Protocol
1. La electroporación de fibroblastos con ambos vectores de expresión EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito
- Cultivar las células de fibroblastos de embriones de ratón inmortalizada en 10 centímetro placa de cultivo de tejidos utilizando DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C.
- En la confluencia de células 80%, desechar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de solución tampón de fosfato 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 y 1 L de H2O destilada, pH: 7,4).
- Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio DMEM completo, volver a suspender las células y sacar 10 _6; l de la suspensión celular para el recuento hemocitómetro.
NOTA: El hemocitómetro está diseñado de modo que el número de células en un conjunto de 16 cuadrados de las esquinas es equivalente al número de células x 10 4 / ml.
- Seed 1 x 10 6 células en 10 cm placas de cultivo de tejidos de 24 horas antes del proceso de electroporación.
- Descartar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de PBS estéril. Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio completo DMEM y resuspender las células en un tubo de 15 ml.
- Girar las células hacia abajo a 250 xg durante 5 min usando una centrífuga refrigerada (4 ° C). Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS estéril. Girar las células hacia abajo a 250 g durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril, y añadir 100 l Of mezcla de solución para la electroporación (82 l de solución de electroporación V + 18 l de solución Suplementaria 1) al sedimento celular y resuspender suavemente el precipitado pipeteando (Para más detalles, consulte el Manual del usuario). Añadir 2 g de EYFP-Parkin (excitación / emisión 514/527) y 1 g pDsRed2-Mito (excitación / emisión 565/620) a la suspensión celular.
- Transferir la solución a la cubeta estéril utilizando un pasteur desechable (ambas herramientas se proporcionan con el kit) y electroporación utilizando el programa pre-establecido NIH / 3T3 T-030 (solo pulso, tensión de 200 V, la capacitancia 960 mF, tiempo de pulso de 20 milisegundos , el número de impulsos: 1).
- Inmediatamente después de la electroporación, añadir 500 l de medio DMEM completo pre-calentado fresco y sembrar la célula en un 6 cm de la placa de cultivo de tejidos en vivo de imágenes de grado y los incuban en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.
2. Tiempo-Lapso de microscopía de vídeo
- En este punto, preparar un medio específico de formación de imágenes en vivo de proceder con el protocolo experimental. Prepare el soporte de imágenes en vivo de la siguiente manera; mezclar DMEM-fenol libre suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Pre-calentar el medio de imágenes en vivo a 37 ° C en un baño de agua.
- Descartar el medio de las células sometidas a electroporación por aspiración estéril y añadir 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado, utilizando una pipeta P1000 e incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C.
- Durante el período de placa de incubación, afluencia 5% de CO 2 en la cámara del microscopio ya a una temperatura estable de 37 ° C.
- Coloque la placa con las células a electroporación en la cámara del microscopio evitando movimientos u oscilaciones importantes.
- Mediante la interfaz de software, configurar el microscopio con el fin de detectar tanto Fluoreseñales scence de las proteínas de fusión codificadas por los vectores de co-transfectadas, EYFP-Parkin (rango de excitación de 495 a la 510 nm y el rango de emisión 520 a la 550 nm, verde) y el pDsRed2-Mito (máximo de excitación 558 nm y emisión máxima de 583 nm, rojo).
- Abra el software de microscopía de vídeo de lapso de tiempo. En el menú superior seleccionar el FITC para EYFP-Parkin y rodamina para pDsRed2-Mito. En el menú superior seleccionar el aumento (20X).
- El uso de la interfaz de software, buscar la única célula que expresa ambos vectores co-transfectadas y registrar la posición. Repita este paso hasta un mínimo de 10 células se recoge para cada condición experimental (grupo experimental).
- Seleccione el menú "Aplicaciones" y haga clic en Multi Adquisición dimensional. En las ventanas de adquisición multidimensional seleccionar los parámetros necesarios, tales como el número de adquisiciones, el intervalo de tiempo entre cada adquisición y la posición de la célula registrada. Haga clic en "Adquirir"Para iniciar el proceso de adquisición.
