق اختبارها وثبت أن تكون قوية لالمناعي كله جبل. ملاحظة: نوصي تلك الموضحة في 22 و 11. في هذه المادة سوف يمكن وصفها السابق. أيهما طريقة الاختيار، أن تكون متسقة في جميع أنحاء التجارب تعادل لتسهيل المقارنة بين نتائج تلطيخ.
- استخدام مرنة، والبلاستيكية، واضحة، U-القاع 96-جيدا لوحة لتنفيذ خطوات متتابعة للبروتوكول المناعي. ملء كل جيدا مع 50-100 ميكرولتر من حل ونقل الأجنة من حل واحدإلى آخر باستخدام ماصة الفم على شكل حرف L. ملاحظة هذا النهج يقلل من استخدام المواد الكيميائية ويسهل تتبع الخطوات فضلا عن تلطيخ الموازي لعدة المجموعات التجريبية.
- اختياري: معطف أسفل الآبار مع طبقة رقيقة من 1٪ أجار، 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمنع التصاق الأجنة إلى البلاستيك. لا تقم بإضافة BSA إلى حلول المناعي.
- إعداد PBX (0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني). إذا توقع أداء العديد من التجارب المناعي، وإعداد 50 مل من مقسم وتخزينها في 4 درجة مئوية بين التجارب.
- يعد حل permeabilization (0.5٪ تريتون X-100، 100MM الجلايسين في برنامج تلفزيوني). جعل 1 مل (أو أي المبلغ اللازم) من حل permeabilization جديدة لكل تجربة.
- إعداد عرقلة الحل (المصل 2٪ الحصان (HS) أو 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) مع القلم بكتيريا في برنامج تلفزيوني). إعداد 10 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية بين التجارب.
- وقد لوحظ عدم وجود فروق بين إمانوع من المصل، مع ذلك، أن تكون متسقة في اختيار عرقلة الحل المستخدمة للتجارب مماثلة.
- شطف الأجنة ثابتة لمدة 5 دقائق على RT في PBX (~ 100 ميكرولتر).
- Permeabilize الأجنة لمدة 5 دقائق على RT في حل permeabilization (~ 100 ميكرولتر).
- شطف الأجنة لمدة 5 دقائق على RT في PBX (~ 100 ميكرولتر).
- الأجنة كتلة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT في ~ 100 ميكرولتر من عرقلة الحل. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
ملاحظة: الأجنة يمكن أن يكون قد تم حظره لمدة تصل إلى O / N فترات في 4 درجة مئوية دون تحسن أو ضرر ملحوظ بالمقارنة مع 30 دقيقة الخطوات الحجب. - احتضان الأجنة O / N عند 4 درجات مئوية في الأجسام المضادة الأولية / الأجسام المضادة المخفف في عرقلة الحل (~ 100 ميكرولتر). تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
- تحديد تخفيف الأمثل لكل الأجسام المضادة الأولية مسبقا. انظر دiscussion والمواد قسم للالتخفيفات اختبار عدد من الأجسام المضادة.
- بعد O / N الحضانة، وشطف الأجنة 3X لمدة 5 دقائق كل في RT في PBX (~ 100 ميكرولتر).
- الأجنة كتلة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT في ~ 100 ميكرولتر من عرقلة الحل. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
- احتضان الأجنة ل1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية في الضد الثانوية / الأجسام المضادة المخفف في 4 ميكروغرام / مل في ~ 100 ميكرولتر من عرقلة الحل. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
- شطف الأجنة 2X لمدة 5 دقائق كل في RT في مقسم.
- نقل الأجنة إلى وصمة عار الحمض النووي المفضل. إذا باستخدام هويشت 33342، ويخفف إلى 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
ملاحظة: نقطة وقفة: إذا لم يتم تصوير الأجنة على الفور، فإنها يمكن أن تبقى لأجلك ..p لعدة أسابيع في حل تلطيخ النووي. في هذه الحالة، وضمان PBS معقمة و / أو إضافة القلم بكتيريا أو أزيد الصوديوم لمنع نمو البكتيريا والتلوث.
3. متحد البؤر التصوير
ملاحظة: سوف تكوينات المجهر مبائر الفردية تتطلب المعلمات الاستحواذ محددة إلى تعديل للنظام والبرامج في المكان. ومع ذلك، يوفر القسم التالي مجموعة من القواعد العامة لمتابعة التي ينبغي أن تنطبق على أي تركيب معين.
- باستخدام ماصة الفم الجميلة، وجعل microdrops من برنامج تلفزيوني أو حل وصمة عار النووي على سطح الزجاج من صحن زجاج القاع 35MM، وتغطي مع الزيوت المعدنية. وكبديل لذلك، استخدام ساترة منتظمة مع فواصل سيليكون لتجنب إتلاف الأجنة، وتغطي مع شريحة المجهر والزجاج. ملاحظة: عند استخدام ساترة العادية والأجنة لا يمكن بعد ذلك إعادة وضع أو استردادها لالتنميط الجيني، وبالتالي فإننا نوصي بشدة استخدام الزجاج أسفلأطباق.
- مكان الأجنة في microdrops وترتيب بطريقة متناسقة، ويفضل أن يكون مع الحركة الدستورية الإسلامية تجويف محور مواز لسطح الزجاج. إعداد طبق على حامل المجهر. ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها في المسح الضوئي ليزر المجاهر مبائر تعاني من فقدان المرتبطة محور Z من كثافة مضان. لذلك، والاتساق في الترتيب مهم لمقارنة الكثافات بين المناطق تعادل على الأجنة المختلفة.
