Summary
Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.
Abstract
Dit protocol geeft een methode om kwantitatieve voeren, eencellige in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie bestuderen in de muis pre-implantatie embryo's. De voor het embryo, immunofluorescentie, imaging op een confocale microscoop, en het beeld segmentatie en analyse procedures worden beschreven. Deze werkwijze maakt kwantificering van de expressie van meerdere nucleaire markers en de ruimtelijke (XYZ) coördinaten van alle cellen in de embryo. Het maakt gebruik van MINS, een beeld segmentatie software tool speciaal ontwikkeld voor de analyse van confocale beelden van pre-implantatie embryo's en embryonale stamcellen (ESC) kolonies. MIN voert onbewaakte nucleaire segmentatie de X, Y en Z dimensies en verschaft informatie over de mobiele positie in de driedimensionale ruimte, en nucleaire fluorescentie niveaus voor alle kanalen met minimale gebruikersinvoer. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor de beeldanalysevan pre-implantatie fase muizenembryo's, kan het gemakkelijk worden aangepast aan de analyse van elke andere monsters vertonen een goede signaal-ruisverhouding en waar hoge nucleaire dichtheid vormt een hindernis voor beeldsegmentatie (bijv., expressie analyse van embryonale stamcel (ESC ) kolonies, differentiërende cellen in kweek, embryo's van andere species of trappen, etc.).
Introduction
De muis pre-implantatie embryo een paradigma voor het ontstaan en behoud van pluripotentie in vivo, evenals als model voor de studie die het lot specificatie en de novo epithelialisatie bij zoogdieren te bestuderen. De pre-implantatie stadia van de ontwikkeling van zoogdieren zijn toegewijd aan de oprichting van de drie cellijnen die deel uitmaken van de blastocyst, namelijk de pluripotente epiblast - en twee extra-embryonale lijnen, de trophectoderm (TE) en de - die heeft geleid tot de meeste somatische weefsels en kiemcellen geeft primitieve endoderm (pre) (Figuur 1A) 1,2. Dit protocol beschrijft de procedures om (1) de oogst en bevestig pre-implantatie stadium muizenembryo's, (2) het uitvoeren van immunofluorescentie om eiwitten van belang te labelen, (3) verrichten whole-mount beeldvorming met behulp van een confocale microscoop met-z snijden mogelijkheden en (4) het uitvoeren van nucleaire segmentatie van confocale beelden en de daarop volgende beeld kwantitatieve analyses. Deze leiding maakt tHij onpartijdige meting van eiwitniveaus voor toewijzing van cel identiteiten subpopulaties van cellen in situ karakteriseren. 4 dagen om de data-analyse (Figuur 1B) voor één nest (doorgaans tot 10 muizenembryo's), van embryo - Dit protocol kan in slechts 3 worden uitgevoerd. De gelijktijdige analyse van een aantal nesten zou de beeldvorming en data-analyse tijd last te verhogen, waardoor de totale lengte van het Protocol tot verlenging.
De pre-implantatie stadium muizenembryo is een experimenteel handelbaar systeem dat, gezien de geringe omvang en stereotiepe morfologie 3, is zeer geschikt voor in toto beeldvorming van cellulaire processen met single-cell resolutie. Om een onbevooroordeelde, systems-niveau analyse van een statistisch relevant aantal embryo's uit te voeren, een geautomatiseerde, kwantitatieve analyse pipeline is wenselijk. Echter, vanwege de hoge nucleaire dichtheid van de binnenste celmassa (ICM) van de blastocyst (
De analyse pipeline hier gepresenteerde draait om de MATLAB-gebaseerde beeld segmentatietool Modular Interactive Nuclear Segmentation (minuten) 4. MINS performs onbewaakte nucleaire segmentatie op grote hoeveelheden confocale Z-stacks nadat de gebruiker zo min mogelijk beeld eigenschappen heeft vastgesteld met behulp van een grafische gebruikersinterface (GUI) (Tabel 1) 4. Deze pijplijn is efficiënt gebleken voor het genereren van hoge doorvoer gegevens eiwitexpressie en cellen lokalisatie in zowel wildtype experimenteel behandelde en genetisch gemodificeerde embryo en SER 5-7. In het huidige protocol beschrijven we de toepassing van minuten naar de segmentatie van pre-implantatie-embryo stadium beelden. Voor voorbeelden van MINS prestaties op sociaal-economische raden verwijzen wij u naar 4,7. De geautomatiseerde nucleaire segmentatie stap vermindert de tijd last van de cel identificatieproces, terwijl de ruimtelijke en fluorescentie-intensiteit metingen laten een onbevooroordeelde bepaling van cel identiteiten en het genereren van driedimensionale kaarten van genexpressie domeinen en celpositie in het embryo (Figuur 1C 5,6. MINS is vrij beschikbaar op http://katlab-tools.org (de software vereist een MATLAB-licentie).
Geen aanpak ontwikkeld tot op heden staat de vorming van dergelijke diepgaande gegevens over eiwit expressie en cel lokalisatie in de muis pre-implantatie embryo's. Alle pogingen tot nu toe bij het kwantificeren van dit soort gegevens zijn beperkt tot het handmatig bepalen en kwantificering van de mobiele nummers voor verschillende populaties in het embryo (hetzij geheel handmatig of software-geassisteerde) 9-19. Deze benadering (integratie van MINS software) is op maat gemaakt voor en getest op de muis pre-implantatie embryo's en SER; niettemin zijn prestaties op andere systemen met hoge dichtheid nucleaire, hoewel nog niet getest, wordt verwacht gelijkwaardig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Alle dierlijke werk, met inbegrip van veeteelt, het fokken en het offer werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite Memorial Sloan-Kettering Cancer Center's (IACUC), protocol # 03-12-017.
1. Embryo Collection
Opmerking: Alle dierlijke werkzaamheden moeten hebben van institutionele en lokale autoriteiten is goedgekeurd en voldoen aan de lokale en institutionele regels.
- Mate een maagd vrouwelijke muis met een vruchtbare hengst van het gewenste genotypes.
Let op: Als het opzetten van natuurlijke dekkingen, het selecteren van vrouwen in de estrus fase van het Estral cyclus verhoogt de kans op copulatie op de gewenste datum. Als het induceren van superovulatie, verwijzen wij u naar het in 20 beschreven protocollen. - Controleer de aanwezigheid van een vaginale plug op de ochtend met een stompe sonde. Idealiter, doe dit voor de middag (12:00), als copulatie pluggen verloren gaan gedurende de dag. Overweeg noon van de detectie van de vaginale plug embryonale dag (E) 0.5.
