Protocol
両発現ベクターEYFP-パーキンとpDsRed2-水戸での線維芽細胞の1エレクトロポ
- 100 mg / mlでDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、10％ウシ胎児血清、2ミリモル/リットルのL-グルタミン、100 U / mlペニシリンを添加した培地を用いて10センチメートルの組織培養プレートに不死化マウス胚性線維芽細胞成長、および37℃、5％CO 2を含む加湿雰囲気中ストレプトマイシン。
- 80％の細胞集密度で、無菌吸引によって完全DMEM培地を捨て、滅菌1×リン酸緩衝溶液（PBS）10 mLを加え（塩化ナトリウム80gを、塩化カリウム2.0gを、のNa 2 HPO 4 14.4 gのKH 2.4gの7.4）2 PO 4、1 LのH 2 O、PHを蒸留しました。
- 無菌吸引によってPBSを捨て、トリプシンEDTA、0.25％の1ミリリットルを追加します。 （ - 3分2）細胞が分離されるまで、37℃でプレートをインキュベートします。 _、完全DMEM培地の4ミリリットルを加え、細胞を再懸濁し、10を取り出します6;血球計カウントのための細胞懸濁液リットル。
注：16角の正方形の一組のセルの数は、細胞×10 4 / mlの数に相当するように、血球計数器を設計します。
- エレクトロポレーションプロセスの24時間前に10cmの組織培養皿上にシード1×10 6細胞。
- 無菌吸引によって完全DMEM培地を捨て、滅菌PBSの10ミリリットルを追加します。無菌吸引によってPBSを捨て、トリプシンEDTA、0.25％の1ミリリットルを追加します。 （ - 3分2）細胞が分離されるまで、37℃でプレートをインキュベートします。完全DMEM培地4mlを加え、15 mlチューブに細胞を再懸濁。
- 冷蔵遠心分離（4℃）を用いて5分間250×gで細胞をスピンダウン。無菌吸引によって上清を捨て、滅菌PBS 1 mlにペレットを再懸濁。 4℃で5分間、250×gで細胞をスピンダウン。
- 無菌吸引によって上清を捨て、そして100μlのOを追加エレクトロポレーションのためのF溶液ミックス細胞ペレットに（82補足ソリューション1のエレクトロポレーションソリューションV + 18マイクロリットルのμl）を、穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁（詳細については、ユーザーのガイドを参照してください）。 EYFP-パーキン（励起/発光527分の514）2μgのを追加し、細胞懸濁液で1μgのpDsRed2-水戸（励起/発光620分の565）。
- 使い捨てのパスツールを使用して、無菌のキュベットへの解決策を（両方のツールは、キットで提供されています）転送し、予め設定されたプログラムNIH / 3T3 U-030（シングルパルス、電圧200 V、容量960μF、パルス時間20ミリ秒を使用して、エレクトロポパルス番号：1）。
- 電気穿孔直後に、予め温めておいた新鮮な完全DMEM培地500μlのを追加し、6センチメートル組織培養プレートライブイメージンググレード上の細胞に接種し、37℃で5％CO 2を含む加湿雰囲気中でそれらをインキュベート24時間。
2.タイムラプスビデオ顕微鏡
- この時点で、実験手順を続行するために特定のライブイメージング媒体を準備します。次のようにライブイメージング媒体を準備します。混合DMEMフェノール不含の10％ウシ胎児血清、2ミリモル/リットルのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、および100mg / mlストレプトマイシンを補充しました。水浴中で37℃でライブイメージング媒体を事前に温めます。
- 無菌吸引によってエレクトロポレーションした細胞の培地を捨て、予め温めておいたライブイメージング媒体の1ミリリットルを追加し、P1000ピペットを用いて、37℃で30分間静置します。
- プレートのインキュベーション期間中に流入、5％CO 2顕微鏡のチャンバ内にすでに37℃で安定した温度で実施されます。
- 主要な動きや振動を避けて、顕微鏡のチャンバ内へのエレクトロポレーションした細胞でプレートを置きます。
- ソフトウェア・インターフェースを使用して、両方のfluoreを検出するために顕微鏡を設定します同時トランスフェクトするベクター、EYFP-パーキン（510 nmおよび放射範囲520〜550 nmの励起範囲495、緑）、pDsRed2-水戸（励起最大558 nmおよび放出によって、最大583 nmでのコードされた融合タンパク質からのscence信号、赤）。