- إعداد المعلمات مرجع باستخدام أجنة نوع البرية التي لم تكن تخضع لأي نوع من العلاج الذي قد يغير التعبير الجيني.
- الحصول على صور باستخدام الهدف عالية التكبير (أي 40X أو أعلى) من أجل الحصول على البيانات التي من شأنها تسهيل تجزئة دقيقة باستخدام أداة MINS 4.
ملاحظة: استخدام التكبير الرقمي على هدف 20X لن تسفر عن الصور من قرار الكافي للتجزئة باستخدام MINS. ينبغي للمرء أن نلاحظ أيضا المسافة العمل (WD) لهذا الهدف، كما يجب أن تكونكافية للسماح الاستحواذ على Z كومة التي تمتد على الكيسة كلها، بالتالي WD طويل (~ 130-150 ميكرون) هدف ضروري عادة. تم الحصول على 4 باستخدام 40X / NA الهدف الغمر 1.30 النفط مع مسافة العمل من 210 ميكرون - الصور المبينة في الشكلين 2. - استخدام انتاج الليزر أدنى أن يوفر نسبة قوية إشارة إلى الضوضاء دون تبيض fluorophores.
- ضبط الربح وتعويض للحصول على أوسع نطاق ديناميكي دون تعريض العينة. فضح صور لتغطية معظم، أو تمتد وكامل، رمادي نطاق جدول تسهيل الكشف عن الفروق الصغيرة في كثافة بين الصور.
- استخدام صغيرة (1 ميكرون) Z-خطوة، منذ محور Z قرار حاسم للتجزئة دقيقة مع MINS.
ملاحظة: أبعاد XY لا تؤثر على عملية تجزئة النووية، إلا أن حجم ملف الصورة. عموما، 512 × 512 بكسل هو قرار XY كافية للصور ذات جودة المنشور دون compromiالغناء مساحة القرص الصلب. - خطوة حاسمة: حافظ التصوير المعلمات متسقة داخل وعبر جلسات التصوير لنفس التجربة وذلك لتكون قادرا على مقارنة عينات.
- الحصول على صور باستخدام الهدف عالية التكبير (أي 40X أو أعلى) من أجل الحصول على البيانات التي من شأنها تسهيل تجزئة دقيقة باستخدام أداة MINS 4.
- التصوير دفعات من الأجنة:
- مجموعة صورة متماسكة (الفضلات، والتجارب) في جلسة واحدة كلما أمكن ذلك.
- الحفاظ المعلمات متسقة داخل وعبر جلسات التصوير ليعيد نفس التجربة.
- الأجنة صورة في جميع أنحاء (كله محور Z) للقبض على كل خلية.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، ويمكن أن يتم الجنين التنميط الجيني بعد التصوير كما هو موضح في 23. الحاجة إلى متداخل PCR لابد من تحديد تجريبيا وسوف تعتمد على مكان ليتم تحليلها والاشعال المستخدمة.
- تأكد من أن تكون قادرة على المباراة الأجنة إلى صور بأثر رجعي.
4. صورة تحليل وبيانات ما قبل المعالجة
- تحميل وتثبيت MINS 4 من http: // katlab-tools.org (رخصة MATLAB المطلوبة).
- أداء تقطيع الصورة:
- اتبع اجهة المستخدم الرسومية (GUI) من دقائق لتحميل صورة مبائر أو كومة من القرص الصلب، وكشف عن ونوى وجزء من الصورة. تحميل كامل Z-كومة من البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر (.lsm، .lif، .oif، وما إلى ذلك). انظر الجدول 2 للاطلاع على تفاصيل كل خطوة والتعليمات الموجودة على http://katlab-tools.org و 4. وبمجرد الانتهاء، عرض نتائج كل خطوة بالضغط على 'عرض' الزر المقابل. علامة صفراء فوق زر يشير إلى عملية في العملية، علامة خضراء تشير إلى إكمال العملية.
ملاحظة: MINS حاليا لا يدعم ملفات .czi و tiff تسلسل أو ملفات متعددة موقف - كل Z كومة يجب أن يكون ملف مستقل. - بعد تجزئة مرضية، حفظ خط أنابيب تم إنشاؤها بحيث يمكن استخدامها مباشرة للأجنة أو الفضلات الأخرى.
- اتبع اجهة المستخدم الرسومية (GUI) من دقائق لتحميل صورة مبائر أو كومة من القرص الصلب، وكشف عن ونوى وجزء من الصورة. تحميل كامل Z-كومة من البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر (.lsm، .lif، .oif، وما إلى ذلك). انظر الجدول 2 للاطلاع على تفاصيل كل خطوة والتعليمات الموجودة على http://katlab-tools.org و 4. وبمجرد الانتهاء، عرض نتائج كل خطوة بالضغط على 'عرض' الزر المقابل. علامة صفراء فوق زر يشير إلى عملية في العملية، علامة خضراء تشير إلى إكمال العملية.
- ، وضع دفعة تجزئة:
ملاحظة: سيملفات ngle يمكن أن تكون مجزأة بشكل فردي. ومع ذلك، بالنظر إلى أن الأجنة داخل القمامة أو التجربة بشكل عام من مرحلة قابلة للمقارنة، يمكن MINS تطبيق خط أنابيب تجزئة لخلق صورة واحدة إلى مجموعة منهم دون إشراف.- من القائمة دفعة-وضع تشغيل، انقر فوق "إضافة ملفات" وتحميل كافة الملفات التي سيتم تجهيزها في وقت واحد. ملاحظة: يمكن إضافة الملفات من مصادر مختلفة إلى قائمة انتظار تجزئة.
