Summary
Ce protocole présente un procédé pour effectuer, une seule cellule dans l'analyse quantitative in situ de l'expression des protéines à l'étude de la spécification lignée dans des embryons de pré-implantation de la souris. Les procédures nécessaires pour la collecte des blastocystes, entiers montage détection par immunofluorescence de protéines, l'imagerie d'échantillons sur un microscope confocal, et la segmentation nucléaire et l'analyse d'images sont décrites.
Abstract
Ce protocole présente un procédé pour effectuer quantitative, unicellulaire analyse in situ de l'expression de la protéine à l'étude de la spécification lignée dans les embryons préimplantatoires de souris. Les procédures nécessaires à la collecte des embryons, immunofluorescence, l'imagerie sur un microscope confocal, et la segmentation d'images et l'analyse sont décrits. Cette méthode permet la quantification de l'expression de marqueurs nucléaires multiples et le spatial (XYZ) les coordonnées de toutes les cellules de l'embryon. Il tire profit de MN, un outil logiciel de segmentation d'image spécifiquement développé pour l'analyse des images confocales d'embryons préimplantatoires et les cellules souches embryonnaires (ESC) colonies. MN effectue une segmentation nucléaire non supervisé pour les directions X, Y et Z dimensions, et produit des informations de position de cellule dans l'espace à trois dimensions, ainsi que les niveaux de fluorescence nucléaire pour tous les canaux d'entrée minimale de l'utilisateur. Bien que ce protocole a été optimisée pour l'analyse des imagesde pré-implantatoire des embryons de souris de stade, il peut facilement être adapté à l'analyse de tous les autres échantillons présentant un bon rapport signal sur bruit et où la densité nucléaire à haute constitue un obstacle à la segmentation d'images (par exemple., analyse de l'expression des cellules souches embryonnaires (ESC ) colonies, la différenciation des cellules en culture, les embryons d'autres espèces ou de stades, etc.).
Introduction
L'embryon préimplantatoire de souris est un modèle pour étudier l'émergence et le maintien de la pluripotence in vivo, ainsi que d'un modèle pour l'étude de la spécification du destin cellulaire et de novo épithélialisation chez les mammifères. Les étapes de pré-implantation du développement des mammifères sont dédiés à la mise en place des trois lignées cellulaires qui composent le blastocyste, à savoir l'épiblaste pluripotentes - qui donne lieu à la plupart des tissus somatiques et les cellules germinales - et deux lignées extra-embryonnaires, le trophectoderme (TE) et endoderme primitif (PRE) (figure 1A) 1,2. Ce protocole décrit les procédures à (1) des embryons de souris récolte et fixer stade préimplantatoire, (2) effectuer immunofluorescence pour marquer des protéines d'intérêt, (3) d'effectuer l'ensemble du montage imagerie utilisant un microscope confocal avec des capacités et des z-sectionnement (4) effectuer la segmentation nucléaire d'images confocale et analyse d'image quantitative ultérieure. Ce pipeline permet til impartiales mesure des niveaux de protéines pour l'attribution des identités de cellules de caractériser les sous-populations de cellules in situ. Ce protocole peut être effectuée en moins de 3 à 4 jours pour un même portée (généralement jusqu'à 10 embryons de souris), de la collecte d'embryons à l'analyse de données (figure 1B). L'analyse simultanée de plusieurs portées augmenterait l'imagerie et l'analyse des données charge de temps, prolongeant ainsi la longueur totale du protocole.
L'embryon de souris au stade préimplantatoire est un système expérimental traitable qui, compte tenu de sa petite taille et la morphologie stéréotypée 3, est bien adapté pour l'imagerie de toto de processus cellulaires avec une résolution seule cellule. Pour mener à bien un impartiale, l'analyse au niveau des systèmes d'un nombre statistiquement pertinent d'embryons, un système automatisé, d'un pipeline d'analyse quantitative est souhaitable. Cependant, en raison de la densité élevée nucléaire de la masse cellulaire interne (ICM) du blastocyste (
Le pipeline d'analyse présentée ici tourne autour de l'outil de segmentation d'image basé sur MATLAB modulaire Interactive segmentation nucléaire (MIN) 4. MN performs segmentation nucléaire sans surveillance sur des lots importants de Z-piles confocale après que l'utilisateur a établi un nombre minimal de propriétés de l'image, en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) (tableau 1) 4. Ce pipeline est avéré efficace pour la génération de données à haut débit sur l'expression des protéines et la localisation cellulaire à la fois de type sauvage, expérimentalement traitée et les embryons et les CES 5-7 génétiquement modifié. Dans le présent protocole, nous décrivons l'application de minutes pour la segmentation d'images d'embryon préimplantatoire stade. Pour des exemples de performances mn à CES s'il vous plaît se référer à 4,7. L'étape automatisée de segmentation nucléaire permet de réduire considérablement la charge de temps du processus d'identification de cellule, alors que les mesures spatiales et intensité de fluorescence permettent une détermination objective des identités de cellules et la production de cartes en trois dimensions de domaines d'expression génique et la position des cellules dans l'embryon (figure 1C 5,6. MN est disponible gratuitement au http://katlab-tools.org (le logiciel nécessite une licence MATLAB).
Aucune approche développée à ce jour permet la génération de ces données en profondeur sur l'expression des protéines et la localisation cellulaire dans des embryons de pré-implantation de la souris. Toutes les tentatives jusqu'à présent à quantifier ces types de données ont été limitées à la détermination manuelle et la quantification du nombre de cellules pour différentes populations dans l'embryon (soit entièrement manuellement, ou un logiciel assistée) 9-19. Cette approche (intégrant le logiciel MN) a été adapté et testé sur les embryons et les CES préimplantatoires souris; néanmoins ses performances sur d'autres systèmes à forte densité nucléaire, mais encore non testé, devrait être équivalent.
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Protocol
déclaration éthique: Tous les travaux des animaux, y compris l'élevage, l'élevage et le sacrifice a été approuvé par des institutionnels animal soin et l'utilisation Comité de Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC), protocole # 03-12-017.
1. Embryon Collection
Remarque: Tous les travaux de l'animal doit avoir été approuvé par les autorités institutionnelles et locales et conforme aux règles locales et institutionnelles.
- Accoupler une souris femelle vierge avec un mâle de goujon fertile des génotypes souhaités.
Remarque: Si la mise en place des accouplements naturels, la sélection des femelles dans la phase oestrus du cycle Estral augmente les chances de la copulation sur la date souhaitée. Si induire une superovulation, s'il vous plaît se référer aux protocoles décrits dans les 20. - Vérifier la présence d'un bouchon vaginal le matin à l'aide d'une sonde mousse. Idéalement, le faire avant midi (12h00), des bouchons de copulation sont perdus pendant la journée. Considérez noon de détection du bouchon vaginal jour embryonnaire (E) 0,5.