- Op de gewenste dag en tijd van de embryonale ontwikkeling, opwarmen M2 of spoelen met medium (FHM) tot kamertemperatuur of bij voorkeur 37 ° C. Opmerking: Ofwel M2 of FHM kan worden gebruikt voor het spoelen en behandeling embryo. Wanneer niet in gebruik, bewaar deze media bij 4 ºC. Schat de toepassing van ~ 2 ml medium per baarmoeder.
- Ontdooi bevroren 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of bereiden wat verse oplossing. Schat 500 ul van 4% PFA-oplossing per putje van een 4-wells plaat. Fix één nest op elk putje van een 4-wells plaat. Opmerking: Als alternatief kan een 96-well plaat gebruikt om vast en slaan embryo. Bij gebruik van een 96-putjesplaat Gebruik 100 ul PFA-oplossing per putje.
- Trek een glazen Pasteur pipet met behulp van een open vlam om een capillair uiteinde aan het uiteinde te trekken.
- Offer vrouwelijke door cervicale dislocatie of CO 2 inhalatie, of zoals vereist door de lokale en institutionele regelgeving. Het is vaak desirable om euthanasie van het dier te bevestigen door cervicale dislocatie.
- Spray buik van het dier met 70% ethanol om haarverlies te minimaliseren en uitvoeren van een abdominale incisie, eerst door de huid en vervolgens door de lichaamswand (peritoneum) om de ingewanden bloot te leggen.
Let op: De volgende stappen beschrijven de procedure blastocysten uit de baarmoeder van een zwangere vrouwelijke muis te verzamelen in elk stadium tussen E3.25 en E4.5 (Figuur 1A). Voor protocollen op de collectie van pre-implantatie embryo's eerder dan E3.25, verwijzen naar 20. - Zoek de baarmoeder en uit het dier. Die het cervicale uiteinde van de baarmoeder met een pincet, dwars door de baarmoederhals en trek voorzichtig beide uterine hoorns rekken.
- Het vet uit de baarmoeder, het verzorgen van de baarmoederwand niet te doorboren. Dit kan gemakkelijk worden gedaan op de uitslag, terwijl het lichaam van het dier aangesloten, de uterus kan worden uitgestrekt. Als alternatief iskan later worden gedaan, onder een dissectie microscoop, in RT PBS. Voor een meer gedetailleerde protocol op dissectie van de baarmoeder, zie Protocols 5 & 8 20
- boven de eileiders te snijden, onder de eierstokken, om de gehele baarmoeder, plaats uitbrengen op een petrischaal en bedek met PBS.
Opmerking: Deze stap maakt het ook mogelijk het wassen van overtollige bloed of ander vuil uit de baarmoeder, die de daaropvolgende blastocyst oogsten vergemakkelijkt. - Aparte beide uterine hoorns door snijden door het proximale uiteinde, aan beide zijden van de cervix en gooi de baarmoederhals. Scheid de eileider van de uterus door het snijden onder de isthmus die hen (Figuur 1A) verbindt. Transfer beide hoorns tot een daling van manipulatie medium (ofwel M2 of FHM) voor het embryo en manipulatie.
- Onder een dissectie microscoop, spoelen blastocysten uit de baarmoeder en in het medium door het forceren van 0,5-1 ml M2 of FHM door elke baarmoeder hoorn van de cervicale opening. Gebruik een 1ml spuit met een onderhuidse naald. Opmerking: De naald kan worden afgerond met een depot steen te scheuren de baarmoeders, hoewel dit niet kritisch. Een gedetailleerd schema voor de baarmoeder spoelen kan worden gevonden in 21.
- Met behulp van de dissectie microscoop, zoek de blastocysten, die gedurende de druppel medium zal verspreid worden. Het kan tot 1-2 min gedurende blastocysten zinken naar de bodem van de schaal na het spoelen. Via de mond gecontroleerde, glazen Pasteur pipet met een capillairuiteinde, verzamel blastocysten en overbrengen naar een nieuwe druppel media.
- Spoel blastocysten door ze te verplaatsen door middel van 2-3 druppels vers M2 of FHM. Bewegen embryo in groepen van 5-10 blastocysten per keer.
Opmerking: Bewegende grotere groepen op een bepaald moment zal het proces versnellen, maar het zal ook de kans op per ongeluk een groot aantal embryo's te verliezen. Als ongetrainde in het gebruik van mond gecontroleerde pipetten, oefenen embryomanipulatie en overdragen vóór b worden overwogeneginning het experiment. - Verwijder de zona pellucida (ZP) van uitgekomen blastocysten (meestal <E4.0) door ze kort wassen in oplossing zuur Tyrode. Zodra de ZP niet meer toegankelijk, transfer blastocysten naar manipulatie media. Alleen houden embryo zuur Tyrode zolang als strikt noodzakelijk, om schade aan de cellen te voorkomen.
- Wees voorzichtig bij het hanteren van blootgelegde blastocysten, omdat ze heel gemakkelijk hechten aan glas en kunststof oppervlakken. Manipulation medium bevat 4 mg / ml runderserumalbumine (BSA) om aanhechting te voorkomen, maar zuur Tyrode of PBS niet derhalve het risico van beschadiging of verlies van de embryo's te verminderen niet opneemt dan 2-5 ontdaan blastocysten op een tijdstip waarop het manipuleren ze in BSA-vrij of serum-vrij PBS of zuur Tyrode.
Opmerking: Als alternatief, laag de glazen pipet met 1% BSA voor gebruik om hechting van de embryo verminderen het glasoppervlak.
- Wees voorzichtig bij het hanteren van blootgelegde blastocysten, omdat ze heel gemakkelijk hechten aan glas en kunststof oppervlakken. Manipulation medium bevat 4 mg / ml runderserumalbumine (BSA) om aanhechting te voorkomen, maar zuur Tyrode of PBS niet derhalve het risico van beschadiging of verlies van de embryo's te verminderen niet opneemt dan 2-5 ontdaan blastocysten op een tijdstip waarop het manipuleren ze in BSA-vrij of serum-vrij PBS of zuur Tyrode.
- Smeer de bodem van elk putjeeen 4-well weefselkweekplaat met een laagje 1% agar, 0,9% NaCl voorkomen embryo hechten aan de kunststof. Alternatief wordt 4 mg / ml BSA voor het PBS (PBS-BSA).
- Vul een putje van de beklede 4-well weefselkweekplaat met 500 pl RT PBS (of PBS-BSA) en andere goed met 500 pi 4% PFA in PBS.
- Spoel blastocysten in RT PBS en fixeer 4% PFA in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Transfer naar PBS (of PBS-BSA) na fixatie.
- Wanneer embryo zullen direct worden verwerkt, omvatten de PBS met de embryo's met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen (wat leidt tot uitdroging van het monster) en bewaar de plaat bij 4 ° C.