- タイムラプスビデオ顕微鏡ソフトウェアを開きます。上部のメニューでpDsRed2-水戸のためのEYFP-パーキンおよびローダミンのためのFITCを選択します。上部のメニューで倍率（20X）を選択します。
- ソフトウェアインターフェイスを使用して、両方の同時トランスフェクトするベクターを発現する単一のセルを探し、位置を登録します。 10細胞の最小値は、すべての実験条件（実験群）のために収集されるまで、この手順を繰り返します。
- メニュー「アプリ」を選択し、多次元の取得をクリックしてください。多次元取得ウィンドウでは、このような買収の数、それぞれ取得し、記録セルの位置との間の時間間隔として必要なパラメータを選択します。取得」をクリックします。「取得プロセスを開始します。
- EYFP-パーキンと15分の合計の間隔で5分ごとに画像を収集DsRed2の-水戸蛍光信号の両方の基底取得を開始します。
- 最終的な作業濃度の2倍FCCPの濃度で予熱したライブイメージング媒体を準備する（0.1から10μM、細胞型に依存します）。
- 取得処理を中断し、P1000ピペットを用いて顕微鏡のチャンバ内のプレートにFCCPで予め温めておいたライブイメージング媒体の優しく1ミリリットルを追加します。
- 以前に記録された位置を使用して、3時間の全期間のために、説明したように取得プロセスを再起動します。それらを分析し、買収が終わったときmitophagicプロセスのビデオを作成するために取得したすべての画像を保存します。
3.分析
- パソコン上で「.TIFF」の形式で取得したすべての画像を収集
- グラフィックソフトで画像を開きます。ウェアおよび時間的間隔を定義するには（画像は5分ごとに取得される）ミトコンドリア膜にパーキンの動員を示す第1の画像にFCCPとミトコンドリア誘起脱分極から発生しました。実験群内の各セルのために、この分析を繰り返します。
- 実験グループ名を持つスプレッドシート上の列の最初のセルにラベルを付けます。各実験群について、10セルの最小のパーキン募集のための時間的間隔を測定します。 Parkinの募集のための計算された時間的間隔の平均を作成し、各実験群の標準偏差定義（平均値±SDを、N = 10）。
- 列に単一の計算された時間的間隔を整理します。すべての列は、n =実験群の10の測定値が含まれています。
- 数式パレットメニューから「平均」機能を選択します。列のデータを選択します。関数式ビルダのメニューから「標準偏差」を選択します。セレ列内のデータのct。
- 統計的手法を用いて、実験群間マイトファジーを動的に有意な差を定義するために適切な統計値を適用し、実験群を比較します。 （例えば、二つのグループ= スチューデントのt検定 、3つまたはそれ以上の基= ANOVAプラスポストホック検定）
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Representative Results
ここで、我々は、タイムラプスビデオ顕微鏡は、単一のセル内の蛍光標識タンパク質の分子のイベントを追跡するために使用することができる強力な技術である方法を示しています。代表的な結果はまた、この技術は、高品質な画像の取得を可能にする方法を示します。分子過程の画像が得られると、我々は、さまざまな方法でそれらを分析する機会を持ちます。ここでは、選択的に損傷したミトコンドリアを除去する細胞の恒常性を維持する重要な分子過程で誘導さマイトファジープロセスの開始の間の時間の間隔を分析します。
この技術は、幅広いアプリケーションを設立します。それを研究する必要があるプロセスに関与する重要な分子の標識化を介して、細胞遊走またはミクロ分子事象としてマクロ細胞プロセスを監視するためにも使用することができます。
O：キープtogether.withinページ= "1"> パーキン媒介マイトファジー
損傷したと機能不全ミトコンドリアプロセスの選択パーキン媒介除去が脱共役剤FCCPにより誘発される膜の脱分極はミトコンドリア外膜にPINK1を募集し、選択パーキン媒介マイトファジーをトリガー図1に要約されています。続いて、パーキンは、損傷したミトコンドリアに動員し、PINK1と相互作用しています。この複合体パーキン-PINK1は、損傷した細胞小器官のユビキチン化およびリソソームと融合オートファゴソーム、中への取り込みにつながります。マイトファジーと呼ばれるこのプロセスは、健康な細胞環境を維持し、機能的ミトコンドリア8,15の再生を可能にするために重要な代謝過程であると考えられています。
