Protocol
1. Electroporation של פיברובלסטים עם שניהם הביטוי וקטורים EYFP-פרקין ו pDsRed2-מיטו
- לגדל את תאי פיברובלסטים עובריים בעכבר הונצח על 10 סנטימטר צלחת רקמות תרבות באמצעות DMEM (המדיום של הנשר השונה של Dulbecco) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 2 mmol / L L- גלוטמין, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין באווירה humidified המכיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
- ב 80% התא confluency, להשליך את המדיום DMEM מלאה על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת פוספט חיץ 1x סטרילי (PBS) (80 גרם של NaCl, 2.0 גרם של KCl, 14.4 גרם של Na 2 4 HPO, 2.4 גרם של KH 2 PO 4 ו -1 L מזוקקים H 2 O, PH: 7.4).
- בטל PBS על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה את הצלחת על 37 ° C עד שהתאים מנותקים (2 - 3 דקות). הוסף 4 מ"ל של מדיום DMEM מלאה, resuspend התאים ולהוציא 10 _6; l של ההשעיה תא עבור ספירת hemocytometer.
הערה: hemocytometer מתוכנן כך שמספר התאים סט אחד של 16 ריבועים בפינה הוא שווה למספר של תאים x 10 4 / מ"ל.
- זרע 1 x 10 6 תאים על 10 ס"מ רקמות תרבות מנות 24 שעות לפני תהליך electroporation.
- מחק את מדיום DMEM המלא על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילית. בטל PBS על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה את הצלחת על 37 ° C עד שהתאים מנותקים (2 - 3 דקות). הוסף 4 מ"ל של מדיום DMEM מלאה ו resuspend התאים בתוך שפופרת 15 מ"ל.
- ספין התאים למטה ב 250 XG במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות-בקירור (4 מעלות צלזיוס). בטל supernatant ידי יניקה סטרילית resuspend גלולה ב 1 מ"ל של PBS סטרילית. ספין התאים למטה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- בטל supernatant ידי יניקה סטרילי, ולהוסיף 100 μl of שילוב פתרון electroporation (82 μl של electroporation פתרון V + 18 μl של פתרון משלים 1) אל תא גלולה בעדינות resuspend גלולה ידי pipetting (לפרטים נוספים עיין במדריך למשתמש). הוסף 2 מיקרוגרם של EYFP-פרקין (עירור / פליטה 514/527) ו 1 מיקרוגרם pDsRed2-מיטו (עירור / פליטה 565/620) בבית ההשעיה תא.
- מעביר את הפתרון כדי קובט סטרילי באמצעות פסטר הפנויה (שני הכלים הם מצורפים לערכה) ו electroporate באמצעות התכנית שנקבע מראש NIH / 3T3 U-030 (דופק יחיד, מתח 200 V, קיבול 960 μF, דופק זמן 20 אלפיות שני דופק, מספר: 1).
- מיד לאחר electroporation, להוסיף 500 μl של מדיום DMEM מלאה טרום חימם טרי וזרעי התא על צלחת 6 ס"מ רקמות תרבות חיה הדמיה בדרגה דגירה אותם באווירה humidified המכיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
2. מיקרוסקופית זמן לשגות וידאו
- בשלב זה, להכין מדיום הדמיה חיה ספציפית כדי להמשיך עם פרוטוקול הניסוי. הכן את המדיום הדמיה לחיות כדלקמן; לערבב בתוספת פנול ללא DMEM עם 10% בסרום שור עוברית, 2 mmol / L L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל, ו -100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין. טרום לחמם את המדיום הדמיה לחיות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- מחק את המדיום של תאים electroporated ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הדמיה מחומם מראש חי, באמצעות pipet P1000 דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- במהלך תקופת דגירת צלחת, זרם 5% CO 2 בתא של מיקרוסקופ כבר בטמפרטורה יציבה של 37 מעלות צלזיוס.
- מניח את הצלחת עם תאי electroporated ההחדרה של מיקרוסקופ הימנעות תנודות משמעותיות או תנודות.