Opmerking: Verschillende bevestigingsmethoden en tijden kunnen worden gebruikt afhankelijk van het experiment, de epitopen van belang en de antilichamen te gebruiken. Ongeacht de gekozen werkwijze, zijn consistent gelijk experimenten latere vergelijking van de kleuringen te vergemakkelijken.
Let op: Pauzepoint: Embryo's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C in PBS tot enkele weken alvorens naar de volgende stap. Zorgen steriel PBS en / of voeg 100 U / ml penicilline + 100 pg / ml streptomycine (Pen-Strep) bacteriële contaminatie of vooruit te lopen langdurige opslag te voorkomen (vooral bij gebruik van PBS-BSA).
2. Immunofluorescentie
- Voer immunofluorescentie met behulp van een protocol dat eerder werd getest en bewezen robuuste voor de hele-mount immunofluorescentie te zijn. Opmerking: We raden die in 22 en 11 beschreven. In dit artikel de voormalige zal worden beschreven. Ongeacht de gekozen werkwijze, zijn consistent gelijk experimenten aan vergelijking van de kleuringen te vergemakkelijken.
- Gebruik van een flexibel, polyvinyl, heldere, U-bodem 96-well plaat de opeenvolgende stappen van de immunofluorescentie protocol uit te voeren. Vul elk putje met 50 - 100 pi oplossing en verplaatsen embryos uit één oplossingnaar het andere met een L-vormige mondpipet. Opmerking Deze benadering minimaliseert het gebruik van de reagentia en vergemakkelijkt het bijhouden stappen en de parallelle kleuring van verschillende experimentele groepen.
- Optioneel: Smeer de bodem van de putjes met een dun laagje 1% agar, 0,9% NaCl om de hechting van embryo aan de kunststof te voorkomen. Niet BSA om immunofluorescentie oplossingen toe te voegen.
- Bereid PBX (0,1% Triton X-100 in PBS). Als anticiperen op de prestaties van de verschillende immunofluorescentie experimenten, voor te bereiden 50 ml van PBX en bewaar bij 4 ºC tussen experimenten.
- Bereid permeabilisatie oplossing (0,5% Triton X-100, 100 mM glycine in PBS). Maak 1 ml (of welke hoeveelheid nodig) verse permeabilisatie oplossing voor elk experiment.
- Bereid blokkeeroplossing (2% paardenserum (HS) of 20% foetaal runderserum (FBS) met Pen-Strep in PBS). Bereid 10 ml en bewaar bij 4 ºC tussen experimenten.
- Geen verschillen waargenomen tussen ofweltype serum evenwel consistent bij de keuze van de blokkerende oplossing voor Overeenkomstige experimenten.
- Spoel vaste embryo gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in PBX (~ 100 pi).
- Doorlaatbaar embryo gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in permeabilisatie oplossing (~ 100 pi).
- Spoel embryo gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in PBX (~ 100 pi).
- Blok embryo's 30 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur in -100 pl blokkeeroplossing. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
Let op: Embryo's kunnen worden geblokkeerd tot O / N perioden bij 4 ºC zonder merkbare verbetering of nadeel in vergelijking met 30 min blokkeren stappen. - Incubeer embryo O / N bij 4 ºC in het primair antilichaam / antilichamen verdund in het blokkeren van oplossing (~ 100 pi). Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
- Bepaal optimale verdunning voor elke primaire antilichaam vooraf. Zie discussion and Materials sectie voor geteste verdunningen van een aantal antilichamen.
- Na O / N incubatie, spoelen embryo 3x gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur in PBX (~ 100 pi).
- Blok embryo's 30 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur in -100 pl blokkeeroplossing. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
- Incubeer embryo gedurende 1-2 uur bij 4 ° C in secundair antilichaam / antilichamen verdund tot 4 ug / ml in ~ 100 ul van blokkeeroplossing. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
- Spoel embryo 2x 5 min elk bij RT in PBX.
- Verplaats embryo's de voorkeur DNA vlek. Bij gebruik van Hoechst 33342, verdund tot 5 ug / ml in PBS. Bedek de oplossing met een laag minerale olie om verdamping te voorkomen of te houden in een bevochtigde kamer.
Let op: Pauze punt: Als embryo's worden niet direct in beeld wordt gebracht, kunnen ze voor u worden bewaardp tot enkele weken in nucleaire kleuroplossing. In dit geval zorgen steriel PBS en / of voeg Pen-Strep of natriumazide bacteriegroei en besmetting te voorkomen.
3. Confocale Imaging
Opmerking: Individuele confocale microscoop configuraties specifieke opnameparameters moeten worden aangepast voor het systeem en software plaats. Echter, de volgende sectie bevat een aantal algemene regels te volgen die van toepassing zijn op een bepaalde installatie zou moeten zijn.
- Met behulp van een fijne mond pipet, maken microdruppels PBS of nucleaire oplossing vlek op het glazen oppervlak van een 35mm glazen bodem schaal en bedek met minerale olie. Als alternatief, gebruik dan een gewone dekglaasje met silicone separatoren om beschadiging van de embryo's en dek af met een glas microscoopglaasje. Opmerking: Bij gebruik van een gewone dekglaasje, embryo's kunnen niet worden vervolgens geherpositioneerd of teruggewonnen voor genotypering, daarom raden wij het gebruik van glas-bottomgerechten.
- Plaats embryo in de microdruppels en regelen op een consistente wijze, bij voorkeur met de ICM-holte evenwijdig aan het glasoppervlak. Opgericht schotel op de microscoop houder. Opmerking: Beelden verkregen op laser scanning confocale microscoop last hebben van een Z-as-geassocieerde verlies van fluorescentie-intensiteit. Daarom is de samenhang van de regeling is van belang voor het vergelijken van intensiteiten tussen gelijkwaardige gebieden op verschillende embryo's.
- Opzetten verwijzing parameters met behulp van wild-type embryo's die niet onderworpen zijn aan enige vorm van behandeling die genexpressie kunnen veranderen zijn geweest.
- Afbeeldingen ophalen met een sterke vergroting doelstelling (dwz 40X of hoger) om gegevens die nauwkeurige segmentatie met het gereedschap MIN 4 vergemakkelijkt verkrijgen.
Opmerking: Het gebruik van de digitale zoom op een 20x doelstelling zal geen afbeeldingen van voldoende resolutie voor segmentatie gebruik MINS opleveren. Men moet er ook rekening mee de werkafstand (WD) van de doelstelling, zoals het hoortvoldoende om de verwerving van een Z-stack die een hele blastocyst omspant, dus een lange WD toestaan (~ 130-150 pm) doel is meestal niet nodig. De in de figuren 2 images - 4 werden verkregen onder toepassing van een 40X / NA 1,30 olie-immersie objectief met een werkafstand van 210 urn. - Met de laagste laseruitvoer dat een sterk signaal-ruisverhouding verschaft zonder bleken van de fluoroforen.