- انقر على "ابدأ دفعة-وضع تشغيل 'وإتاحة الوقت للبرنامج لمعالجة الملفات. ملاحظة: سيتم حفظ الانتاج الإنقسام في نفس الدليل حيث الملفات الأصلية حيث تقع.
- تقييم تقسيم والتصحيح اليدوي
ملاحظة: MINS شرائح الصور مع دقة عالية جدا (> 85٪)، ومع ذلك، ونوعية من تلطيخ والتصوير، فضلا عن مرحلة من مراحل الجنين، قد تؤثر على أداء MINS. عموما، والكثافة النووية العليا داخل الجنين، فإن أخطاء تجزئة أكثر عرضة تأخذ PLACه (أرقام 2D و 3). وبالتالي، يجب أن يتم تقييم دقة تجزئة لكل عينة وتصحيح يدويا إذا لزم الأمر. نوعين من الأخطاء تحدث عادة: الإفراط في تجزئة وتحت تجزئة.- حل الإفراط في تجزئة:
- تحديد ايجابيات كاذبة - الحويصلات أفكارك (الشكل 3A أ، ب، د، العلامات النجمية) أو غيرها من العناصر التي ليست نواة سليمة، ولكن الذي قد تم التعرف على هذا النحو من قبل MINS.
ملاحظة: هذه عموما المغلوطة لديهم حجم أصغر من نواة حقيقية ويمكن، في معظم الحالات، يكون من السهل التعرف وفرزها على جدول البيانات. ومع ذلك، ينصح بشدة الفحص البصري، كما في كثير من الأحيان نوى قد تكون مجزأة بشكل جزئي فقط، مما أدى إلى، ولكن حجم مجزأة صحيح أصغر (الشكل 3A ب، رأس السهم). - حذف السجلات المطابقة للايجابيات كاذبة من ملف * statistics.csv. الحفاظ على إحصاءات * الأصليملف csv للرجوع إليها في المستقبل وتحرير فقط على نسخة منه.
- إذا كانت نواة الإفراط في مجزأة وقدم إلى 2 أو أكثر من نوى (الشكل 3A ج، السهم والسهام)، إما دمج السجلات عن طريق حساب متوسط مستوى حدتها، أو إذا ما شابه ذلك، تبقى أحد السجلات لتلك الخلية وتجاهل راحة.
- تحديد ايجابيات كاذبة - الحويصلات أفكارك (الشكل 3A أ، ب، د، العلامات النجمية) أو غيرها من العناصر التي ليست نواة سليمة، ولكن الذي قد تم التعرف على هذا النحو من قبل MINS.
- حل دون تجزئة:
- تحديد الأحداث حيث فشلت دقيقة للكشف عن الحدود بين اثنين أو أكثر من نوى وبالتالي مجزأة بها باعتبارها نواة واحدة (الشكل 3A د، السهم و3B). ملاحظة: هذا يشكل مشكلة بالنسبة لعدد خلايا دقيقة، ولكن الأهم من ذلك، لقياس مستويات البروتين، لأن مستويات قياس سيكون متوسط الخلايا التي تم دمجها بشكل خاطئ، والتي قد تنتمي إلى أنساب مختلفة.
- تحديد الأحداث حيث فشلت دقيقة للكشف نواة تماما.
- في هذه الحالات (4.4.2.1 و4.4.2.2)، قياس متوسط مستويات الرمادي وأو كل قناة في الخلية الناقصة أو غير مجزأة (ق) باستخدام أداة بديلة، مثل يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/)، وتحل محل سجل خاطئ مع المستويات الصحيحة. الحفاظ على ملف * statistics.csv الأصلي للرجوع إليها في المستقبل وتعديل فقط على نسخة منه. القيام بذلك باستخدام يماغيج، اتبع الخطوات التالية:
- فتح كومة متعددة القنوات ذات الصلة على يماغيج واستيراد المقابلة * ملف overlaid.tiff الناتجة عن MINS كما كومة الظاهري ( 'ملف'> 'استيراد'> 'TIFF كومة الظاهري ...').
- العثور على قسم وسطي من نواة الناقصة أو من الامم المتحدة ومجزأة.
- باستخدام أداة التحديد مرفوعة الخطوط العريضة لمحيط النواة الناقصة أو من الامم المتحدة ومجزأة على قناة الحمض النووي وصمة عار.
- الصحافة CRL + M (كمد + M على ماكنتوش) أو اذهب إلى قائمة تحليل واختر "قياس". هذا العمل سوف يسجل قيمة الرمادي متوسط للمنطقة المذكورة وسيعرض على نافذة جديدة. انتقل إلى 'تحليل'>9؛ مجموعة القياسات ... 'وتأكد "يعني قيمة الرمادي' تم اختياره. تحديد أي معايير أخرى للقياس.
- باستخدام نفس المنطقة المذكورة في الخطوة 4.4.2.3.3، كرر قياس لكل من القنوات مضان من الفائدة. سيتم إلحاق نتائج لسابقتها في نافذة القياسات "نتائج".
- استخدام القياسات التي تم الحصول عليها لتحل محل السجلات الخاطئة في ملف * statistics.csv. إذا لم مجزأة النواة، إدراج صف جديد، عين له هوية خلية جديدة وإدخال القيم التي تم الحصول عليها في ImageJ تحت العمود المقابل لكل قناة. وهذه الخلية لم يكن لديك الإحداثيات المكانية (X، Y والقيم Z). إذا كان قد تم undersegmented النواة، مكررة خلافها، تعيين معرفات خلية مختلفة إلى كل خلية جديدة وإدخال القيم التي تم الحصول عليها في ImageJ تحت العمود المقابل. في هذه الحالة، فإن كلا الخلايا تبادل الإحداثيات المكانية.