- Le jour et l'heure du développement embryonnaire désiré, réchauffer M2 ou le rinçage support de retenue (FHM) à la température ambiante ou, de préférence, 37 ºC. Remarque: Soit M2 ou FHM peuvent être utilisés pour le rinçage et d'embryons de manutention. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, stocker ces médias à 4 ºC. Estimer l'utilisation de ~ 2 ml de milieu pour chaque utérus.
- Décongeler paraformaldéhyde 4% (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) ou de préparer une solution fraîche. Estimer 500 pi de solution à 4% PFA par puits d'une plaque 4 puits. Fixer une portée sur chaque puits d'une plaque 4 puits. Remarque: Alternativement, une plaque de 96 puits peut être utilisé pour fixer et la conservation des embryons. Si vous utilisez une plaque de 96 puits, utiliser 100 pi de solution PFA par puits.
- Tirez une pipette Pasteur en verre à l'aide d'une flamme nue pour dessiner un fin capillaire à la pointe.
- Sacrifier femme par dislocation cervicale ou inhalation de CO 2, ou tel que requis par les réglementations locales et institutionnelles. Il est souvent desirable pour confirmer l'euthanasie de l'animal par dislocation cervicale.
- Pulvériser le ventre de l'animal avec 70% d'éthanol afin de minimiser la perte de cheveux et d'effectuer une incision abdominale, d'abord à travers la peau, puis à travers la paroi du corps (péritoine) pour exposer les viscères.
Remarque: Les étapes suivantes décrivent la procédure pour recueillir des blastocystes de l'utérus d'une souris femelle enceinte à tout moment entre E3.25 et E4.5 (figure 1A). Pour les protocoles sur la collecte d'embryons préimplantatoires plus tôt que E3.25, reportez-vous à 20. - Localiser l'utérus et de retirer de l'animal. En tenant l'extrémité du col de l'utérus avec une paire de pinces, couper à travers le col de l'utérus et tirez doucement pour étirer les deux cornes utérines.
- Enlevez le gras de l'utérus, en prenant soin de ne pas percer la paroi utérine. Ceci peut être réalisé facilement au moment de la dépose, tout en restant fixée sur le corps de l'animal, comme l'utérus peut être étendu. Alternativement, ilpeut être fait plus tard, sous un microscope de dissection, en RT PBS. Pour un protocole plus détaillé sur la dissection de l'utérus, voir Protocoles 5 & 8 20
- Coupez-dessus des trompes, les ovaires ci-dessous, pour libérer tout l'utérus, les placer sur une boîte de Pétri et couvrir avec du PBS.
Remarque: Cette étape permet également le lavage de l'excès de sang ou d'autres débris de l'utérus, ce qui facilite blastocyste ultérieure récolte. - cornes utérines séparées en coupant à la fois à travers l'extrémité proximale, des deux côtés du col de l'utérus et du col jeter. Séparer chaque oviducte de l'utérus en coupant au-dessous de l'isthme entre elles (figure 1A) se connecte. Transférer les deux cornes d'une goutte de milieu de manipulation (soit M2 ou FHM) pour la collecte et la manipulation des embryons.
- Sous un microscope de dissection, rincer blastocystes sur l'utérus et dans le milieu en forçant 0,5 - 1 ml de M2 ou FHM dans chaque corne utérine de l'ouverture du col utérin. Utilisez un 1ml seringue avec une aiguille hypodermique. Remarque: L'aiguille peut être émoussée en utilisant une pierre de dépôt pour éviter de déchirer l'utérus, bien que cela ne soit pas critique. Un schéma détaillé de l'utérus rinçage peut être trouvée dans 21.
- Utilisation du microscope de dissection, localiser les blastocystes, qui seront dispersés dans la goutte de milieu. Prévoyez un maximum de 1 à 2 min de blastocystes à couler au fond de la boîte après le rinçage. Utilisation de la bouche-contrôlée, Pasteur en verre pipette avec une extrémité capillaire, de collecter toutes les blastocystes et les transférer à une nouvelle baisse des médias.
- Rincer blastocystes en les déplaçant à travers 2 - 3 gouttes de M2 frais ou FHM. Déplacez embryons en groupes de 5 - 10 blastocystes à la fois.
Remarque: Déplacement les grands groupes à un moment permettra d'accélérer le processus, mais il permettra également d'augmenter les chances de perdre accidentellement de nombreux embryons. Si non formés à l'utilisation de pipettes de bouche-contrôlée, pratiquer la manipulation d'embryons et le transfert devrait être considéré avant beginning l'expérience. - Retirer la zone pellucide (ZP) à partir de blastocystes non éclos (généralement <E4.0) par brièvement les laver dans une solution de Tyrode acide. Dès que la ZP est plus visible, transférer blastocystes retour aux médias de manipulation. ne garder que des embryons dans l'acide Tyrode aussi longtemps que strictement nécessaire, afin d'éviter d'endommager les cellules.
- Prenez soin lors de la manipulation des blastocystes dénudées, car ils adhèrent très facilement aux surfaces de verre et de plastique. moyen de manipulation contient 4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) pour empêcher la fixation, mais l'acide Tyrode ou PBS ne sont pas, par conséquent, de réduire le risque de dommage ou de perte des embryons ne ramassent pas plus de 2 - 5 blastocystes dénudées à un moment où les manipuler dans PBS BSA-libre ou sans sérum ou de l'acide Tyrode.
Remarque: Vous pouvez également recouvrir la pipette en verre avec 1% de BSA avant utilisation pour réduire l'adhérence des embryons à la surface du verre.
- Prenez soin lors de la manipulation des blastocystes dénudées, car ils adhèrent très facilement aux surfaces de verre et de plastique. moyen de manipulation contient 4 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) pour empêcher la fixation, mais l'acide Tyrode ou PBS ne sont pas, par conséquent, de réduire le risque de dommage ou de perte des embryons ne ramassent pas plus de 2 - 5 blastocystes dénudées à un moment où les manipuler dans PBS BSA-libre ou sans sérum ou de l'acide Tyrode.
- Napper le fond de chaque puitsd'un 4-même boîte de culture de tissu d'une fine couche de 1% d'agar, 0,9% de NaCl pour empêcher embryons d'adhérer à la matière plastique. En variante, ajouter 4 mg / ml de BSA à la PBS (PBS-BSA).
- Remplir un puits de la 4-même boîte de culture tissulaire revêtues avec 500 pl de PBS RT (ou PBS-BSA) et un autre puits avec 500 pl de 4% de PFA dans du PBS.