- Iniciar la adquisición basal de ambos EYFP-Parkin y la señal fluorescente DsRed2-Mito recogida de imágenes cada 5 min durante un intervalo total de 15 min.
- Para preparar el medio de imágenes en vivo pre-calentado con una concentración de FCCP dos veces mayor que la concentración final de trabajo (0,1 - 10 mM, dependiente del tipo de célula).
- Interrumpir el proceso de adquisición y añadir suavemente 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado con FCCP en la placa dentro de la cámara del microscopio utilizando una pipeta P1000.
- Reiniciar el proceso de adquisición, como se describe anteriormente, durante un periodo total de 3 horas, utilizando la posición de grabado. Guardar todas las imágenes adquiridas con el fin de analizarlas y crear un video del proceso mitophagic cuando la adquisición se ha terminado.
3. Análisis
- Recoge todas las imágenes adquiridas en formato "tiff" en un ordenador personal
- Abrir las imágenes con un suave gráficoWare y definir el intervalo temporal se produjeron de la mitocondrial inducida por despolarización con FCCP a la primera imagen que muestra el reclutamiento de Parkin en la membrana mitocondrial (Las imágenes se adquieren cada 5 min). Repita este análisis para cada celda en el grupo experimental.
- Etiquetar la primera celda de la columna en una hoja de cálculo con el nombre del grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir los intervalos temporales para Parkin reclutamiento de un mínimo de 10 células. Hacer un promedio de los intervalos temporales calculadas para el reclutamiento Parkin y definir la desviación estándar para cada grupo experimental (media ± SD, n = 10).
- Organizar en columnas individuales de los intervalos temporales calculados. Cada columna contiene el n = 10 mediciones del grupo experimental.
- Seleccione el "promedio" de la función en el menú de fórmulas. Seleccionar los datos de la columna. Seleccione la función "desviación estándar" en el menú de fórmulas. select los datos de la columna.
- El uso de un enfoque estadístico, comparar los grupos experimentales aplicando el estadístico apropiado con el fin de definir una diferencia significativa en la dinámica de mitofagia entre los grupos experimentales. (Por ejemplo, dos grupos = t de Student prueba, tres o más grupos = ANOVA más un test post-hoc)
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Representative Results
Aquí, nos muestran cómo la microscopía de vídeo de lapso de tiempo es una técnica poderosa que puede ser utilizado para seguir los acontecimientos moleculares de las proteínas con fluorescencia etiquetado en una sola célula. Los resultados representativos también muestran cómo esta técnica permite la adquisición de imágenes de alta calidad. Cuando las imágenes del proceso molecular, se obtienen, tenemos la oportunidad de analizar de diferentes maneras. Aquí, se analizan el intervalo de tiempo entre la iniciación del proceso de mitofagia inducida, que es el proceso molecular crucial que mantener la homeostasis celular eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas.
Esta técnica funda una amplia gama de aplicaciones. Se puede utilizar ya sea para el control de proceso celular macro tales como la migración celular o eventos moleculares micro mediante el etiquetado de las moléculas clave implicadas en el proceso que tiene que ser estudiado.
o: keep-together.within-page = "1"> mediada por Parkin mitofagia
El selectiva eliminación mediada por Parkin de proceso mitocondrias dañadas y disfuncional se resume en la Figura 1, donde una despolarización de la membrana inducida por el agente desacoplante FCCP desencadena selectiva mitofagia mediada por Parkin, reclutando PINK1 a la membrana mitocondrial externa. Siguiendo, Parkin es reclutado para las mitocondrias dañadas e interactúa con PINK1. Este complejo de Parkin-PINK1 conduce a la ubiquitinación de los orgánulos dañados y su incorporación en autofagosoma, que se fusiona con un lisosoma. Este proceso conocido como mitofagia se considera que es un proceso metabólico crucial para mantener el ambiente celular saludable y permitir la regeneración de las mitocondrias funcionales 8,15.