- Stel de gain en offset om een zo breed dynamisch bereik te verkrijgen zonder overbelichting het monster. Blootstellen van de afbeeldingen om het grootste deel van, of overspannen de gehele, grijswaardegebied zal het opsporen van kleine verschillen in intensiteit tussen de beelden te vergemakkelijken.
- Gebruik een klein (1 micrometer) Z-stap, aangezien de Z-as resolutie is van cruciaal belang voor een nauwkeurige segmentatie met minuten.
Opmerking: XY afmetingen hebben geen invloed op de nucleaire segmentatie proces, alleen de grootte van het beeldbestand. In het algemeen, 512 x 512 pixels is voldoende XY resolutie voor publicatie-kwaliteit foto's zonder compromizingen harde schijf ruimte. - Kritische stap: Laat beeldvormingsparameters consistenter en tussen beeldvorming zittingen van hetzelfde experiment om monsters te kunnen vergelijken.
- Afbeeldingen ophalen met een sterke vergroting doelstelling (dwz 40X of hoger) om gegevens die nauwkeurige segmentatie met het gereedschap MIN 4 vergemakkelijkt verkrijgen.
- Beeldvorming batches van embryo's:
- Afbeelding samenhangende groepen (nesten, experimenten) in één sessie waar mogelijk.
- Houd parameters consistente binnen en tussen de beeldvorming sessies voor herhalingen van hetzelfde experiment.
- Afbeelding embryo gedurende (gehele Z-as) voor elke cel vangen.
Opmerking: Indien gewenst kunnen embryo genotypering worden uitgevoerd na beeldvorming zoals beschreven in 23. De noodzaak van geneste PCR moet empirisch worden bepaald en hangt af van de locus te analyseren en de primers.
- Zorg ervoor dat u in staat zijn om embryo's met terugwerkende kracht aan te passen aan beelden.
4. Beeldanalyse en Data voorverwerking
- Download en MINS 4 installeren vanaf http: // Katlab-tools.org (MATLAB licentie vereist).
- Voer image segmentatie:
- Volg de grafische gebruikersinterface (GUI) van minuten om een confocale afbeelding te laden of te stapelen van de harde schijf, op te sporen de kernen en het segment van de afbeelding. Laad de gehele Z-stack ruwe gegevens die door de microscoop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Zie tabel 2 voor meer informatie over elke stap en instructies vinden op http://katlab-tools.org en 4. Eenmaal voltooid, zien de uitkomst van elke stap door te klikken op de bijbehorende knop 'Beeld'. Een gele markering boven de knop geeft operatie in proces, een groene markering geeft aan operatie voltooid.
Opmerking: MINS ondersteunt momenteel geen .czi bestanden, .tiff sequenties of multi-positie files - elke Z-stack nodig heeft om een onafhankelijk bestand. - Na bevredigende segmentatie, sparen de pijpleiding gemaakt, zodat deze direct voor de andere embryo's of nesten worden gebruikt.
- Volg de grafische gebruikersinterface (GUI) van minuten om een confocale afbeelding te laden of te stapelen van de harde schijf, op te sporen de kernen en het segment van de afbeelding. Laad de gehele Z-stack ruwe gegevens die door de microscoop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Zie tabel 2 voor meer informatie over elke stap en instructies vinden op http://katlab-tools.org en 4. Eenmaal voltooid, zien de uitkomst van elke stap door te klikken op de bijbehorende knop 'Beeld'. Een gele markering boven de knop geeft operatie in proces, een groene markering geeft aan operatie voltooid.
- Batch-modus segmentatie:
Opmerking: Single bestanden kunnen individueel worden gesegmenteerd. Aangezien embryo binnen een strooisel of experiment zijn algemeen vergelijkbaar stadium kan mins De segmentering pijpleiding gemaakt voor één opname toepassen op een groep daarvan zonder toezicht.- Vanuit het menu Batch-modus uit te voeren, klikt u op 'Add files' en laad alle bestanden moeten worden verwerkt in een keer. Opmerking: Bestanden van verschillende bronnen kunnen worden toegevoegd aan de wachtrij segmentatie.
- Klik op 'Start Batch-modus Run' en laat het tijd voor de software om de bestanden te verwerken. Opmerking: Segmentatie output zal in dezelfde map waar de originele bestanden, waar gevestigd worden opgeslagen.
- Segmentatie evaluatie en handmatige correctie
Opmerking: MINS segmenten beelden met zeer hoge nauwkeurigheid (> 85%), maar de kwaliteit van de kleuring en beeldvorming, en het stadium van het embryo, kunnen MIN prestaties beïnvloeden. In het algemeen, hoe hoger de nucleaire densiteit binnen het embryo, hoe waarschijnlijker segmentatie fouten nemen place (figuur 2D, 3). Daarom moet de nauwkeurigheid segmentatie worden geëvalueerd voor elk monster en handmatig gecorrigeerd indien nodig. Twee soorten fouten typisch voorkomen: over-segmentatie en onder-segmentatie.- Het oplossen van over-segmentatie:
- Identificeer valse positieven - apoptotische vesicles (figuur 3A a, b, d, sterretjes) of andere elementen die geen intacte kernen maar die kunnen zijn gekenmerkt met MIN.
Opmerking: In het algemeen zulke valse positieven hebben een kleinere afmeting dan echte kernen en kunnen in de meeste gevallen gemakkelijk worden geïdentificeerd en gesorteerd op het werkblad. Echter visueel onderzoek sterk aanbevolen, vaak kernen slechts gedeeltelijk gesegmenteerd, wat resulteert in een kleinere, maar geldige gesegmenteerde volume (figuur 3A b, pijlpunt). - Verwijder de overeenkomstige records voor valse positieven uit het * statistics.csv bestand. Het behoud van de oorspronkelijke * statistiekenCSV-bestand voor toekomstig gebruik en bewerken van slechts een kopie ervan.
- Als een kern is al meer dan-gesegmenteerd en gepresenteerd als 2 of meer kernen (figuur 3A c, pijl en pijlpunten), ofwel het samenvoegen van de platen door het gemiddelde van de intensiteit niveau of, indien soortgelijke, houdt één van de records voor die cel en gooi de rest.
- Identificeer valse positieven - apoptotische vesicles (figuur 3A a, b, d, sterretjes) of andere elementen die geen intacte kernen maar die kunnen zijn gekenmerkt met MIN.
- Het oplossen van under-segmentatie:
- Gebeurtenissen identificeren wanneer MINS heeft nagelaten de grens te detecteren tussen twee of meer kernen en derhalve gesegmenteerd ze als één nucleus (figuur 3A d, pijl en 3B). Opmerking: Dit vormt een probleem voor een nauwkeurig celtelling, maar nog belangrijker, voor het kwantificeren eiwitniveaus als de gemeten gemiddelde van de cellen die foutief zijn samengevoegd wordt, en die kunnen behoren tot verschillende geslachten.