- Rincer blastocystes en RT PBS et fixer dans 4% PFA dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Transfert à PBS (ou PBS-BSA) après fixation.
- Si les embryons ne vont pas être traitées immédiatement, couvrir la PBS contenant les embryons avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation (conduisant à la dessiccation de l'échantillon) et stocker la plaque à 4 ° C.
Remarque: Les méthodes et les temps de fixation différentes peuvent être utilisées en fonction de l'expérience, les epitopes d'intérêt et les anticorps à utiliser. Quelle que soit la méthode de choix, être cohérent tout au long des expériences équivalentes pour faciliter la comparaison ultérieure des résultats de la coloration.
Note: Pausepoint: Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C dans du PBS pendant plusieurs semaines avant de procéder à l'étape suivante. Assurez-PBS est stérile et / ou ajouter 100 U / ml de pénicilline + 100 pg / ml de streptomycine (Pen-Strep) pour prévenir la contamination bactérienne (en particulier lors de l'utilisation du PBS-BSA) en prévision d'un stockage prolongé.
2. immunofluorescence
- Effectuer immunofluorescence en utilisant un protocole qui a déjà été testées et éprouvées pour être robuste pour toute monture immunofluorescence. Note: Nous vous recommandons ceux décrits dans 22 et 11. Dans le présent article, l'ancien sera décrite. Quelle que soit la méthode de choix, être cohérent tout au long des expériences équivalentes pour faciliter la comparaison des résultats de la coloration.
- Utilisez un flexible, vinyle, U-plaque de fond clair, 96 puits pour effectuer les étapes successives du protocole d'immunofluorescence. Remplir chaque puits avec 50 - 100 pi de solution et déplacer les embryons d'une solutionà l'autre en utilisant une pipette bouche en forme de L. Remarque Cette approche réduit l'utilisation de réactifs et facilite les mesures de suivi ainsi que la coloration en parallèle de plusieurs groupes expérimentaux.
- Facultatif: Enduire le fond des puits d'une fine couche de 1% d'agar, 0,9% de NaCl pour empêcher l'adhérence des embryons à la matière plastique. Ne pas ajouter de BSA aux solutions d'immunofluorescence.
- Préparer PBX (0,1% de Triton X-100 dans du PBS). Si anticiper la performance de plusieurs expériences d'immunofluorescence, préparer 50 ml de PBX et conserver à 4 ° C entre les expériences.
- Préparer une solution de perméabilisation (0,5% de Triton X-100, 100 mM de glycine dans du PBS). Faire 1 ml (ou selon le montant nécessaire) de la solution de perméabilisation frais pour chaque expérience.
- Préparer une solution de blocage (sérum de 2% de cheval (HS) ou 20% de sérum bovin fœtal (FBS) à Pen-Strep dans du PBS). Préparer 10 ml et conserver à 4 ° C entre les expériences.
- Aucune différence n'a été observée entre soitType de sérum, cependant, être cohérent dans le choix de la solution de blocage utilisée pour des expériences équivalentes.
- Rincer embryons fixes pendant 5 min à température ambiante dans PBX (~ 100 ul).
- Perméabiliser les embryons pendant 5 min à température ambiante dans une solution de perméabilisation (~ 100 ul).
- Rincer les embryons pendant 5 min à température ambiante dans PBX (~ 100 ul).
- embryons de bloc pendant 30 minutes à 1 heure à température ambiante à environ 100 ul de solution de blocage. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
Remarque: Les embryons peuvent être bloquées jusqu'à O / N périodes à 4 ºC, sans amélioration notable ou au détriment par rapport à 30 min étapes de blocage. - Incuber les embryons O / N à 4 ° C dans l'anticorps primaire / anticorps dilué dans une solution de blocage (~ 100 pi). Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
- Déterminer la dilution optimale pour chaque anticorps primaire à l'avance. La grainesection iscussion et matériaux pour dilutions testées d'un certain nombre d'anticorps.
- Après O / N incubation, rincer embryons 3x pendant 5 minutes chacun à la température ambiante dans PBX (~ 100 pi).
- embryons de bloc pendant 30 minutes à 1 heure à température ambiante à environ 100 ul de solution de blocage. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
- Incuber embryons pendant 1 à 2 heures à 4 ° C en anticorps secondaire / anticorps diluée à 4 pg / ml dans environ 100 ul de solution de blocage. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
- Rincer embryons 2x pendant 5 minutes chacun à RT dans PBX.
- Déplacez embryons à tache d'ADN préférée. Si l'on utilise Hoechst 33342, dilué à 5 pg / ml dans du PBS. Couvrir la solution avec une couche d'huile minérale pour éviter l'évaporation ou de garder dans une chambre humidifiée.
Remarque: Pause Point: Si les embryons ne sont pas visualisés immédiatement, ils peuvent être conservés pendant up à plusieurs semaines dans une solution de coloration nucléaire. Dans ce cas, assurez-PBS est stérile et / ou ajouter Pen-Strep ou azoture de sodium pour empêcher la croissance bactérienne et la contamination.
3. imagerie confocale
Remarque: Les configurations de microscope confocal individuels auront besoin les paramètres d'acquisition spécifiques à régler pour le système et les logiciels en place. Toutefois, la section suivante fournit un ensemble de règles générales à suivre qui devrait être applicable à toute installation donnée.
- En utilisant une pipette bouche bien, faire microgouttes de PBS ou de solution de colorant nucléaire sur la surface de verre d'un plat à fond de verre de 35 mm et couvrir avec de l'huile minérale. Comme alternative, utiliser une lamelle régulier avec séparateurs en silicone pour éviter d'endommager les embryons et couvrir avec une lame de microscope en verre. Note: Lorsque vous utilisez une lamelle régulière, les embryons ne peuvent être ensuite repositionnés ou récupérés pour le génotypage, par conséquent, nous recommandons fortement l'utilisation d'un fond en verrevaisselle.
- La place des embryons dans les microgouttes et organiser de manière cohérente, de préférence avec l'axe ICM-cavité parallèle à la surface du verre. Mettre en place plat sur le porte-microscope. Remarque: Les images obtenues à balayage laser confocal souffrent de microscopes une perte d'intensité de fluorescence de l'axe Z associé. Par conséquent, la cohérence dans l'arrangement est important pour comparer les intensités entre les régions équivalentes sur différents embryons.
- Définissez les paramètres de référence utilisant des embryons de type sauvage qui n'a pas fait l'objet de toute sorte de traitement qui peut modifier l'expression des gènes.
- Acquérir des images en utilisant un objectif à fort grossissement (c.-à-40X ou ultérieure) afin d'obtenir des données qui faciliteront segmentation précise en utilisant l'outil MINUTES 4.