- באמצעות ממשק התוכנה, להגדיר את המיקרוסקופ כדי לזהות הן fluoreScence אותות מן החלבונים היתוך המקודדים על ידי וקטורים-טרנספקציה שיתוף, EYFP-פרקין (טווח עירור 495 כדי 510 ננומטר ופליטה טווח 520 כדי 550 ננומטר, ירוק) ואת ננומטר pDsRed2-מיטו (558 ננומטר מקסימום עירור ופליטה 583 מקסימום, אָדוֹם).
- פתח את תוכנת מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. בתפריט העליון בחר FITC עבור EYFP-פרקין ו Rhodamine עבור pDsRed2-מיטו. בתפריט העליון בחר את ההגדלה (20X).
- באמצעות ממשק התוכנה, חפש את התא הבודד שמבטא וקטורי שיתוף transfected ולרשום את המיקום. חזור על פעולה זו עד למינימום של 10 תאים נאסף עבור כל תנאי הניסוי (קבוצת הניסוי).
- בחר בתפריט "Apps" ולחץ על רכישה רבה ממדים. בחלונות רכישת Multi Dimensional לבחור את הפרמטרים הדרושים, כגון מספר רכישות, מרווח הזמן בין כל רכישה ואת המיקום של התא מוקלט. לחץ על "לרכוש"כדי להתחיל את תהליך הרכישה.
- הפעל את רכישת הבסיס של שניהם EYFP-פרקין ו אות ניאון DsRed2-מיטו איסוף תמונות כל 5 דקות למשך פרק כולל של 15 דקות.
- הכן מראש חמם בינוני הדמיה לחיות עם ריכוז של FCCP פעמים גבוה יותר ריכוז העבודה הסופי (0.1 - 10 מיקרומטר, סוג תלוי תא).
- להפריע לתהליך הרכישה ולהוסיף בעדינות 1 מ"ל של מדיום הדמיה לחיות מחומם מראש עם FCCP לתוך צלחת בתוך החדר מיקרוסקופ של באמצעות pipet P1000.
- הפעל מחדש את תהליך הרכישה כפי שתואר לעיל, לתקופה כוללת של 3 שעות, באמצעות העמדה המוקלטת. שמור את כל התמונות רכשו על מנת לנתח אותם וליצור וידאו של תהליך mitophagic כאשר הרכישה היא מעל.
.3 ניתוח
- לאסוף את כל התמונות שנרכשו בפורמט ".tiff" במחשב אישי
- פתח את התמונות עם גרפיקה רכהכלי ולהגדיר את המרווח הזמני להתרחש החל-שלילת קוטביות מושרה המיטוכונדריה עם FCCP אל התמונה הראשונה מראה את הגיוס של פרקין לתוך קרום המיטוכונדריה (תמונות נרכשות כל 5 דקות). חזור על ניתוח זה עבור כל תא בקבוצת הניסוי.
- לייבל התא הראשון של הטור על גיליון אלקטרוני עם שם קבוצת הניסוי. עבור כל קבוצת ניסוי, למדוד את המרווחים הזמניים לגיוס פרקין של מינימום של 10 תאים. תן הממוצע של מרווחי הזמני מחושב לגיוס פרקין ולהגדיר את סטיית התקן עבור כל קבוצת הניסוי (ממוצע ± סטיית תקן, N = 10).
- ארגן לעמודות מרווחי הזמני המחושבת היחידה. כל עמודה מכילה את n = 10 מדידות של קבוצת הניסוי.
- בחר את פונקציית "הממוצע" מהתפריט פורמולה בונה. בחר את הנתונים בעמודה. בחר את פונקציית "סטיית תקן" מהתפריט פורמולה בונה. Sele גודלct הנתונים בעמודה.