- Identificeer evenementen waar MINS heeft nagelaten een kern helemaal op te sporen.
- In deze gevallen (4.4.2.1 en 4.4.2.2), meet de gemiddelde grijze niveau fof elk kanaal in de onder- of niet-gesegmenteerde cel (s) met behulp van een alternatieve tool, zoals ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), en vervang de verkeerde record met de juiste niveaus. Het behoud van de oorspronkelijke * statistics.csv bestand voor toekomstig gebruik en slechts een kopie van het te bewerken. Om dit te doen met behulp van ImageJ als volgt te werk:
- Open de relevante multi-channel-stack op ImageJ en importeer de bijbehorende * overlaid.tiff bestand gegenereerd door MINS als een virtuele stack ( 'Bestand'> 'Import'> 'TIFF virtuele stack ...').
- Vind een mediale deel van de onder- of niet-gesegmenteerde kern.
- Met behulp van de vrije hand selectie gereedschap een overzicht van de perimeter van de onder- of niet-gesegmenteerde kern op het DNA vlek kanaal.
- Druk Crl + M (Cmd + M op een Macintosh) of ga naar het menu Analyseren en selecteer 'Measure'. Deze actie zal de gemiddelde grijswaarde voor de geschetste gebied opnemen en zal het weer te geven op een nieuw venster. Ga naar 'Analyze'>9; Set metingen ... 'en zorg ervoor dat' Mean grijswaarde 'is geselecteerd. Selecteer desgewenst nog andere parameters te meten.
- Met dezelfde zone beschreven in stap 4.4.2.3.3 moet de meting herhaald voor elk van de fluorescentie kanalen plaats. De resultaten zullen worden toegevoegd aan de vorige op het venster van de metingen 'Results'.
- Gebruik de verkregen metingen om de foutieve records in de * statistics.csv bestand te vervangen. Als de kern niet was gesegmenteerd, plaatst u een nieuwe rij, toewijzen van een nieuwe Cell ID en de waarden verkregen in ImageJ in het kader van de overeenkomstige kolom voor elk kanaal in te voeren. Deze cel zal geen ruimtelijke coördinaten (X, Y en Z-waarden). Als de kern was undersegmented, dupliceren de rij, verschillende Cell-ID's toe te wijzen aan elke nieuwe cel en de waarden verkregen in ImageJ in het kader van de overeenkomstige kolom te introduceren. In dit geval zullen beide cellen ruimtelijke coördinaten delen.
Let op: Als de ruimtelijke verdeling te analyseren, we recommend exclusief de XYZ coördinaten van deze cellen, aangezien zij overlappen. Hiertoe wanneer u nieuwe records toewijzen cel IDs aan hen die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van de oorspronkelijke (bijvoorbeeld niet-gehele getallen).
- Score delende cellen. Opmerking: MINS detecteert mitotische en interfase kernen, maar kan niet onderscheiden.
- Als mitotische kernen zijn afzonderlijk in de analyse worden beschouwd, met de hand van deze score en voeg deze informatie aan het gegevensbestand. Om mitotische cellen opnemen, voegt een nieuwe variabele (kolom) naar de * statistics.csv gegevensbestand en wijs verschillende waarden aan de mitose en de kernen.
- Het oplossen van over-segmentatie:
- Data voorverwerking.
Let op: Zodra de spreadsheets zijn gecorrigeerd voor over- en onder-segmentatie zijn ze klaar om te worden geanalyseerd. Het analyseproces en presentatie van gegevens is afhankelijk van het specifieke experiment. Echter, hieronder zijn een aantal algemene gegevens transformatiesWe raden aan om voorafgaand aan de analyse:- Transformeer de fluorescentie-intensiteit waarden in hun logaritme of vierkantswortel van de spreiding van de gegevens te verminderen. Dit helpt ook visualisatie, de ruwe data neiging zich te concentreren bij de assen van de grafiek (zie Figuur 4B, C).
- Corrigeer de Z-geassocieerde verzwakking van fluorescentie:
Opmerking: Fluorescentie intensiteit laser scanning confocale microscopie beelden vermindert de dieper op de Z-as een segment ligt (figuur 4E, F).- Als een van de gedetecteerde epitopen in de monsters is een alomtegenwoordig en homogeen uitgedrukt housekeeping nucleaire marker, normaliseren de fluorescentie-intensiteiten van de andere epitopen die door hun delen in elke cel door de overeenkomstige waarde van de huishouding marker.
- Bij het ontbreken van een dergelijke verwijzing marker, compensatie-Z geassocieerd verlies van fluorescentie op de volgende wijze:
- Zet de waarden van elke marker (Yplot samen de waarden voor alle controle, wildtype embryo's (Figuur 4F) - as van de grafiek) over de Z-positie (X-as van de grafiek) om de afname in intensiteit in Z visualiseren.
- Breng een lineair model (regressie curve) om het diagram verkregen in de voorgaande stap (intensiteitswaarden boven Z) voor elke markering (Figuur 4F).
- Corrigeer alle waarden voor elke merker volgens de volgende formule:
log (oorspronkelijke waarde) + Z * hellingsgraad van het model (figuur 4D, G).
Opmerking: De specifieke stappen om deze correctie is afhankelijk van de gebruikte analysesoftware (R, MATLAB) verlenen. Bij gebruik van R, voert u de volgende formule om een lineair model om de gegevens te passen:
> Lm (log (kanaal) ~ Z, data = dataframe)
wanneer het kanaal fluorescentie kanaal te corrigeren, Z is de Z-coördinaat en dataframe is de tabel met de waarden voor de gewenste embryo (s) (de * statistics.csv bestand gegenereerd door minuten of een wijziging van het).
Opmerking: De output van de bovenstaande formule de volgende format:
(Intercept) Z
4,76373 -0,01947
wanneer de waarde Z is de helling van de regressielijn voor die gegevensreeks, welke absolute waarde moet worden gebruikt om de oorspronkelijke waarde van de formule in 4.5.2.2.3 wijzigen (zie Figuur 4G voor een voorbeeld).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om data interpretatie en presentatie te vergemakkelijken, dient men de embryo's te beschadigen tijdens het verzamelen en manipuleren, zodat alle cellen en hun relatieve positie kan worden geanalyseerd Figuur 2A -. D toont voorbeelden van intacte blastocysten in verschillende fasen met een uitgezette holte. Mocht schade optreden, moet extra zorg worden genomen bij het analyseren en interpreteren van de resultaten.