Remarque: L'utilisation du zoom numérique sur un objectif 20X ne donnera pas des images de résolution adéquate pour la segmentation en utilisant MIN. Il faut également noter la distance de travail (WD) de l'objectif, comme il se doitsuffisante pour permettre l'acquisition d'un Z-pile qui traversent tout le blastocyste, donc une longue WD (~ 130 à 150 um) objectif est habituellement nécessaire. Les images montrées sur les Figures 2 - 4 ont été acquises à l'aide d'une huile 1,30 objectif à immersion 40X / NA avec une distance de travail de 210 um. - Utiliser la sortie bas du laser qui fournit un rapport fort rapport signal-bruit sans blanchiment des fluorophores.
- Régler le gain et l'offset pour obtenir la plage dynamique plus large sans surexposer l'échantillon. Exposer les images pour couvrir la majeure partie de, ou couvrent l'ensemble, gris plage d'échelle facilitera la détection de petites différences d'intensité entre les images.
- Utilisez un petit (1 pm) Z-étape, depuis la résolution de l'axe Z est essentiel pour la segmentation précise avec MIN.
Remarque: dimensions XY n'affectent le processus de segmentation nucléaire, que la taille du fichier d'image. En général, 512 x 512 pixels est une résolution XY suffisante pour des images de qualité publication sans compromichanter espace disque. - Étape critique: Gardez imagerie paramètres cohérents dans et entre les séances d'imagerie de la même expérience de manière à être en mesure de comparer des échantillons.
- Acquérir des images en utilisant un objectif à fort grossissement (c.-à-40X ou ultérieure) afin d'obtenir des données qui faciliteront segmentation précise en utilisant l'outil MINUTES 4.
- Imagerie lots d'embryons:
- groupes d'image cohérente (litières, expériences) en une seule session chaque fois que possible.
- Gardez paramètres cohérents dans et entre les séances d'imagerie pour les répétitions de la même expérience.
- embryons de l'image à travers (axe Z ensemble) pour capturer chaque cellule.
Remarque: Si vous le souhaitez, embryon génotypage peut être fait après l'imagerie comme décrit dans 23. La nécessité d'une PCR nichée doit être déterminée empiriquement et dépend du locus à analyser et les amorces utilisées.
- Assurez-vous d'être en mesure de correspondre à des embryons à des images de manière rétrospective.
4. Analyse d'image et des données de pré-traitement
- Télécharger et installer MINUTES 4 à partir de http: // katlab-tools.org (licence MATLAB nécessaire).
- Effectuer la segmentation d'images:
- Suivez l'interface utilisateur graphique (GUI) de minutes pour charger une image confocale ou empiler partir du disque dur, de détecter les noyaux et segmenter l'image. Charger l'ensemble Z-pile de données brutes générées par le microscope (.lsm, .lif, .oif, etc.). Voir le tableau 2 pour plus de détails sur chaque étape et les instructions figurant sur http://katlab-tools.org et 4. Une fois terminé, voir le résultat de chaque étape en cliquant sur le bouton correspondant "Affichage". Une étiquette jaune au-dessus du bouton indique l'opération en cours, une étiquette verte indique opération achevée.
Remarque: MN actuellement ne supporte pas les fichiers .czi, .tiff séquences ou des fichiers multi-positions - chaque Z-pile doit être un fichier indépendant. - Après segmentation satisfaisante, sauver le pipeline créé de sorte qu'il peut être utilisé directement pour d'autres embryons ou portées.
- Suivez l'interface utilisateur graphique (GUI) de minutes pour charger une image confocale ou empiler partir du disque dur, de détecter les noyaux et segmenter l'image. Charger l'ensemble Z-pile de données brutes générées par le microscope (.lsm, .lif, .oif, etc.). Voir le tableau 2 pour plus de détails sur chaque étape et les instructions figurant sur http://katlab-tools.org et 4. Une fois terminé, voir le résultat de chaque étape en cliquant sur le bouton correspondant "Affichage". Une étiquette jaune au-dessus du bouton indique l'opération en cours, une étiquette verte indique opération achevée.
- Batch-Mode segmentation:
Remarque: Sifichiers NGLE peuvent être segmentés individuellement. Toutefois, étant donné que les embryons dans une litière ou de l'expérience sont généralement de stade comparable, MN peut appliquer le pipeline de segmentation créé pour une seule image à un groupe d'entre eux sans supervision.- Dans le menu Batch-Mode Run, cliquez sur "Ajouter des fichiers" et de charger tous les fichiers à traiter à la fois. Remarque: Les fichiers provenant de différentes sources peuvent être ajoutés à la file d'attente de segmentation.
- Cliquez sur «Démarrer en mode batch Run 'et laisser le temps pour le logiciel pour traiter les fichiers. Remarque: La sortie de la segmentation sera enregistré dans le même répertoire que les fichiers d'origine où ils sont situés.
- évaluation de la segmentation et de correction manuelle
Remarque: MINS segments des images avec une précision très élevée (> 85%), cependant, la qualité de la coloration et de l'imagerie, ainsi que le stade de l'embryon, peuvent affecter les performances MIN. En général, plus la densité nucléaire au sein de l'embryon, les erreurs de segmentation plus susceptibles prendra place (figures 2D, 3). Ainsi, la précision de la segmentation doit être évaluée pour chaque échantillon et une correction manuelle si nécessaire. Deux types d'erreurs se produisent généralement: sur-segmentation et la sous-segmentation.- Résoudre sur-segmentation:
- Identifier les faux positifs - vésicules apoptotiques (figure 3A a, b, d, astérisques) ou d'autres éléments qui ne sont pas noyaux intacts, mais qui peuvent avoir été identifié comme tel par MIN.
Remarque: En général, ces faux positifs ont une taille inférieure à celle de véritables noyaux et peuvent, dans la plupart des cas, être facilement identifiés et classés sur la feuille de calcul. Toutefois, l'examen visuel est fortement recommandé, comme souvent noyaux peuvent être que partiellement segmentés, résultant en une, mais le volume segmenté valide plus petit (figure 3A b, tête de flèche). - Supprimer les enregistrements correspondants pour faux positifs du fichier * statistics.csv. * Préserver les statistiques originales.csv pour référence future et modifier seulement une copie de celui-ci.
- Si un noyau a été trop segmenté et présenté comme 2 ou plusieurs noyaux (figure 3A c, flèche et pointes de flèches), soit fusionner les enregistrements en faisant la moyenne de leur niveau d'intensité ou, si semblables, garder l'un des enregistrements pour cette cellule et jeter le le repos.
- Identifier les faux positifs - vésicules apoptotiques (figure 3A a, b, d, astérisques) ou d'autres éléments qui ne sont pas noyaux intacts, mais qui peuvent avoir été identifié comme tel par MIN.