ملاحظة: إذا كان التوزيع المكاني ليتم تحليلها، نحن صecommend باستثناء XYZ إحداثيات هذه الخلايا، لأنها سوف تتداخل. تحقيقا لهذه الغاية، عند إنشاء سجلات جديدة، تعيين معرفات خلية لها أن تتميز بسهولة من تلك الأصلي (للأرقام سبيل المثال، غير صحيح).
- يسجل تقسيم الخلايا. ملاحظة: MINS يكشف الإنقسامية وكذلك نواة الطور البيني، ولكن لا يمكن التمييز بينهما.
- إذا نوى الإنقسامية التي يتعين النظر فيها بشكل منفصل في التحليل، يدويا تسجيل هذه وإضافة هذه المعلومات إلى ملف البيانات. لتسجيل الخلايا الإنقسامية، إضافة متغير جديد (عمود) إلى ملف * بيانات statistics.csv وتعيين قيم مختلفة لالإنقسامية والبيني نوى.
- حل الإفراط في تجزئة:
- بيانات ما قبل المعالجة.
ملاحظة: مرة واحدة وقد تم تصحيح جداول البيانات لفوق وتحت تجزئة انهم مستعدون ليتم تحليلها. فإن عملية تحليل وعرض البيانات تعتمد على تجربة محددة. ومع ذلك، وفيما يلي بعض التحولات البيانات العامةنوصي تنفيذ قبل التحليل:- تحويل قيم الكثافة مضان إلى اللوغاريتم أو الجذر التربيعي للحد من تشتت البيانات. وهذا يساعد أيضا التصور، كما تميل البيانات الخام إلى التركيز بالقرب من محاور مؤامرة (انظر الشكل 4B، C).
- تصحيح التوهين المصاحب Z مضان:
ملاحظة: شدة الإسفار في المسح الضوئي ليزر الصور المجهري متحد البؤر يقلل من أعمق على محور Z يقع على شريحة (الشكل 4E، F).- إذا كان أحد الحواتم المكتشفة في العينات هو علامة النووية في كل مكان، وأعرب عن متجانس التدبير المنزلي، وتطبيع كثافة مضان من الحواتم أخرى بقسمة قيمها في كل خلية من القيمة المطابقة للعلامة التدبير المنزلي.
- في حالة عدم وجود مثل هذه علامة مرجعية، تعويض الخسائر المرتبطة Z من مضان على النحو التالي:
- رسم القيم من كل علامة (Yمحور الرسم البياني) في أكثر من موقف Z (X محور الرسم البياني) لتصور انخفاض في شدة على Z - مؤامرة معا القيم للجميع للتحكم، نوع البرية الأجنة (الشكل 4F).
- تناسب النموذج الخطي (منحنى الانحدار) في المؤامرة التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة (تقدر كثافة على Z) لكل علامة (الشكل 4F).
- تصحيح كل القيم لكل علامة باستخدام الصيغة التالية:
سجل (القيمة الأصلية) + Z * المنحدر من طراز (الشكل 4D، G).
ملاحظة: الخطوات المحددة لإجراء هذا التصحيح سوف تعتمد على برامج التحليل المستخدمة (R، MATLAB، وما إلى ذلك). في حالة استخدام R، تشغيل الصيغة التالية لتتناسب مع نموذج خطي لبيانات:
> ل م (سجل (قناة) ~ Z، البيانات = dataframe)
حيث، القناة هي قناة مضان إلى تصحيح، Z هو Z تنسيق وdataframe هو الجدول الذي يحتوي على كافة القيم الجنين المطلوب (ق) (و* القانون الأساسيistics.csv الملفات التي تم إنشاؤها من قبل MINS أو تعديل عليه).
ملاحظة: سيتم إخراج الصيغة أعلاه يكون الشكل التالي:
(اعتراض) Z
4.76373 -0،01947
حيث وZ القيمة المنحدر من خط الانحدار للأن مجموعة البيانات التي يجب أن تستخدم القيمة المطلقة لتعديل القيمة الأصلية مع الصيغة الواردة في 4.5.2.2.3 (انظر الشكل 4G للحصول على مثال).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتسهيل تفسير البيانات وعرضها، ينبغي الحرص على عدم الإضرار الأجنة خلال جمع والتلاعب، بحيث يمكن تحليل كل الخلايا ومركزها النسبي الشكل 2A - يظهر D أمثلة من الكيسات الأريمية سليمة في مراحل مختلفة مع تجويف الموسع. يجب أن تلحق الضرر يحدث، ينبغي اتخاذ الحذر عند تحليل وتفسير النتائج.