実験プロトコル
「FO：キープtogether.within-ページ=「NT 1 "> 図2は、実験プロトコルおよびFCCP誘発性マイトファジープロセスの前と後にEYFP-パーキンの募集を下記のために使用される顕微鏡のセットアップの概略図を示します。無偏光化ミトコンドリア膜へのパーキンリクルート
図3Aに、我々は前パーキン分布を示し、FCCPの投与後。基礎時点（BT5、BT10とBT15分）の間、EYFP-パーキン（緑）が均一に細胞全体に拡散され、ミトコンドリアネットワーク（レッド）が十分に相互接続されたように思われます。 FCCPの投与後（FT = 0分）（ 図3B）、我々は、ミトコンドリア分画（FT = 5分）を観察します。しかし、EYFP-パーキンはまだ均質細胞質外にかかわらず、拡散されます。マイトファジーは、55分後FCCP投与で刺激されますEYFP-パーキンは、マイトファジープロセス（FT = 55）をトリガするために、損傷ミトコンドリア膜に動員されます。
図1.パーキン媒介マイトファジーの模式図。膜電位（Ψm）の減少は、損傷または機能不全のミトコンドリアで発生し、脱共役剤FCCPによって誘導することができます。膜電位の損失は、ミトコンドリア外膜にPINK1（レッド）を募集し、選択パーキン媒介マイトファジーをトリガーします。パーキン（ブルー）を直接PINK1と相互作用することにより損傷したミトコンドリアに動員されます。パーキンの存在は、損傷した細胞小器官とリソソームと融合オートファゴソーム、中へのその取り込みのユビキチン化（イエロー）につながる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。。
図2.顕微鏡セットアップおよび実験プロトコルの表現。プロトコルセクションに記載された実験イベントの（A）の概要。報告された実験のイベントは、オペレータが一時的にタイムラプスビデオ顕微鏡法のための（B）のセットアップを使用してFCCP誘発性マイトファジープロセスを追跡するために、エレクトロポレーションによってEYFP-パーキンとpDsRed2-水戸で細胞を同時トランスフェクトすることができます。 BT =基礎時点; FT = FCCP時点。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
パーキンRecruitmeを表示図3.線維芽細胞 NT FCCPにより誘導されるミトコンドリア膜脱分極。EYFP-パーキン（緑）転後のミトコンドリア（赤）に基礎時点（BT）の間にタイムラプスビデオ顕微鏡によって監視され、FCCP管理（FT）を投稿しました。 BT = 0から、EYFP-パーキンとミトコンドリアの蛍光は、5分ごとに検出されました。 （A）EYFP-パーキンは、均一に全体の基礎期間全体に拡散され、ミトコンドリアのネットワークは、無傷（白矢印）です。 FCCPにより、膜の脱分極に（B）ミトコンドリア分画は、FT = 55分（白矢印）で開始し、損傷ミトコンドリア膜のFT = 5分（白矢印）およびEYFP-パーキンの動員で記録されています。白いボックスは、パネル（5X）の拡大面積を表します。この実験プロトコルの適用に関する詳細については8を参照するために参照してください。 （スケールバー：10μm）を。>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
タイムラプス顕微鏡は、長期間にわたって携帯ダイナミクスの観察に時間的に1つの観測からのライブセルイメージングを拡張する技術として定義することができます。それは観察者がリアルタイムで単一の蛍光標識タンパク質を同定し、単一生細胞内でそのダイナミックに追従することができますので、この方法は、単純な共焦点または生細胞顕微鏡と区別されます。実際には、共焦点顕微鏡は、簡単に蛍光抗体を用いた免疫標識タンパク質を同定することができますが、それは、細胞およびそのライブ環境での分子事象を観察することはできません。
タイムラプスビデオ顕微鏡は、主にHEK293 16などの異なる種類の細胞の分子プロセスを監視、研究、一次ニューロン17およびHela細胞18で使用されるだけでなく、妊娠や予測異数性19,20として臨床応用を有しています。タイムラプス顕微鏡はembryolog提供します臨床妊娠のために胚発生についての追加情報をISTS、この情報を転送するための実行可能な胚を選択する能力を改善するために使用されることが可能です。タイムラプス顕微鏡の使用のさらなる利点は、以下の胚の取り扱いおよび実験室19内の損失や汚染の危険性を低減するであろう中間の観測のための彼らの料理を用意しています。