- Résoudre les sous-segmentation:
- Identifier les événements où MIN n'a pas réussi à détecter la frontière entre deux ou plusieurs noyaux, et par conséquent leur segmentation en un seul noyau (figure 3A D, la flèche et 3B). Remarque: Cela pose un problème pour un nombre de cellules précises, mais plus important encore, pour quantifier les niveaux de protéines, comme les niveaux mesurés seront la moyenne des cellules qui ont été à tort fusionné, et qui peuvent appartenir à différentes lignées.
- Identifier les événements où MIN n'a pas réussi à détecter un noyau complètement.
- Dans ces cas (4.4.2.1 et 4.4.2.2), mesurer les niveaux de gris moyens fou chaque canal dans la cellule (s) sous ou non-segmenté en utilisant un outil alternatif, tels que ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), et remplacer la enregistrement erroné avec les niveaux corrects. Préserver le fichier * statistics.csv original pour référence future et modifier uniquement une copie de celui-ci. Pour ce faire en utilisant ImageJ, procédez comme suit:
- Ouvrez la pile multi-canal correspondant sur ImageJ et importer le fichier overlaid.tiff * correspondant généré par MN comme une pile virtuelle ( "Fichier"> "Importer"> 'TIFF de pile virtuelle ...).
- Trouvez une section médiane du noyau sous- ou non segmenté.
- Utilisation de l'outil de sélection à main levée esquisser le périmètre du noyau sous- ou non segmenté sur la chaîne ADN tache.
- Appuyez Crl + M (Cmd + M sur un Macintosh) ou allez dans le menu Analyser et sélectionnez «mesure». Cette action va enregistrer la valeur de gris moyenne pour la zone délimitée et l'afficher sur une nouvelle fenêtre. Allez sur "Analyser">9; Set mesures ... »et assurez-vous 'valeur moyenne grise» est sélectionné. Sélectionner d'autres paramètres à mesurer.
- En utilisant la même zone délimitée dans l'étape 4.4.2.3.3, répéter la mesure pour chacun des canaux de fluorescence d'intérêt. Les résultats seront ajoutés à la précédente sur la fenêtre de résultats de mesures.
- Utilisez les mesures obtenues pour remplacer les enregistrements erronés dans le fichier * statistics.csv. Si le noyau n'a pas été segmenté, insérer une nouvelle ligne, de lui attribuer un nouveau numéro de cellulaire et introduire les valeurs obtenues dans ImageJ dans la colonne correspondante pour chaque canal. Cette cellule aura pas coordonnées spatiales (et les valeurs de Z X, Y). Si le noyau avait été undersegmented, dupliquer sa rangée, attribuer différents identifiants cellulaires à chaque nouvelle cellule et d'introduire les valeurs obtenues dans ImageJ dans la colonne correspondante. Dans ce cas, les deux cellules se partageront coordonnées spatiales.
Remarque: Si la distribution spatiale doit être analysé, nous recommand excluant les coordonnées XYZ de ces cellules, comme ils se chevauchent. A cet effet, lors de la création de nouveaux records, céder identifiants cellulaires à ceux qui sont faciles à distinguer de ceux d'origine (pour les numéros exemple, non entier).
- Note cellules en division. Remarque: MN détecte mitotique ainsi que les noyaux en interphase, mais ne peut pas les distinguer.
- Si noyaux mitotiques doivent être considérés séparément dans l'analyse, marquer manuellement ceux-ci et ajouter ces informations dans le fichier de données. Pour enregistrer les cellules en mitose, ajouter une nouvelle variable (colonne) dans le fichier de données de statistics.csv * et affecter des valeurs différentes pour mitotique et interphase noyaux.
- Résoudre sur-segmentation:
- Les données de pré-traitement.
Note: Une fois que les feuilles de calcul ont été corrigées pour les sur- et sous-segmentation ils sont prêts à être analysés. Le processus d'analyse et de présentation de données dépendent de l'expérience spécifique. Cependant, voici quelques transformations générales de donnéesnous recommandons d'effectuer avant l'analyse:- Transformer les valeurs d'intensité de fluorescence dans leur logarithme ou racine carrée de réduire la dispersion des données. Cela permet également la visualisation, que les données brutes ont tendance à se concentrer à proximité des axes de la parcelle (voir la figure 4B, C).
- Corriger l'atténuation de Z-associé de la fluorescence:
Remarque: L'intensité de fluorescence à balayage laser d'images de microscopie confocale diminue le plus profond sur l'axe Z se trouve une tranche (figure 4E, F).- Si l'un des épitopes détectés dans les échantillons est un marqueur nucléaire ménage omniprésente et homogène exprimé, normaliser les intensités de fluorescence des autres épitopes en divisant leurs valeurs dans chaque cellule par la valeur correspondante du marqueur de ménage.
- En l'absence d'un tel repère de référence, compenser la perte de fluorescence de la façon suivante Z-associé:
- Tracer les valeurs de chaque marqueur (Yaxe du graphique) sur la position Z (axe X du graphique) pour visualiser la diminution de l'intensité sur Z - parcelle ensemble les valeurs de tout contrôle, les embryons de type sauvage (figure 4F).
- Ajuster un modèle linéaire (courbe de régression) à l'intrigue obtenu à l'étape précédente (valeurs d'intensité sur Z) pour chaque marqueur (figure 4F).
- Corriger toutes les valeurs pour chaque marqueur en utilisant la formule suivante:
log (valeur d'origine) + Z * pente du modèle (figure 4D, G).
Remarque: Les étapes spécifiques pour effectuer cette correction dépend du logiciel d'analyse utilisée (R, MATLAB, etc.). Si vous utilisez R, exécutez la formule suivante pour ajuster un modèle linéaire pour les données:
> Lm (log (canal) ~ Z, data = dataframe)
où, le canal est le canal de fluorescence à corriger, Z est la coordonnée Z et dataframe est le tableau contenant toutes les valeurs de l'embryon souhaité (s) (l '* statistics.csv fichier généré par MN ou une modification de celui-ci).
Remarque: La sortie de la formule ci-dessus a le format suivant:
(Intercept) Z
4,76373 -0,01947
où, la valeur Z est la pente de la droite de régression pour ce jeu de données, dont la valeur absolue doit être utilisé pour modifier la valeur d'origine avec la formule donnée dans 4.5.2.2.3 (voir Figure 4G pour un exemple).
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Representative Results
Pour faciliter l'interprétation des données et de la présentation, il faut prendre soin de ne pas endommager les embryons lors de la collecte et de la manipulation, de sorte que toutes les cellules et leur position relative peuvent être analysés Figure 2A -. D montre des exemples de blastocystes intacts à différents stades avec une cavité élargie. En cas de dommage, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l'analyse et l'interprétation des résultats.