- באמצעות גישה סטטיסטית, להשוות את קבוצות ניסוי היישום הנתון המתאימים על מנת להגדיר הבדל משמעותי בדינמיקה של mitophagy בין קבוצות ניסוי. (למשל, שתי קבוצות = של סטודנטים מבחן t, שלוש או יותר קבוצות = ANOVA בתוספת מבחן פוסט הוק)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בזאת, אנו מראים כיצד מיקרוסקופיה וידאו זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחרי האירועים המולקולריים של חלבונים fluorescently-tagged בתא בודד. תוצאות הנציג גם להראות כיצד טכניקה זו מאפשרת לרכישת תמונות באיכות גבוהה. כאשר תמונות של תהליך מולקולארי, מתקבלים, יש לנו הזדמנות לנתח אותם בדרכים שונות. כאן, אנו מנתחים את מרווח הזמן בין תחילת תהליך mitophagy המושרה, המהווה את תהליך מולקולארי חיוני לשמור על הומאוסטזיס הסלולר סלקטיבי הסרת המיטוכונדריה פגום.
טכניקה זו מקימה מגוון רחב של יישומים. זה יכול לשמש גם לניטור תהליך הסלולר מאקרו כגון נדידת תאים או אירועים מולקולריים מיקרו דרך תיוג של מולקולות מפתח המעורבים בתהליך שיש בו כדי להיחקר.
o: keep-together.within-page = "1"> פרקין בתיווך Mitophagy
הסרת פרקין בתיווך סלקטיבית של תהליך המיטוכונדריה פגום מתפקד מסוכמת באיור 1, שבו שלילת קוטביות הממברנה מושרה על ידי הסוכן שחרר FCCP מפעילה mitophagy פרקין בתיווך סלקטיבית, גיוס PINK1 קרום המיטוכונדריה החיצוני. בעקבות, פרקין מגויס אל המיטוכונדריה הפגום ו אינטראקציה עם PINK1. מורכבות זו פרקין-PINK1 מוביל ubiquitination של אברון הפגום ושילובה לתוך autophagosome, ממזגת עם ליזוזום. תהליך זה המכונה mitophagy נחשב תהליך מטבולי חיוני על מנת לשמור על סביבה בריאה הסלולר ולאפשר התחדשות של המיטוכונדריה תפקודית 8,15.
פרוטוקול הניסוי
NT "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2 מראה ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי ואת הגדרת מיקרוסקופ המשמש בעקבות גיוס של EYFP-פרקין לפני ואחרי תהליך mitophagy הנגרמת FCCP.גיוס פרקין כדי depolarized מיטוכונדריאלי ממברנה
באיור 3 א, אנו מראים ממשל FCCP לפני ואחרי חלוקת פרקין. במהלך מועדים לפי שעון הבסיס (BT5, BT10 ו BT15 דקות) EYFP-פרקין (גרין) היא מתפזרת בצורה הומוגנית ברחבי התא ורשת המיטוכונדריה (האדום) נראה טוב ביניהם. בעקבות ממשל FCCP (FT = 0 דקות) (איור 3 ב), אנו רואים חלוקת המיטוכונדריה (FT = 5 דקות). עם זאת, EYFP-פרקין עדיין היא מתפזרת בצורה הומוגנית אף את הציטופלסמה. Mitophagy מגורה על ממשל FCCP פוסט 55 דקות,EYFP-פרקין מגויס על ממברנות המיטוכונדריה הפגומות כדי לעורר את תהליך mitophagy (FT = 55).