De kwaliteit en betrouwbaarheid van de gegenereerde met dit protocol gegevens afhankelijk van de kwaliteit van de fixatie en de signaal-ruisverhouding van de antilichamen gebruikt om de eiwitten van belang te detecteren. Altijd vers fixeermiddel en testen van nieuwe antilichamen met positieve en negatieve controles voor het begin van een reeks experimenten. Figuur 2A toont voorbeelden van goede antilichamen voor een aantal kerneiwitten. Figuur 2B toont een example een goede antilichaam voor een cytoplasmatisch eiwit (DAB2). Figuur 2C toont een voorbeeld van een slechte kleuring met een lage signaal-ruisverhouding, waarbij het monster slechts 10 minuten vastgesteld. In dit geval het antilichaam voor GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) vereist O / N bevestiging aan een sterk signaal (zie 24 voor voorbeelden van embryo vaste O / N en gekleurd met dit antilichaam) verschaffen. Het verhogen van de signaalsterkte tijdens post-processing onthult een zeer luidruchtige afbeelding. Vormen het anti-GATA4 voor Figuur 2A (sc-9053) zorgt voor een hoge signaal-ruisverhouding na 10 min fixatie. Hieronder worden deze en andere krachtige antilichamen worden in het hoofdstuk Materialen.
De beperkende factoren voor een goede segmentatie MIN a) de vergroting van het objectief voor beeldvorming, b) de Z-resolutie en c) de kwaliteit van de nucleaire kleuring. Figuur 2D toont voorbeelden van embryo afgebeeld met een oil immersie 40X objectief met een NA van 1,30 en een 0,21 mm WD. Middelste panelen tonen een vergroting van de ICM waarbij individuele kernen en de grens daartussen te onderscheiden. Als dat niet met behulp van DNA-kleuring (bijv., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, etc.) fluorescentie waarden voor kwantificering, acquisitie parameters kunnen afzonderlijk worden ingesteld om het beste signaal te verkrijgen. Onderste panelen tonen hoe geavanceerder de embryo, hoe hoger de nucleaire dichtheid en dus hoe groter de kans op segmentatie fouten (pijlpunt en pijl). Figuur 3 toont voorbeelden van fouten die MIN kunnen verbinden, zoals het detecteren van apoptotische nuclei levende cellen ( sterretjes in panelen in figuur 3aa, Ab, Ad), over-segmentatie (pijl en pijlpunten in figuur 3AC) of onder-segmentatie (pijl in figuur 3AD). Figuur 3B toont een reeks van Z-schijfjes van een onder-segmentatie gebeurtenis, waar twee cellen geïdentificeerd als één. Merk op hoe MINS segmentatie zal de Z-as in aanmerking segment een volume dat alle segmenten wanneer een bepaalde cel aanwezig is omvat.
Tenslotte zullen de details van de gegevensanalyse afhankelijk van de vraag bestudeerde daarom richtlijnen voor het analyseproces hier niet worden gegeven. Wij hebben echter gevonden aantal initiële data transformaties nuttig Figuur 4B -.. D zijn grafieken van de fluorescentie waarden voor de markers NANOG en GATA6 in de ICM van het embryo in figuur 4A Figuur 4B toont de ruwe fluorescentiewaarden verkregen MIN (na handmatige correctie van onder- en segmentatie). Figuur 4C toont dezelfde gegevens na logaritmische transformatie, waarin de waarden scheidt van het perceel assen (vierkantswortel transformatie is ook mogelijk een soortgelijk plot oplevert). Figuur 4D toont dezelfde gegevens na automatisch correcting de waarden voor de Z-geassocieerde verzwakking in fluorescentie, zoals beschreven in stap 4.5.2.2 van het protocol. Voorbeelden hiervan-Z gekoppeld fluorescentievervaltijd zijn in de afbeelding in figuur 4E en 4F plaatsen in. Figuur 4G toont het effect van de datatransformatie toegelicht 4.5.2.2. Kleuren die hetzij epiblast (rood, NANOG +, GATA6-) of PrE (blauw, NANOG-, GATA6 +) identiteit zijn toegevoegd aan de grafiek als functie van de NANOG en GATA6 waarden. In dit specifieke voorbeeld, cellen waarin de verhouding van log [GATA6] / log [NANOG]> 1,25 werden beschouwd PrE cellen waarbij de verhouding van log [GATA6] / log [NANOG] <1 werden beschouwd EPI, en cellen met een intermediaire verhouding werden beschouwd vastgelegde (geen in dit geval). Alle datatransformaties en plots zijn gedaan in Rstudio echter de keuze van software is niet kritisch en zal afhangen van de eindgebruiker.
Figuur 1. Embryo locatie, tijdlijn en analyse Pipeline. (A) Schematische voorstelling van één (of twee) muis baarmoeder hoorn en de stadia van pre-implantatie ontwikkeling, afgestemd op het gebied van de hoorn wanneer ze moeten worden gevonden. (B) Experimentele tijdlijn met timing voor elke stap. Stappen van het protocol en pauze punten (blauw) worden aangegeven. (C) Samenvatting van de beeldacquisitie en analyse pipeline behulp minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Voorbeelden van immunofluorescentie en Nucleaire dichtheid. (A) Voorbeelden van goede immunofluorescentie resultaten met geteste antilichamen voor de nucleaire transcription factoren. Anti-CDX2 werd gedetecteerd met een AlexaFluor 488 ezel anti-muis secundair antilichaam, anti-GATA6 met een AlexaFluor 568 ezel anti-geit, anti-NANOG met een AlexaFluor 647 ezel anti-konijn, anti-GATA4 (Santa Cruz, sc-9053 ) met een AlexaFluor 488 ezel anti-konijn en anti-OCT4 met AlexaFluor 647 ezel-anti-muis. Alle primaire antilichamen zijn vermeld in de tabel Materials. Cytoplasmatische GATA4 nucleaire kleuring is aspecifiek en verschijnt ook in GATA4 null embryo's (niet getoond). (B) Voorbeeld van goede immunofluorescentie voor een cytoplasmatisch eiwit, DAB2. Er werd gedetecteerd met een AlexaFluor 488 ezel-anti-muis. (C) Voorbeeld van slechte immunofluorescentie, met een lage signaal-ruisverhouding voor een nucleaire factor. GATA4 werd gedetecteerd met een anti-GATA4 verhoogd bij geiten (Santa Cruz, sc-1237, dat sc-9053 (konijn anti-GATA4) werd gebruikt in (A)) en een AlexaFluor 568 ezel anti-geit. (