جودة وموثوقية البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول يعتمد على نوعية التثبيت وعلى نسبة الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن البروتينات ذات الاهتمام الإشارة إلى الضوضاء. دائما استخدام مثبت الطازجة واختبار الأجسام المضادة الجديدة، مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة، قبل البدء في مجموعة من التجارب. ويبين الشكل 2A أمثلة من الأجسام المضادة جيدة لعدد من البروتينات النووية. ويبين الشكل 2B والامثله(ه) من الأجسام المضادة جيد للبروتين حشوية (DAB2). ويبين الشكل 2C مثال على تلطيخ سيئة، مع انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، حيث تم إصلاح العينة لمدة 10 دقيقة فقط. في هذه الحالة، فإن الأجسام المضادة المستخدمة في GATA4 (سانتا كروز، SC-1237) يتطلب O / N تثبيت لتوفير إشارة قوية (انظر 24 للحالات الأجنة ثابتة O / N وملطخة هذه الأجسام المضادة). زيادة مستوى إشارة خلال مرحلة ما بعد المعالجة يكشف عن صورة صاخبة جدا. على النقيض من ذلك معاداة GATA4 المستخدمة في الشكل 2A (SC-9053) يوفر ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء بعد تثبيت فقط 10 دقيقة. وترد تفاصيل عن هذه وغيرها من الأجسام المضادة القوية في قسم المواد.
العوامل التي تحد للتجزئة MINS الجيدة هي أ) التكبير الهدف المستخدمة في التصوير، ب) من ذات دقة Z وج) نوعية تلطيخ النووي. ويبين الشكل 2D أمثلة للأجنة تصوير مع منظمة اوكسفام الدوليةالهدف 40X ل الغمر مع NA 1.30 و 0.21 ملم WD. تظهر الألواح المتوسطة تكبير للICMS حيث نوى الفردية والحدود بينهما ويمكن تمييز. إذا لم تكن تستخدم تلطيخ الحمض النووي (أي، هويشت، دابي، TO-PRO3، YO-YO1، الخ) القيم مضان لتقدير معلمات اكتساب يمكن تعديلها بشكل فردي للحصول على أفضل إشارة. تظهر لوحات أسفل كيف أكثر تقدما الجنين، وارتفاع الكثافة النووية، وبالتالي كلما زادت فرصة حدوث أخطاء تجزئة (رأس السهم والسهم). ويبين الشكل 3 أمثلة من الأخطاء التي MINS يمكن ارتكابها، مثل الكشف عن نوى أفكارك كما الخلايا الحية ( النجمة في لوحات في الشكل 3AA، أب، الإعلان)، والإفراط في تجزئة (السهم والنصال في الشكل 3AC) أو تحت تجزئة (السهم في الشكل 3AD). ويبين الشكل 3B سلسلة من Z-شرائح من حدث تحت تجزئة، حيث تم تحديد خليتين واحدة. لاحظ كيف يأخذ MINS تجزئة المحور Z بعين الاعتبار لتجزئة وحدة التخزين التي تضم جميع شرائح حيث خلية معينة موجودة.
وأخيرا، فإن تفاصيل تحليل البيانات تعتمد على المسألة قيد الدراسة، لذلك، مبادئ توجيهية لعملية التحليل لا يمكن أن تعطى هنا. ومع ذلك، فقد وجدنا بعض التحولات البيانات الأولية لتكون مفيدة الشكل 4B - D يظهر قطع القيم مضان للNANOG علامات وGATA6 في الحركة الدستورية الإسلامية الجنين هو مبين في الشكل 4A يبين الشكل 4B القيم مضان الخام تم الحصول عليها من MINS (بعد التصحيح اليدوي كيل والإفراط في تجزئة). ويبين الشكل 4C نفس البيانات بعد التحول لوغاريتمي، والذي يفصل بين القيم من مؤامرة محاور (تحول الجذر التربيعي هو ممكن أيضا وتعطي مؤامرة مماثلة). يبين الشكل 4D نفس البيانات بعد تلقائيا جorrecting القيم لتخفيف المرتبطة Z في مضان، كما هو موضح في الخطوة 4.5.2.2 من البروتوكول. وثمة أمثلة عن هذه مضان الاضمحلال المرتبط Z في الصورة في الشكل 4E والمؤامرات في 4F. ويبين الشكل 4G تأثير تحويل البيانات وأوضح في 4.5.2.2. تم إضافة الألوان التي تمثل إما الأديم الظاهر (أحمر، NANOG +، GATA6-) أو ما قبل (الأزرق وNANOG-، GATA6 +) الهوية في المؤامرة بوصفها وظيفة من NANOG والقيم GATA6. في هذا المثال بالذات، الخلايا حيث نسبة سجل [GATA6] / تسجيل [NANOG] اعتبرت> 1.25 المسبق الخلايا حيث نسبة سجل [GATA6] / تسجيل [NANOG] <اعتبرت 1 برنامج التحصين الموسع، والخلايا مع وسيطة واعتبرت نسبة غير ملتزم (لا يوجد في هذه الحالة). وقد فعلت كل التحولات البيانات والمؤامرات في Rstudio، ومع ذلك، فإن اختيار البرامج ليست حرجة، وسوف تعتمد على المستخدم النهائي.