細胞は、マイトファジーを介して、損傷や機能不全ミトコンドリアを分解することにより、健康なミトコンドリアの恒常性を維持することができます。不良マイトファジーは23とガン24を老化、パーキンソン病21、アポトーシス22にリンクされています。マイトファジーは、ユビキチンリガーゼパーキンとPINK1 21によって駆動されます。健康ミトコンドリアの状態を維持するために、このプロセスの重要性を、我々はそれが重要なタイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、このイベントのダイナミックを研究することがわかりました。提案されたプロトコールは、ミトコンドリアの恒常性は、遺伝子発現やタンパク質の機能の変化を含む様々な細胞条件下でどのように影響されるかについての証拠を提供します。
本研究では、一時的にエレクトロポレーションによって線維芽細胞をトランスフェクトしました。エレクトロポレーション法は、膜のリン脂質二重層を妨害することによって細胞膜の透過性を増加させるために、細胞懸濁液に数マイクロ秒持続する最適化された電圧の電気パルスを印加します。このアクションは、一時的な孔の形成をもたらします。膜透過性は、DNAが細胞25内に導入されることを可能にします。我々は、一過性の両方のプラスミドEYFP-パーキンとpDsRed2-水戸の高いトランスフェクション効率を有するために、線維芽細胞をトランスフェクトするために、このプロセスを選択しました。実際には、エレクトロポレーション法は、化学的トランスフェクションの26よりも約10倍有効です。画像取得処理は、両方エクステによって侵害される可能性がありますrnal因子;温度変動、振動、湿度、内部要因。 pHは、細胞の運動性。エレクトロポレーションおよび蛍光追跡は、この実験プロトコルの成功のために最も重要であると考えられて2ステップです。トランスフェクション効率は、他の方法よりも高い場合であっても、エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションした細胞の〜20％を死滅させます。もう一つの大きな問題は、監視ステップの間に画像の取得の品質です。細胞環境は動的であるので、焦点面は、取得プロセスの全体にわたってフォーカスを維持するために連続的な調整が必要です。
ミトコンドリアの損傷は、膜、ミトコンドリア脱分極および酸化的ストレスによって引き起こされ得ます。これらの要因はmitophagic応答を誘導します。ミトコンドリアの脱分極は、選択マイトファジーを誘導することができることを示す証拠は、ROS産生とミトコンドリア損傷27-30につながる光損傷実験から来ています。ミトコンドリアのMEMを誘導するためにブレーン脱分極とmitophagic応答、FCCPはプロトノフォア10として使用されています。 FCCPは、プロトンが膜の脱分極を誘導する脂質二重層を横断することを可能にするイオノフォアです。このアプローチを用いて、我々は、マイトファジーを誘導し、分子マーカーの動的に続きました。
それは細胞毒性であることと、細胞死を促進することができるようFCCPの濃度は、非常に重要です。このアプローチは、生細胞の観察に依存しているので、FCCPの最終濃度は、マイトファジーを誘導することなく、細胞死に至るメカニズムをトリガするために、細胞型依存的に調節されなければなりません。
全体的に、我々は蛍光マーカーとしてEYFP-パーキンを使用して、マイトファジーの動的、以下、ミトコンドリア機能に新たな洞察を提供することを考えています。マイトファジーを介してミトコンドリアの選択的な除去は、ミトコンドリア質、細胞の生存および恒常性の維持に重要なプロセスです。このライブイメージングアプローチは、彼なりますlpが健康でストレス条件下でmitophagicプロセスを理解します。
現代的なアプローチは、さらに、携帯ダイナミクスの映画を作る超えタイムラプス顕微鏡観察を拡張しています。ますます、この境界は、サイトメトリー技術は、細胞および細胞内構造物31の動的活動を監視し、測定するためのイメージング技術と一体化されているようにぼやけています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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