Figuur 3. Voorbeelden van MINS fouten. (A) Volgorde van individuele Z-secties van de ene embryo toont voorbeelden van MINS segmentatie fouten. Apoptotische cellen die niettemin worden aangeduid als kiemen zijn aangegeven met een asterisk (*) in panelen a, b en d. In Paneel B, ID # 39 (pijlpunt), zij het zeer klein, identificeert de overeenkomstige kern en kan dus niet gecorrigeerd worden gelaten. In panel c, ID # 66 (pijl) beslaat twee verschillende nuclei, die op hun beurt afzonderlijk geïdentificeerd (pijlpunten, ID # 65 # 54 en # 53). In panel d zijn twee cellen (ID # 63) geïdentificeerd als een enkele (zie pijlmarkering de dunne rand) en deze plaat derhalve worden uitgevoerd voor celtelling doeleinden. (B) MIN detecteert cellen langs de Z-as. De beelden tonen een opeenvolging van Z-segmenten van twee cellen die onjuist is gescoord als een enkele (# 123). Merk op hoe de blauwe zone afbakenen van de kernen continu langs Z. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Voorbeeld van Segmentatie en Data Transformations. (A) Beelden van ICM cellen van een blastocyst gekleurd voor NANOG en GATA6 en snapshot van de nucleaire segmentatie van hetzelfdeembryo met behulp van MINS over de nucleaire kleuring kanaal (Hoechst 33342). (BD) NANOG en GATA6 fluorescentiewaarden ICM cellen gemeten met MIN uitgezet als ruwe gegevens (B), na het uitvoeren logaritmische transformatie (C) en na correctie waarden voor de fluorescentievervaltijd langs de Z-as automatisch toewijzen cellen identiteiten op basis van de gecorrigeerde waarden (D). (E - G) Voorbeelden van gegevens correctie fluorescentievervaltijd langs de Z-as. (E) Beelden van een blastocyst gelabeld met Hoechst en anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), waaruit de fluorescentie daling langs de Z-as. (F) Puntgrafieken van fluorescentiewaarden langs de Z-as van Hoechst en AF488 een pool van embryo zoals die getoond in (E). Grijze lijn stelt de regressie curve voor elke set van waarden. (G) dezelfde gegevens als in F na het compenseren fluorescentievervaltijd voor elke celmet de volgende factor: Z coördinaat * de helling van het lineaire model (zie 4.5.2.2 stap in het protocol). Panels E - G werden oorspronkelijk door de auteurs in de Node gepubliceerd (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Elke stip vertegenwoordigt één cel. Schaal = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| gebruiker Input |
| Lichtsterktedrempel * (vergemakkelijkt de nucleaire detectie in dim images) |
| Relatieve X / YZ-resolutie |
| Kanaal te segmenteren |
| nucleaire diameter |
| Afbeelding geluidsniveau |
| MINS Output |
| Segmentatie Z-stack met NuclEI-id's |
| nucleaire volume |
| XYZ coördinaten voor elke kern |
| Gemiddeld en sommatie van fluorescentie waarden voor elke fluorescentie kanaal en de kern |
| voordelen |
| Nauwkeurige segmentatie (> 85%) kernen gehele stack - herkent alle exemplaren van een kern in naburige z-delen |
| Single resolutie cel |
| Unsupervised segmentatie van batches van embryo |
| Segmentatie pijpleidingen kan ofwel worden opgeslagen en hergebruikt of aangepast voor elke afzonderlijke embryo |
Tabel 1. MINS Features
| Afbeelding laden | Bij de prompt, introduceren de Z relatieve resolutie voor debeeld. Het kan worden verkregen uit het bestand metadata met behulp van de standaard-lezer of het toepassen van de volgende formule: X (of Y) resolutie / Z-resolutie (alle in pm). |
| Voer het volgnummer (1-5) voor het kanaal te worden gesegmenteerd. Met het DNA kleuring kanaal voor segmentatie alle cellen te detecteren in het beeld echter andere kanalen worden afzonderlijk ook gesegmenteerd. | |
| Voer het frame te beginnen segmentatie op (1 standaard). Geldt alleen voor bestanden met meerdere perioden. | |
| Verbeter Afbeelding (optioneel) | De witte en zwarte punt van het beeld kan worden aangepast om detectie te vergemakkelijken. In het algemeen verlagen van het witpunt en re-scaling naar 0-255 (voor 8-bits afbeeldingen) of 0-4096 (voor 12-bits afbeeldingen) zal het beeld helderder te maken en detectie van dim kernen te bevorderen. |
| Detect Kernen | Selecteer de geschatte nucleaire diameter (in het algemeen tussen 30 en 40 px in blastocysten). |
| Voor luidruchtige beelden het geluidsniveau kan worden aangepast. Anders zal de standaardwaarde worden toegepast. | |
| segment Kernen | Gebruik standaard parameters. |
| classificeren Kernen | MINS kan trophectoderm (TE) van binnenste celmassa (ICM) cellen te onderscheiden in pre-implantatie embryo's op basis van positie. Dit kan ook handmatig worden uitgevoerd of op basis van fluorescentie niveaus als een TE marker wordt gebruikt. |
| Resultaten exporteren | Selecteer de bestanden te genereren: |
| - Segmentering overlay over het gebruikte kanaal (.tiff sequentie-bestand), | |
| - Segmentatie alleen (.tiff sequentie-bestand), | |
| - Spreadsheet met ID's voor alle gedetecteerde cellen, XYZ coördinaten en fluorescentie niveaus (gemiddeld en som) voor alle kanalen voor elke cel (csv-bestand). | |
| Alle bestanden die zijn geëxporteerd door gebrek. Bestanden worden opgeslagen in de same directory waar de beelden zich bevinden. |
Tabel 2. MINS Segmentatie Pipeline
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een methode om een kwantitatieve analyse van whole-mount immunofluorescentie voeren op pre-implantatie stadium muizenembryo's. Een robuuste immunofluorescentie protocol 22 wordt gevolgd door een hoge resolutie, whole-mount confocale imaging en image segmentatie met behulp van een op maat gesneden stukje software 4. Terwijl de keuze van immunofluorescentie protocol is niet kritisch, vinden we de hier gepresenteerde 22 snel, betrouwbaar en stabiel signaal voor veel van de antilichamen die we hebben getest. Andere protocollen kan worden gevolgd, op voorwaarde dat de toepassing ervan is consistent gelijkwaardig experimenten. Hoewel veel factoren invloed op de uitkomst van elke afzonderlijke experimenten en directe vergelijking tussen experimenten niet steeds mogelijk, hebben we gevonden dat het streven naar consistentie herhalingen en uitvoeren voldoende technische replicaten vermindert de variabiliteit. Daarom, zodra geoptimaliseerd, fixatie en immunolabeling reagentia en protocollen, alsmede beeldvormingsomstandigheden moet constant tussen gelijkwaardige experimenten bewaard.