الشكل 1. الأجنة الموقع، الجدول الزمني وتحليل خطوط الأنابيب. (A) تخطيطي واحد (اثنين) القرن الماوس الرحم ومراحل تطور سابق للانغراس، تتماشى مع منطقة القرن حيث ينبغي العثور عليها. (ب) الجدول الزمني التجريبي مع توقيت كل خطوة. يشار إلى الخطوات من البروتوكول ونقطة توقف (الأزرق). (ج) ملخص الحصول على الصور وخط أنابيب التحليل باستخدام MINS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. أمثلة المناعي والكثافة النووية. (A) أمثلة على النتائج المناعي جيدة مع الأجسام المضادة اختبار للجرارات النوويالعوامل anscription. تم الكشف عن مكافحة CDX2 مع AlexaFluor 488 حمار لمكافحة فأر الضد الثانوية، ومكافحة GATA6 مع AlexaFluor 568 حمار المضادة للماعز، ومكافحة NANOG مع AlexaFluor 647 حمار المضادة للأرنب، ومكافحة GATA4 (سانتا كروز، SC-9053 ) مع AlexaFluor 488 حمار المضادة للأرنب ومكافحة OCT4 مع AlexaFluor 647 حمار لمكافحة فأر. يتم سرد كافة الأجسام المضادة الأولية في جدول المواد. حشوية تلطيخ النووي GATA4 هو غير محددة، ويبدو أيضا في Gata4 الأجنة فارغة (لا يظهر). (ب) مثال المناعي جيد للبروتين حشوية، DAB2. وقد تم الكشف عن ذلك باستخدام AlexaFluor 488 حمار لمكافحة فأر. (C) مثال المناعي سيئة، مع انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء للعامل النووي. وقد تم الكشف عن GATA4 مع مضاد للGATA4 التي أثيرت في الماعز (سانتا كروز، SC-1237، في حين كان يستخدم SC-9053 (أرنب مكافحة GATA4) في الفقرة (أ)) وAlexaFluor 568 حمار المضادة للماعز. (
الشكل 3. أمثلة من أخطاء MINS. (A) تسلسل الفردية Z-مقاطع من جنين واحد تظهر أمثلة من أخطاء تجزئة MINS. وتتميز الخلايا أفكارك التي مع ذلك يدعى نوى بعلامة النجمة (*) في لوحات A و B و د. في لوحة ب، رقم # 39 (رأس السهم)، وإن كانت صغيرة جدا، لا تبين نواة المقابلة وبالتالي يمكن ترك غير المصححة. في لوحة ج، رقم # 66 (السهم) يمتد اثنين ن مختلفةuclei، والتي بدورها تم تحديدها بشكل منفصل (النصال، معرفات # 65 # 54 و # 53). في لوحة د، وقد تم تحديد خليتين (رقم # 63) واحدا واحدا (انظر السهم علامات الحدود رقيقة)، وبالتالي ينبغي تكرار هذا السجل لأغراض عد الخلايا. (ب) MINS بالكشف عن الخلايا على طول المحور Z. وتظهر الصور سلسلة من Z-شرائح اثنين من الخلايا التي تم وسجل خطأ واحدا واحدا (رقم 123). لاحظ كيف المنطقة الزرقاء ترسيم نوى مستمرة على طول Z. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. مثال على الإنقسام والبيانات التحولات. (A) صور من الخلايا ICM من الكيسة الملون لNANOG وGATA6 ولقطة من تجزئة النووية للنفسجنين باستخدام MINS على قناة تلطيخ النووية (هويشت 33342). (BD) NANOG ومضان GATA6 القيم في الخلايا ICM تقاس MINS خططوا كما البيانات الخام (B)، بعد أداء تحول لوغاريتمي (C) وبعد تصحيح قيم الاضمحلال مضان على طول المحور Z وتعيين تلقائيا هويات الخلية على أساس تصحيح القيم (D). (E - G) أمثلة على تصحيح البيانات لتسوس مضان على طول محور Z. (E) صور لالكيسة المسمى مع هويشت ومكافحة CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488)، والتي تبين انخفاض مضان على طول محور Z. (F) المؤامرات مبعثر القيم مضان على طول محور Z لهويشت وAF488 لمجموعة من الأجنة بما في ذلك واحد هو مبين في (E). يمثل خط رمادي منحنى الانحدار لكل مجموعة من القيم. (G) نفس البيانات كما في F بعد تعويض الاضمحلال مضان لكل خليةباستخدام عامل التالية: Z تنسيق * المنحدر من نموذج الخطي (راجع الخطوة 4.5.2.2 في البروتوكول). لوحات E - G نشرت أصلا من قبل المؤلفين في عقدة (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) تمثل كل نقطة خلية واحدة. مقياس = 20μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| إدخالات المستخدم |
| سطوع عتبة * (يسهل الكشف النووي في الصور المعتمة) |
| X النسبي / قرار YZ |
| قناة لقطاع |
| قطر النووي |
| مستوى الضوضاء صورة |
| MINS الناتج |
| تجزئة Z كومة مع nuclالصناعات الاستخراجية معرفات |
| حجم النووي |
| XYZ إحداثيات كل نواة |
| المتوسط، والجمع القيم مضان لكل قناة مضان ونواة |
| مزايا |
| تجزئة دقيقة (> 85٪) من نوى في جميع أنحاء كومة - يعترف كافة تواجدات في نواة المجاورة ض أقسام |
| قرار خلية واحدة |
| تجزئة غير خاضعة للرقابة من دفعات من الأجنة |
| يمكن أنابيب تجزئة إما حفظ وإعادة استخدامها أو تعديلها لكل جنين معين |