La qualité et la fiabilité des données produites en utilisant ce protocole est tributaire de la qualité de la fixation et du rapport signal sur bruit des anticorps utilisés pour détecter les protéines d'intérêt. Toujours utiliser fixateur frais et tester de nouveaux anticorps, avec des contrôles positifs et négatifs appropriés, avant de commencer une série d'expériences. La figure 2A montre des exemples de bonnes anticorps pour un certain nombre de protéines nucléaires. Figure 2B montre un example un bon anticorps pour une protéine cytoplasmique (DAB2). La figure 2C montre un exemple d'une mauvaise coloration, avec un faible rapport signal sur bruit, où l'échantillon a été fixée à 10 min seulement. Dans ce cas, l'anticorps utilisé pour GATA4 (Santa Cruz, SC-1237) nécessite O / N fixation pour fournir un signal fort (voir 24 pour les instances d'embryons fixes O / N et colorées avec cet anticorps). L'augmentation du niveau de signal pendant le post-traitement révèle une image très bruyant. En revanche l'anti-GATA4 utilisé pour la figure 2A (sc-9053) offre une grande rapport signal-sur-bruit après fixation à seulement 10 min. Détails pour ceux-ci et d'autres anticorps robustes sont fournis dans la section des matériaux.
Les facteurs limitants pour une segmentation de bons MINS sont: a) le grossissement de l'objectif utilisé pour l'imagerie, b) la résolution et Z c) la qualité de la coloration nucléaire. La figure 2D montre des exemples d'embryons imagés avec un oil immersion objectif 40X avec un NA de 1,30 et un 0,21 mm WD. panneaux du milieu montrent des agrandissements des ICM où noyaux individuels et la frontière entre eux peuvent être distingués. Si ne pas utiliser coloration de l'ADN (ie., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, etc.) valeurs de fluorescence pour la quantification, les paramètres d'acquisition peut être réglée individuellement pour obtenir le meilleur signal. Panneaux inférieurs montrent comment le plus avancé de l'embryon, plus la densité nucléaire et donc plus le risque d'erreurs de segmentation (tête de flèche et flèche). La figure 3 montre des exemples d'erreurs que MN puisse commettre, comme la détection de noyaux apoptotiques comme des cellules vivantes ( astérisques dans les panneaux de la figure 3Aa, Ab, Ad), sur-segmentation (flèche et pointes de flèches en figure 3Ac) ou sous-segmentation (flèche sur la figure 3Ad). la figure 3B montre une séquence de Z-tranches d'un événement sous-segmentation, où deux cellules ont été identifiées comme une. Notez comment MINS segmentation prend de l'axe Z en compte pour segmenter un volume qui comprend tous les tranches où une cellule donnée est présente.
Enfin, les spécificités de l'analyse des données dépendra de la question à l'étude, par conséquent, des lignes directrices pour le processus d'analyse ne peuvent pas être donnés ici. Cependant, nous avons trouvé certaines transformations de données initiale pour être utile Figure 4B -.. D montre des tracés des valeurs de fluorescence pour les marqueurs NANOG et gata6 dans l'ICM de l'embryon le montre la figure 4A figure 4B montre les valeurs de fluorescence brutes obtenues à partir MINUTES (après correction manuelle de compréhension et sur-segmentation). Figure 4C montre les mêmes données après une transformation logarithmique, qui sépare les valeurs de la parcelle axes (une transformation de la racine carrée est également possible et donne un tracé similaire). montre la figure 4D les mêmes données après automatiquement correcting les valeurs de l'atténuation Z associée à la fluorescence, comme il est expliqué dans l'étape 4.5.2.2 du protocole. Des exemples de cette fluorescence désintégration de Z-associé sont donnés dans l'image de la figure 4E et les parcelles en 4F. Figure 4G montre l'effet de la transformation de données expliqué dans 4.5.2.2. Couleurs représentant soit épiblaste (rouge, NANOG +, GATA6-) ou PRE (bleu, NANOG-, gata6 +) identité ont été ajoutés à la parcelle en fonction de la NANOG et les valeurs de gata6. Dans cet exemple particulier, les cellules où le rapport de journal [gata6] / log [NANOG]> 1,25 ont été considérés PrE, les cellules où le rapport de journal [gata6] / log [NANOG] <1 ont été considérés comme EPI, et les cellules avec un intermédiaire rapport ont été considérée sans engagement (aucune dans ce cas). Toutes les transformations de données et des parcelles ont été faits dans rstudio Cependant, le choix du logiciel ne soit pas critique et dépendra de l'utilisateur final.
Figure 1. Localisation embryon, scénario et Analyse de pipeline. (A) Schéma d'un (de deux) corne utérine de la souris et les stades de développement préimplantatoire, alignés avec la région de la corne où ils doivent être trouvés. (B) de la chronologie expérimentale avec un timing pour chaque étape. Les étapes du protocole et de points de pause (en bleu) sont indiqués. (C) Résumé de l'acquisition de l'image et du pipeline d'analyse utilisant MIN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Exemples de immunofluorescence et de la densité nucléaire. (A) des exemples de bons résultats d'immunofluorescence avec des anticorps testés pour tr nucléairefacteurs de anscription. Anti-CDX2 a été détectée avec un AlexaFluor 488 âne anticorps secondaire anti-souris, anti-gata6 avec un âne anti-chèvre AlexaFluor 568, anti-NANOG avec un âne anti-lapin AlexaFluor 647, anti-GATA4 (Santa Cruz, SC-9053 ) avec un AlexaFluor 488 âne anti-lapin et anti-OCT4 avec un AlexaFluor 647 âne anti-souris. Tous les anticorps primaires sont indiquées dans la Table des matières. GATA4 cytoplasmique coloration nucléaire est non spécifique, et figure également à GATA4 embryons nuls (non représenté). (B) Exemple de bonne immunofluorescence pour une protéine cytoplasmique, DAB2. Il a été détectée en utilisant un AlexaFluor 488 âne anti-souris. (C) Exemple de mauvaise immunofluorescence, avec un rapport signal sur bruit faible d'un facteur nucléaire. GATA4 a été détectée avec un anti-GATA4 soulevé chez la chèvre (Santa Cruz, SC-1237, tandis que sc-9053 (de lapin anti-GATA4) a été utilisé dans (A)) et une AlexaFluor 568 âne anti-chèvre. (