De belangrijkste problemen die tijdens de toepassing van dit protocol vallen kunnen voordoen in twee groepen: 1) slechte kwaliteit kleuring, met dim-signaal, en 2) suboptimale segmentatie, met veel fouten (dat wil zeggen, over- en onder-segmentatie). Lage kwaliteit immunofluorescentie is over het algemeen als gevolg van onjuiste bevestiging van de monsters of de antilichamen niet geschikt voor de hele mount immunofluorescentie. Zorgen PFA is vers (ofwel vers bereid of ontdooid tot kamertemperatuur van -20 ° C niet langer dan een week voor). Gezien de geringe omvang van pre-implantatie embryo's, moeten 10-min fixatie in PFA volstaan. We hebben echter bepaalde antistoffen gevonden om een sterker signaal te leveren met een langere fixatie tijden (zie Materials). Als een antilichaam dat eerder is getest biedt zwak signaal, probeer verschillende fixatie protocollen. Niet alle antilichamen te voeren robuust op de hele-mount immunofluorescence en de keuze van primair antilichaam cruciaal voor de uitkomst van het experiment. Nieuwe antilichaampjes worden getest op embryo en de optimale concentratie empirisch bepaald. In de Materials grafiek geven we de details van een aantal antilichamen die we hebben getest en routinematig gebruik. Raadpleeg de gepubliceerde literatuur of om informatie van de fabrikant bij het overwegen van nieuwe antilichamen. Niet alle antilichamen die geschikt zijn voor Western blot werken geheel-mount immunofluorescentie en de concentraties die nodig zijn voor immunofluorescentie kan tot een orde van grootte hoger zijn. Commerciële secundaire antilichamen in het algemeen goed te werken uit de doos, echter, in overeenstemming te zijn in het gebruik van primaire-secundair antilichaam combinaties hele gelijkwaardig experimenten die zullen worden vergeleken.
De beeldkwaliteit segmentatie hangt af van zowel de kwaliteit van de nucleaire kleuring en de nucleaire dichtheid in de ICM van het embryo. streven altijd naar heldere,scherpe kernen en maken gebruik van een hoge-resolutie doelstelling (40x of meer). Als het nucleair signaal vlek laag is, gebruik dan een verse portie of een nieuwe batch. Zolang de nucleaire kleuring niet wordt gebruikt voor het kwantificeren, kunnen de acquisitie parameters worden aangepast voor elke embryo om scherpe, heldere kernen opnemen. Ook als een andere dan de nucleaire kleuring kanaal wordt gebruikt voor segmentatie, de signaal-ruisverhouding van dat kanaal zal de kwaliteit van de segmentatie bepalen. Laat stadium blastocysten (E4.0 verder) presenteren een zeer hoge nucleaire dichtheid binnen de ICM. Daarom is deze stadia die hoogwaardige kleuring meest kritisch. Toch zal segmentatie fouten plaatsvinden meestal te nemen op deze stadia. Introduceer de geraamde nucleaire diameter en het beeld geluidsniveau op de MIN pijpleiding, verken de uitkomst van elke stap met behulp van de knop 'Beeld' en de parameters aan te passen tot een bevredigend resultaat wordt verkregen. Met de parameters die de beste segmentatie producerenen het handmatig corrigeren van fouten tijdens de verwerking van gegevens. Merk op dat late stadium embryo's (~ E4.5) hebben een hoog celgetal en handmatige data correctie tijdrovend zijn.
De beperkingen van dit protocol worden bepaald door de confocale microscoop systeem dat wordt gebruikt voor het verkrijgen. Zoals besproken, gebruik van een sterk vergrotende objectief met een werkafstand die Z-as beeldvorming van het gehele embryo laat (pre-implantatie muizenembryo's kunnen oplopen tot 150-160 urn in diameter). Evenzo zal het aantal epitopen dat kan worden gedetecteerd worden bepaald door het aantal kanalen van de microscoop kan tegelijkertijd verwerven. Met dit protocol, drie verschillende epitopen naast de DNA (4 kanalen in totaal) kan gelijktijdig op elk monster gelabeld. Controleer het instrument is afgesteld voor elk kanaal fluorescentie, wordt de gating geoptimaliseerd en dat het laservermogen consistent.
De hier beschreven werkwijzen maken de analyse van cel positie langs deXYZ assen en de kwantificering van eiwitexpressie niveaus in situ voor elke cel in blastocysten van de muis. In onze ervaring, kunnen alternatieve methoden voor het gebruik van andere beschikbare software niet over het niveau van de resolutie dat de in dit protocol pijpleiding kan (zie 4 voor een directe vergelijking met andere instrumenten). De nucleaire hoge dichtheid in de ICM van de blastocyst veroorzaakt andere instrumenten om zoveel fouten dat de mate van handmatige correctie vereist hun gebruik onpraktisch genereren. Alternatief handmatige celtelling en fluorescentiemetingen werden eerder voor subsets van cellen of bepaalde gebieden van de embryo 10,11,18,19,24. Toch zou handmatig tellen en meten van fluorescentie kanalen en celpositie, voor alle XYZ assen voor de tientallen cellen in elk embryo zo tijdrovend, dat het niet mogelijk zou maken de hoge-doorvoer analyse waarvoor ons protocol werd ontwikkeld worden . Bovendien, een handleidingBEOORDELING fluorescentie niveaus gevoelig voor bias, terwijl een pijpleiding zoals hier beschreven kan een objectieve meting van de fluorescentie-intensiteiten voor de daaropvolgende bepaling van celidentiteit. Om cel identiteiten toe te wijzen, moet de onderzoeker een standaard criterium vastgesteld die moeten worden toegepast op alle monsters voor een bepaalde experimentele opstelling. Gezien de verschillende factoren - biologische en technische - dat het resultaat van immunokleuring kan beïnvloeden, moet dit criterium worden bepaald met geschikte controle-experimenten en eerder gepubliceerde gegevens waar mogelijk. We zien een nabije toekomst waarin een algoritme kan worden ontworpen voor automatische bepaling van celidentiteit ongeacht het experiment. Toch zal een dergelijk instrument alleen komen van uitgebreidere toepassing en de verbetering van de huidige methode, waarschijnlijk in combinatie met machine learning algoritmen.
Gezien tenslotte de eenvoud van deze leiding en de stereotiepe Morpholgie van muis preimplantation embryo Dit protocol is eenvoudig schaalbaar voor de analyse van grote aantallen embryo, waardoor high-throughput analyse van null fenotypen 5,6 of andere experimentele manipulatie 7. Tenslotte, terwijl de huidige protocol is ontworpen en geoptimaliseerd voor de analyse van pre-implantatie muizenembryo's en ESC kolonies, zien wij geen reden waarom a priori niet kon worden toegepast op andere systemen met vergelijkbare kenmerken - namelijk hoge nucleaire dichtheid. We moedigen anderen te experimenteren en dit protocol om andere scenario's aan te passen en feedback te geven voor zijn toekomstige verbetering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