الجدول 1. MINS الميزات
| تحميل صورة | في موجه، ويعرض قرار النسبي Z لصورة. يمكن الحصول عليه من بيانات التعريف الملف باستخدام القارئ الافتراضي أو تطبيق الصيغة التالية: X (أو Y) قرار قرار / Z (كل في ميكرون). |
| أدخل رقم التسلسل (1-5) للقناة أن مجزأة. باستخدام قناة وصمة عار الحمض النووي للتجزئة وكشف جميع الخلايا في الصورة، ومع ذلك، قد تكون مجزأة قنوات أخرى بشكل منفصل أيضا. | |
| أدخل إطار لبدء تجزئة في (1 افتراضيا). ينطبق فقط على الملفات ذات أطر زمنية متعددة. | |
| تعزيز صورة (اختياري) | النقطة البيضاء والسوداء في الصورة يمكن تعديلها لتسهيل الكشف. عموما خفض النقطة البيضاء وإعادة التحجيم ل0-255 (للصور 8-بت) أو 0-4096 (للصور 12 بت) سيجعل صورة أكثر إشراقا وتسهيل الكشف عن نوى الخافتة. |
| كشف النوى | حدد قطر النووي المقدرة (بكسل عموما بين 30 و 40 في الكيسات الأريمية). |
| للصور صاخبة يمكن تعديل مستوى الضوضاء. خلاف ذلك، سيتم تطبيق القيمة الافتراضية. | |
| قطاع النوى | استخدام المعلمات الافتراضية. |
| صنف النوى | MINS يمكن التمييز الأديم الظاهر الغاذي (TE) من الداخلية كتلة الخلايا خلايا (ICM) في الأجنة قبل الغرس على أساس الموقف. ويمكن أيضا أن يتم ذلك يدويا أو على أساس مستويات مضان إذا تم استخدام علامة الشركة المصرية للاتصالات. |
| نتائج التصدير | حدد الملفات المراد إنشاؤها: |
| - مضافين تجزئة عبر قناة المستخدمة (و tiff ملف تسلسل)، | |
| - تجزئة فقط (و tiff ملف تسلسل)، | |
| - جدول مع معرفات لجميع خلايا الكشف، الإحداثيات XYZ ومستويات مضان (المتوسط والمبلغ) لجميع القنوات لكل خلية (ملف csv). | |
| جميع الملفات تصديرها بشكل افتراضي. يتم حفظ الملفات في الصورةدليل AME حيث توجد الصور. |
الجدول 2. MINS الإنقسام خط أنابيب
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإجراء التحليل الكمي من كامل جبل المناعي على سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس. ويتبع بروتوكول المناعي القوي 22 من ذات الدقة العالية، كلها جبل التصوير متحد البؤر وتجزئة الصورة باستخدام قطعة مصممة من برنامج 4. في حين أن اختيار بروتوكول المناعي ليست حرجة، نجد أن واحدة المعروضة هنا 22 لتكون سريعة وموثوق بها، وتوفير إشارة قوية لكثير من الأجسام المضادة اختبرناها. بروتوكولات أخرى يمكن اتباعها، شريطة تطبيقها متناسقة عبر تجارب مماثلة. في حين أن العديد من العوامل التي تؤثر على نتائج كل تجربة على حدة، ومقارنة مباشرة بين التجارب غير ممكن بالضرورة، وجدنا أن السعي من أجل التناسق عبر التكرار وأداء مكررات تقنية كافية يقلل بدرجة كبيرة من التباين. لذلك، مرة واحدة الأمثل، وتثبيت immunolabelinيجب أن تبقى الكواشف ز والبروتوكولات، فضلا عن ظروف التصوير المستمر بين التجارب ما يعادلها.
المشاكل الرئيسية التي قد تنشأ أثناء تطبيق هذا الخريف البروتوكول إلى مجموعتين: 1) ضعف تلطيخ الجودة، مع إشارة الخافتة، و 2) تجزئة دون المستوى الأمثل، مع العديد من الأخطاء (أي الإفراط وتحت تجزئة). جودة منخفضة المناعي بشكل عام بسبب تثبيت غير لائق من العينات أو الأجسام المضادة لا يجري مناسبة لالمناعي كله جبل. ضمان PFA الطازجة (إما طازجة أو إذابة إلى RT من -20 درجة مئوية لا تزيد عن الأسبوع السابق). ونظرا لصغر حجم الأجنة قبل الغرس، يجب تثبيت 10 دقيقة في PFA تكفي. ومع ذلك، فقد وجدنا بعض الأجسام المضادة لتسفر عن إشارة أقوى مع أوقات أطول التثبيت (انظر المواد). إذا الأجسام المضادة التي تم اختبارها سابقا يوفر إشارة ضعيفة، في محاولة بروتوكولات تثبيت مختلفة. ليس كل الأجسام المضادة أداء قويا على كامل جبل IMMunofluorescence واختيار من الأجسام المضادة الأولية هو أمر حاسم لنتائج التجربة. وينبغي اختبار الأجسام المضادة الجديدة على الأجنة وتركيز الأمثل تحديد تجريبيا. في الرسم البياني المواد التي نقدمها تفاصيل عدد من الأجسام المضادة اختبرناها واستخدام روتيني. الرجوع إلى الأدبيات المنشورة أو إلى معلومات الشركة المصنعة عند النظر الأجسام المضادة الجديدة. لاحظ أن ليس كل الأجسام المضادة مناسبة للعمل لطخة غربية في جبل لالجامع المناعي، وتركيزات اللازمة لالمناعي قد يكون النظام ما يصل إلى واحد من حجم أعلى. الأجسام المضادة الثانوية التجارية تعمل بشكل جيد عموما من خارج منطقة الجزاء، ولكن، أن تكون متسقة في استخدام نوعين من الأجسام المضادة الابتدائية المرحلة الثانوية في جميع أنحاء التجارب ما يعادلها التي هي على وشك أن مقارنة.