Figure 3. Exemples d'erreurs min. (A) Séquence de Z-sections individuelles à partir d'un embryon montrant des exemples d'erreurs de segmentation mins. Les cellules apoptotiques qui sont néanmoins identifiés comme noyaux sont marqués d'un astérisque (*) dans les panneaux a, b et d. Dans le panneau b, ID # 39 (pointe de flèche), bien que très petite, n'identifier le noyau correspondant et peut donc être laissé non corrigé. Dans le panneau c, ID # 66 (flèche) couvre deux n différenteuclei, qui ont à leur tour été identifiés séparément (pointes de flèches, ID # 65 # 54 et # 53). Dans le panneau d, deux cellules (ID # 63) ont été identifiés comme un seul (voir le marquage flèche la frontière mince) et ce disque devraient donc être dupliqué à des fins de comptage cellulaire. (B) MN détecte cellules le long de l'axe-Z. Les images montrent une séquence de Z tranches de deux cellules qui ont été marqués à tort comme un seul (# 123). Notez comment la zone bleue délimitant les noyaux est continu le long de Z. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Exemple de segmentation et de transformations de données. (A) Images de cellules ICM d'un blastocyste colorées pour NANOG et gata6 et instantané de segmentation nucléaire du mêmeembryon utilisant MIN sur le canal de coloration nucléaire (Hoechst 33342). (BD) NANOG et de fluorescence de gata6 valeurs dans les cellules ICM mesurées par MINS tracées en tant que données brutes (B), après avoir effectué une transformation logarithmique (C) et après correction des valeurs pour la décroissance de la fluorescence le long de l'axe Z et l'attribution automatique d'identités de cellules en fonction de la correction valeurs (D). (E - G) Exemples de correction des données de décroissance de fluorescence le long de l'axe z. (E) d'images d'un blastocyste marqué avec Hoechst et anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), montrant la diminution de la fluorescence le long de l'axe Z. (F) Les diagrammes de dispersion des valeurs de fluorescence le long de l'axe Z pour Hoechst et AF488 pour un pool d'embryons, y compris celui montré dans (E). ligne grise représente la courbe de régression pour chaque ensemble de valeurs. (G) Mêmes données que dans F après compensation fluorescence décroissance pour chaque celluleen utilisant le facteur suivant: coordonnée Z * la pente du modèle linéaire (voir l'étape 4.5.2.2 dans le protocole). Panneaux E - G ont été publié à l'origine par les auteurs dans le nœud (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Chaque point représente une cellule. Échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Entrée utilisateur |
| Seuil de luminosité * (facilite la détection nucléaire en images sombres) |
| X par rapport / résolution YZ |
| Canal de segmenter |
| diamètre nucléaire |
| niveau de bruit de l'image |
| MN sortie |
| Segmentation Z-stack avec nuclei ID |
| volume nucléaire |
| coordonnées XYZ pour chaque noyau |
| Moyenne et la somme des valeurs de fluorescence pour chaque canal de fluorescence et le noyau |
| avantages |
| segmentation précise (> 85%) des noyaux à travers la pile - reconnaît toutes les occurrences d'un noyau en z sections adjacentes |
| la résolution d'une seule cellule |
| segmentation non supervisée de lots d'embryons |
| pipelines de segmentation peuvent être enregistrés et réutilisés ou ajustés pour chaque embryon particulier |
Tableau 1. Caractéristiques MINUTES
| Charger l'image | À l'invite, introduire la résolution par rapport Z pour laimage. Il peut être obtenu à partir des métadonnées de fichiers en utilisant le lecteur par défaut ou l'application de la formule suivante: X (ou Y) résolution résolution / Z (tout en pm). |
| Entrez le numéro de séquence (1-5) pour le canal à segmenter. En utilisant le canal de coloration d'ADN pour la segmentation permet de détecter toutes les cellules dans l'image, cependant, d'autres canaux peuvent être segmentées séparément aussi. | |
| Entrez le cadre de commencer la segmentation au (1 par défaut). applique uniquement aux fichiers avec des délais multiples. | |
| Améliorer l'image (en option) | Le point de l'image noir et blanc peut être ajustée pour faciliter la détection. abaissement général, le point blanc et re-mise à l'échelle de 0 à 255 (pour les images 8-bits) ou de 0 à 4096 (pour les images 12 bits) rendra l'image plus lumineuse et faciliter la détection des noyaux sombres. |
| détecter Nuclei | Sélectionnez le diamètre nucléaire estimée (généralement entre 30 et 40 px en blastocystes). |
| Pour des images bruitées le niveau de bruit peut être ajustée. Sinon, la valeur par défaut sera appliquée. | |
| segment Nuclei | Utilisez les paramètres par défaut. |
| Classifier Nuclei | MN peut distinguer trophectoderme (TE) de la masse cellulaire interne des cellules (ICM) dans les embryons préimplantatoires basé sur la position. Ceci peut également être fait manuellement ou en fonction des niveaux de fluorescence si un marqueur est utilisé TE. |
| Résultats à l'exportation | Sélectionnez les fichiers à générer: |
| - Segmentation superposée sur le canal utilisé (.tiff de séquence), | |
| - Segmentation (Fichier de séquence .tiff), | |
| - Feuille de calcul avec des ID pour toutes les cellules détectées, coordonnées XYZ et les niveaux de fluorescence (moyenne et somme) pour tous les canaux pour chaque cellule (.csv). | |
| Tous les fichiers exportés par défaut. Les fichiers sont enregistrés dans le srépertoire ame où se trouvent les images. |
Tableau 2. MN Segmentation Pipeline
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Discussion
Le présent protocole décrit une méthode pour effectuer une analyse quantitative de l'ensemble de montage immunofluorescence sur préimplantatoire des embryons de souris de la scène. Un protocole robuste d'immunofluorescence 22 est suivie par haute résolution, l'ensemble du montage imagerie confocale et par la segmentation d'images en utilisant un morceau sur mesure de logiciels 4. Alors que le choix du protocole d'immunofluorescence est pas critique, on retrouve celle présentée ici 22 à être rapide, fiable et de fournir signal fort pour la plupart des anticorps que nous avons testés. D'autres protocoles peuvent être suivies, à condition que leur demande est conforme à travers des expériences équivalentes. Alors que de nombreux facteurs influent sur le résultat de chaque expérience individuelle, et la comparaison directe entre les expériences ne sont pas nécessairement possible, nous avons constaté que la recherche d'uniformité entre les répétitions et l'exécution répétitions techniques suffisantes réduit considérablement la variabilité. Par conséquent, une fois optimisé, la fixation et immunolabeling réactifs et protocoles, ainsi que les conditions d'imagerie doit être maintenue constante entre les expériences équivalentes.