באיור 1. ייצוג סכמטי של פרקין בתיווך Mitophagy. ירידה של קרום פוטנציאל (Ψm) מתרחש במיטוכונדריה פגומה או לא מתפקדת והוא יכול להיגרם על ידי הסוכן שחרר FCCP. אובדן פוטנציאל הממברנה מפעילה mitophagy פרקין בתיווך סלקטיבית, גיוס PINK1 (אדום) על קרום המיטוכונדריה החיצוני. פרקין (הכחול) מגויס אל המיטוכונדריה הפגום על ידי אינטראקציה ישירה עם PINK1. הנוכחות של פרקין מוביל ubiquitination (הצהוב) של אברון הפגום ושילובה לתוך autophagosome, ממזגת עם ליזוזום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מיקרוסקופ קמה וייצוג של פרוטוקול הניסוי. (א) סקירה של האירועים הניסיונות כמתואר בסעיף בפרוטוקול. האירועים הניסיונות דיווחו לאפשר למפעיל זמנים שיתוף transfect תאים עם EYFP-פרקין ו pDsRed2-מיטו ידי electroporation כדי לעקוב אחר תהליך mitophagy נגרמת FCCP באמצעות (B) הגדרה לגישת מיקרוסקופיה הזמן לשגות וידאו. BT = נקודת זמן בסיס; נקודת זמן FT = FCCP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Cell איור 3. פיברובלסטים מציג פרקין Recruitme NT לאחר מיטוכונדריאלי ממברנה שלילת קוטביות מושרה על ידי FCCP. EYFP-פרקין (ירוק) טרנסלוקציה לתוך המיטוכונדריה (אדום) היה פיקוח על ידי מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות במהלך נקודת זמן הבזליים (BT) ולהפקיד הממשל FCCP (FT). מ BT = 0, EYFP-פרקין הקרינה המיטוכונדריה אותרו כל 5 דקות. (א) EYFP-פרקין היא מתפזרת homogenously פני תקופת הבסיס כולו ורשת המיטוכונדריה הוא תמים (חצים לבנים). (ב) חלוקה מיטוכונדריאלי בשל שלילת קוטביות הממברנה על ידי FCCP נרשם לפי FT = 5 דקות (חצים לבנים) וגיוס EYFP-פרקין ממברנות המיטוכונדריה פגום התחיל ב FT = 55 דקות (חצים לבנים). התיבות הלבנות מייצגות את האזור המוגדל של הלוחות (5X). לפרטים נוספים בדבר יישום של פרוטוקול הניסוי הזה להתייחס התייחסות 8. (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר).> אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זמן לשגות מיקרוסקופי יכול להיות מוגדר כ הטכניקה המשתרע הדמית תא חי מתוך התבוננות יחידה בזמן כדי התצפית של דינמיקה הסלולר על פני תקופות זמן ארוכות. מתודולוגיה זו להבדיל confocal פשוטה או במיקרוסקופ תא החי משום שהוא מאפשר לצופה לזהות בזמן אמת חלבון יחיד ניאון מתויג אחרי הדינמי שלה בתוך תא חי בודד. למעשה, מיקרוסקופיה confocal יכולה בקלות מזהה חלבונים שכותרתו חיסוניים באמצעות נוגדן פלורסנט, אך היא אינה מאפשרת התבוננות התא והאירוע המולקולרי החייה בסביבה שלה.
מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו משמש בעיקר במחקר ניטור תהליכים מולקולריים תאים מסוגים שונים כגון HEK293 16, הנוירונים העיקריים 17 ותאי הלה 18 אבל יש גם יישום קליני כגון הריון וחיזוי 19,20 aneuploidy. זמן לשגות מיקרוסקופית מספק embryologists עם מידע נוסף על פיתוח העובר במשך הריון קליני, ויתכן כי מידע זה יכול לשמש כדי לשפר את יכולתנו לבחור עובריים מעשי עבור העברה. יתרונות נוספים של השימוש במיקרוסקופ זמן לשגות כוללים פחות טיפול של עוברים ומנות שלהם לתצפיות ביניים, אשר יפחית את הסיכון לאובדן או זיהום בתוך מעבדה 19.
תאים הם מסוגלים לשמור על הומאוסטזיס המיטוכונדריה בריא על ידי משפיל המיטוכונדריה פגום מתפקדת באמצעות mitophagy. Mitophagy הפגום קשור למחלת פרקינסון 21, אפופטוזיס 22, הזדקנות 23 ו -24 סרטן. Mitophagy הוא מונע על ידי האנזים היוביקוויטין פרקין ו PINK1 21. בשל החשיבות של תהליך זה ישמור על מעמדו המיטוכונדריה בריא, סברנו כי חשוב ללמוד את הדינמיקה של האירוע הזה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. הפר המוצעtocol תספק ראיות על איך הומאוסטזיס המיטוכונדריה מושפע בתנאים סלולריים שונים, לרבות שינויי פונקציות ביטוי גנים וחלבונים.