نوعية تجزئة الصورة تعتمد على كل من جودة تلطيخ النووي والكثافة النووية في الحركة الدستورية الإسلامية للجنين. نسعى دائما للمشرق،نوى حادة وتستخدم هدف عالية الدقة (40X أو أكثر). إذا كانت إشارة وصمة عار النووية منخفضة، واستخدام قسامة جديدة أو دفعة جديدة. نظرا لعدم استخدامها طالما وصمة عار النووية لتقدير، المعلمات الاستحواذ يمكن تعديلها لكل جنين من أجل تسجيل حادة، نوى مشرق. وبالمثل، إذا تم استخدام قناة أخرى من تلطيخ النووي للتجزئة، فإن نسبة من أن قناة معينة الإشارة إلى الضوضاء تحديد نوعية تجزئة. الكيسات الأريمية مرحلة متأخرة (E4.0 فصاعدا) يقدم كثافة النووية عالية جدا في الحركة الدستورية الإسلامية. ولذلك، فإنه في هذه المراحل أن جودة عالية تلطيخ هو الأكثر أهمية. ومع ذلك، فإن أخطاء تجزئة تجري في معظم الأحيان في هذه المراحل. تقديم قطر النووي المقدرة ومستوى الضوضاء الصورة على خط أنابيب MINS، واستكشاف نتيجة كل خطوة باستخدام "عرض" زر وضبط المعلمات حتى يتم الحصول على نتيجة مرضية. استخدام المعلمات التي تنتج أفضل تجزئةوتصحيح الأخطاء يدويا أثناء معالجة البيانات. لاحظ أن الأجنة مرحلة متأخرة (~ E4.5) لديها عدد خلايا عالية وتصحيح البيانات يدويا سيكون وقتا طويلا.
يتم تحديد أوجه القصور في هذا البروتوكول من قبل النظام المجهر متحد البؤر المستخدمة للحصول على صورة. كما ناقش، استخدم هدف عالية التكبير، مع مسافة العمل التي تسمح التصوير Z-محور الجنين بأكمله (سابق للانغراس الأجنة الماوس يمكن أن تصل إلى 150-160 ميكرون في القطر). وبالمثل، سيتم تحديد عدد الحواتم التي يمكن الكشف عنها من قبل عدد من القنوات المجهر يمكن الحصول على دفعة واحدة. باستخدام هذا البروتوكول، ثلاثة الحواتم مختلفة إلى جانب الحمض النووي (4 قنوات في المجموع) يمكن أن توصف في وقت واحد في كل عينة. تأكد من معايرة أداة لكل قناة مضان، هو الأمثل لالنابضة وأن انتاج الليزر هو ثابت.
الأساليب المذكورة هنا تسمح للتحليل موقف الخلية على طولXYZ المحاور وكذلك الكمي لمستويات بروتين تعبير في الموقع لكل خلية واحدة في الكيسات الأريمية الماوس. في تجربتنا، والطرق البديلة استخدام أي من البرامج الأخرى المتاحة لا يمكن أن توفر مستوى من القرار على أن خط أنابيب تطبيقها في هذا البروتوكول يمكن (انظر 4 لمقارنة مباشرة مع غيرها من الأدوات). الكثافة النووية العالية الموجودة في ICM من الكيسة تسبب أدوات أخرى لتوليد الكثير من الأخطاء التي ومدى التصحيح اليدوي المطلوبة يجعل استخدامها غير عملي. بدلا من ذلك، والقياسات عد الخلايا ومضان يدوية استخدمت في السابق لمجموعات فرعية من الخلايا أو مناطق محددة من الجنين 10،11،18،19،24. ومع ذلك، فإن العد والفرز اليدوي وقياس جميع القنوات مضان وموقف الخلية، في جميع محاور XYZ، لعشرات من خلايا موجودة في كل جنين يكون ذلك مضيعة للوقت أنه لن يسمح لتحليل الإنتاجية العالية التي تم وضعها بروتوكول لدينا . وعلاوة على ذلك، يدويssessment مستويات مضان هو عرضة للتحيز، في حين أن خط أنابيب مثل واحد هو موضح هنا يسمح للقياس الموضوعي لشدة مضان لقرار لاحق من هوية الخلية. من أجل تعيين هوية الخلية، المحقق أن تضع معيارا القياسي ليتم تطبيقها في جميع العينات لالتجريبية معينة اقامة. وبالنظر إلى العوامل المختلفة - البيولوجية والتقنية - التي يمكن أن تؤثر على نتائج immunolabeling، ينبغي تحديد هذا المعيار باستخدام التجارب المراقبة المناسبة والبيانات التي تم نشرها مسبقا كلما كان ذلك ممكنا. نحن نتصور المستقبل القريب حيث يمكن تصميم خوارزمية لتحديد التلقائي للهوية الخلية بغض النظر عن التجربة. ومع ذلك، فإن هذه الأداة تأتي فقط من تطبيق أكثر شمولا وتحسين الطريقة الحالية، وعلى الأرجح إلى جانب خوارزميات تعلم الآلة.
وأخيرا، نظرا لبساطة هذا الخط وmorphol النمطيةogy من أجنة الفئران قبل الغرس، وهذا البروتوكول هو تحجيم بسهولة لتحليل عدد كبير من الأجنة، مما يسمح عالية الإنتاجية تحليل الظواهر فارغة 5،6 أو أي تلاعب التجريبية 7. وأخيرا، في حين أن البروتوكول الحالي وقد تم تصميم والأمثل لتحليل أجنة الفئران قبل الغرس والمستعمرات ESC، ونحن لا نرى أي سبب مسبق لماذا لا يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى ذات خصائص مماثلة - الكثافة النووية وهي عالية. ونحن نشجع الآخرين على التجربة والتكيف مع هذا البروتوكول لسيناريوهات أخرى وتقديم التغذية الراجعة للتحسين في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