Les principaux problèmes qui peuvent survenir lors de l'application de ce protocole se répartissent en deux groupes: 1) la faible coloration de qualité, avec un signal faible, et 2) la segmentation optimale, avec de nombreuses erreurs (par exemple, sur et sous-segmentation). Low immunofluorescence de la qualité est généralement due à une mauvaise fixation des échantillons ou pour les anticorps ne pas être adapté à toute monture immunofluorescence. Assurez-PFA est frais (soit fraîchement préparée ou décongelé à la température ambiante de -20 ° C pas plus d'une semaine avant). Compte tenu de la petite taille des embryons préimplantatoires, 10 min fixation dans PFA devrait suffire. Cependant, nous avons trouvé certains anticorps pour donner un signal fort avec des temps de fixation (voir Matériaux). Si un anticorps qui a été précédemment testé fournit le signal est faible, essayez de protocoles de fixation différents. Pas tous les anticorps exercent robuste sur l'ensemble de montage immunofluorescence et le choix de l'anticorps primaire est critique pour le résultat de l'expérience. Nouveaux anticorps doivent être testés sur les embryons et la concentration optimale déterminées empiriquement. Dans le tableau des matériaux que nous fournissons des détails d'un certain nombre d'anticorps, nous avons testé et utiliser régulièrement. Reportez-vous à la littérature publiée ou les informations dont dispose le fabricant lors de l'examen de nouveaux anticorps. Notez que tous les anticorps appropriés pour le travail Western blot en immunofluorescence toute-montagne, les concentrations nécessaires pour immunofluorescence peuvent être jusqu'à un ordre de grandeur supérieur. Anticorps secondaires commerciales fonctionnent généralement bien hors de la boîte, cependant, être cohérent dans l'utilisation de combinaisons d'anticorps primaire-secondaire à travers des expériences équivalentes qui vont être comparés.
La qualité de la segmentation d'images dépend à la fois la qualité de la coloration nucléaire et de la densité nucléaire dans l'ICM de l'embryon. Efforcez-vous toujours pour des images lumineuses,noyaux pointus et utilisent un objectif à haute résolution (40X ou plus). Si le signal de coloration nucléaire est faible, utiliser une aliquote fraîche ou un nouveau lot. Tant que le colorant nucléaire est pas utilisé pour la quantification, les paramètres d'acquisition peuvent être ajustés pour chaque embryon afin d'enregistrer pointus, noyaux vives. De même, si un canal autre que la coloration nucléaire est utilisé pour la segmentation, le rapport signal-sur-bruit de ce canal particulier détermine la qualité de la segmentation. blastocystes à un stade avancé (E4.0 partir) présentent une densité nucléaire très élevé au sein de l'ICM. Par conséquent, il est de ces étapes que la coloration de haute qualité est la plus critique. Néanmoins, des erreurs de segmentation auront lieu le plus souvent à ces étapes. Introduire le diamètre nucléaire estimée et le niveau de bruit de l'image sur le pipeline MIN, explorer l'issue de chaque étape, en utilisant le bouton «Voir» et ajuster les paramètres jusqu'à ce qu'un résultat satisfaisant soit obtenu. Utilisez les paramètres qui produisent la meilleure segmentationet corriger les erreurs manuellement pendant le traitement des données. Notez que les embryons à un stade avancé (~ de E4.5) ont un nombre de cellules de haute et de correction manuelle des données va prendre du temps.
Les limites de ce protocole sont déterminées par le système de microscope confocal utilisée pour l'acquisition d'image. Comme on le verra, l'utilisation d'un objectif à fort grossissement, avec une distance de travail qui permet à l'axe Z-imagerie de l'ensemble de l'embryon (embryons de souris préimplantatoire peuvent atteindre jusqu'à 150 à 160 um de diamètre). De même, le nombre d'épitopes qui peuvent être détectées est déterminée par le nombre de canaux du microscope peut acquérir en une fois. En utilisant ce protocole, trois épitopes différents en plus de l'ADN (4 canaux au total) peuvent être marquées simultanément sur chaque échantillon. Assurer la instrument est étalonné pour chaque canal de fluorescence, le déclenchement est optimisée et que la sortie laser soit constante.
Les procédés décrits ici permettent l'analyse de la position de la cellule le long de laXYZ axes ainsi que la quantification des niveaux d'expression de protéines in situ par chaque cellule dans des blastocystes de souris. Dans notre expérience, des méthodes alternatives à l'aide de tout autre logiciel disponibles ne peuvent pas fournir le niveau de résolution que le pipeline appliquée dans ce protocole (voir 4 pour une comparaison directe avec d'autres outils). La forte densité nucléaire trouvé dans l'ICM du blastocyste entraîne d'autres outils pour générer tant d'erreurs que l'ampleur de la correction manuelle requise rend leur utilisation peu pratique. En variante, comptage manuel des cellules et la fluorescence des mesures ont déjà été utilisés pour des sous-ensembles de cellules ou de régions définies de l'embryon 10,11,18,19,24. Cependant, le comptage manuel et la mesure de tous les canaux de fluorescence et de la position de la cellule, à travers tous les axes XYZ, pour les dizaines de cellules présentes dans chaque embryon seraient tellement de temps qu'il ne permettrait pas à l'analyse à haut débit pour lesquels notre protocole a été conçu . En outre, un manuelEVALUATION des niveaux de fluorescence est sujette à la polarisation, tandis qu'un pipeline tel que celui décrit ici permet une mesure objective des intensités de fluorescence pour la détermination ultérieure d'une identité de cellule. Afin d'attribuer des identités de cellules, l'enquêteur devrait établir un critère standard à appliquer dans tous les échantillons pour une expérimental particulier mis en place. Compte tenu des différents facteurs - biologiques et techniques - qui peuvent affecter les résultats de immunomarquage, ce critère doit être déterminée en utilisant des expériences de contrôle appropriées et les données précédemment publiées chaque fois que possible. Nous envisageons un avenir proche lorsqu'un algorithme peut être conçu pour la détermination automatique de l'identité de la cellule, indépendamment de l'expérience. Toutefois, un tel outil ne viendra que de plus vaste application et l'amélioration de la méthode actuelle, probablement couplée avec des algorithmes d'apprentissage automatique.
Enfin, compte tenu de la simplicité de ce pipeline et l'MORPHOL stéréotypéelogie des embryons préimplantatoires de la souris, ce protocole est facilement extensible pour l'analyse d'un grand nombre d'embryons, ce qui permet l'analyse à haut débit de phénotypes nuls 5,6 ou toute autre manipulation expérimentale 7. Enfin, alors que le protocole actuel a été conçu et optimisé pour l'analyse des embryons de souris préimplantatoires et colonies ESC, nous ne voyons aucune raison a priori pourquoi il ne pouvait pas être appliquée à d'autres systèmes avec des caractéristiques similaires - densité nucléaire savoir élevé. Nous encourageons les autres à expérimenter et adapter ce protocole à d'autres scénarios et fournir une rétroaction pour son amélioration future.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
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