במחקר זה, אנו transfected זמני פיברובלסטים ידי electroporation. השיטה electroporation חל חשמל דופק על מתח אופטימיזציה שנמשך כמה מיקרו שניות על השעיית התא על מנת להגדיל את החדירות של קרום התא על ידי מטריד את bilayer פוספוליפידים של הממברנה. פעולה זו גורמת להיווצרות נקבוביות זמני. הקרום permeabilization המאפשר לדנ"א יוכנס לתא 25. בחרנו את התהליך הזה כדי transfect פיברובלסטים זמני על מנת לקבל יעילות transfection גבוהה של שני פלסמידים EYFP-פרקין ו pDsRed2-מיטו. למעשה, תהליך electroporation הוא כ עשר פעמים יותר יעיל מאשר transfection כימי 26. תהליך הרכישה הדמוית יכול להיות בסכנה על ידי שני exteגורמי rnal; תנודות טמפרטורה, רעידות, לחות וגורמים פנימיים; pH, תנועתיות התא. את electroporation ומעקב פלורסנט שני שלבים נחשבים הקריטי ביותר להצלחת פרוטוקול הניסוי הזה. גם אם את יעילות transfection היא גבוהה יותר מאשר שיטות אחרות, electroporation הורג ~ 20% מכלל תאי electroporated. נושא מרכזי נוסף הוא איכות רכישת תמונות במהלך השלב ניטור. מכיוון שסביבת הסלולר היא דינמית, מטוס המוקד דורש התאמות מתמשכות על מנת לשמור על המיקוד לאורך כל תהליך הרכישה.
יכול להיגרם נזק מיטוכונדריאלי ידי שלילת קוטביות המיטוכונדריה הממברנה סטרס חמצוני. גורמים אלה מביאים לתגובת mitophagic. עדות לכך שלילת קוטביות המיטוכונדריה יכול לגרום mitophagy סלקטיבית מגיע מניסויים נזקי אשר להוביל ייצור ROS ו המיטוכונדריה פציעה 27-30. על מנת לגרום ממ המיטוכונדריהשלילת קוטביות טאי טען בתגובה mitophagic, FCCP שימש 10 protonophore. FCCP הוא ionophore המאפשר פרוטונים לחצות bilayers השומנים התרמה שלילת קוטביות הממברנה. בגישה זו אנו מושרה mitophagy ועקב אחר הדינמיקה של הסמן המולקולרי.
ריכוז FCCP הוא קריטי, כפי שהוא יכול להיות ציטוטוקסיות ולקדם מוות תאי. מאז גישה זו נשענת על התצפיות של תאי חיים, את הריכוז הסופי של FCCP צריך להיות מותאם באופן תלוי בסוג התא כדי לגרום mitophagy בלי לעורר את המנגנונים שיכולים להוביל למוות הסלולר.
בסך הכל, אנחנו חושבים כי בעקבות הדינמיקה של mitophagy, באמצעות EYFP-פרקין כסמן פלורסנט, יספק תובנות חדשות במיטוכונדריה. הסרת סלקטיבי של המיטוכונדריה באמצעות mitophagy הוא תהליך חיוני בשמירה על איכות המיטוכונדריה, כדאיות התא הומאוסטזיס. גישת הדמית לחיות זה יהיה הואlp להבין את התהליך mitophagic בתנאים בריאים הדגיש.
גישות מודרניות יותר מאריכים תצפיות מיקרוסקופיה זמן לשגות מעבר לעשיית סרטים של דינמיקה סלולר. יותר ויותר גבול זה מטושטש כמו טכניקות cytometric משולבות עם טכניקות הדמיה לניטור ומדידת פעילות דינמית של תאים ומבני subcellular 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