Protocolo experimental
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 2 muestra una representación esquemática del protocolo experimental y el microscopio configuración utilizada para el seguimiento de la contratación de EYFP-Parkin antes y después del proceso de mitofagia inducida por FCCP.Parkin La contratación para despolariza la membrana mitocondrial
En la Figura 3A, se muestra la distribución Parkin administración FCCP anterior y posterior. Durante los puntos de tiempo basales (BT5, BT10 y BT15 min) EYFP-Parkin (verde) se difunde de forma homogénea por toda la célula y la red de las mitocondrias (rojo) parece ser bien interconectadas. Después de la administración FCCP (FT = 0 min) (Figura 3B), se observa el fraccionamiento de las mitocondrias (FT = 5 min). Sin embargo, EYFP-Parkin está siendo difundida de forma homogénea sin embargo hacia fuera el citoplasma. Mitofagia se estimula a los 55 min después de la administración FCCP,EYFP-Parkin es reclutado en las membranas mitocondriales dañados para desencadenar el proceso de mitofagia (FT = 55).
Figura 1. Representación esquemática de mitofagia mediada por Parkin. Una disminución de potencial de membrana (Ψm) se produce en las mitocondrias dañadas o disfuncionales y puede ser inducida por el agente desacoplante FCCP. La pérdida de potencial de membrana selectiva desencadena mitofagia mediada por Parkin, reclutando PINK1 (rojo) a la membrana mitocondrial externa. Parkin (azul) es reclutado para las mitocondrias dañadas interactuando directamente con PINK1. La presencia de Parkin conduce a la ubiquitinación (amarillo) de los orgánulos dañados y su incorporación en autofagosoma, que se fusiona con un lisosoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Microscopio Set-up y la Representación del protocolo experimental. (A) Vista general de los eventos experimentales descritos en la sección de protocolo. Los eventos experimentales reportados permiten al operador transitoriamente co-transfectar las células con EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito mediante electroporación con el fin de seguir el proceso mitofagia FCCP inducida por el uso de un (B) Dispositivo para los lapsos de tiempo método de microscopía de vídeo. BT = punto de tiempo basal; FT = FCCP punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. celular de fibroblastos Mostrando Parkin Recruitme nt después de despolarización de la membrana mitocondrial inducida por EYFP-Parkin (verde) translocación FCCP. en la mitocondria (roja) se controló mediante microscopía de vídeo de lapso de tiempo durante el punto de tiempo basal (BT) y después de la administración FCCP (FT). De BT = 0, EYFP-Parkin y la fluorescencia mitocondrial se detectaron cada 5 min. (A) EYFP-Parkin se difunde de forma homogénea a través de todo el período basal y la red mitocondrial está intacto (flechas blancas). (B) fraccionamiento mitocondrial debido a la despolarización de la membrana por FCCP se registra a FT = 5 min (flechas blancas) y el reclutamiento EYFP-Parkin a las membranas mitocondriales dañados comenzado a FT = 55 min (flechas blancas). Las cajas blancas representan el área ampliada de los paneles (5x). Para más detalles relativos a la aplicación de este protocolo experimental referencia para hacer referencia 8. (Barra de escala: 10 micras).> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La microscopía de lapso de tiempo se puede definir como la técnica que se extiende imágenes de células vivas de una sola observación en el tiempo a la observación de la dinámica celular durante largos períodos de tiempo. Esta metodología se distingue de un simple o confocal microscopia de células vivas, ya que permite al observador identificar en tiempo real una sola proteína fluorescente con etiquetas y siga su dinámica dentro de una sola célula viva. De hecho, la microscopía confocal puede identifica fácilmente proteínas inmuno-marcada usando anticuerpos fluorescentes, pero que no permite la observación de la célula y el evento molecular en su entorno directo.
La microscopía de vídeo de lapso de tiempo se utiliza principalmente en la investigación de seguimiento de los procesos moleculares en diferentes tipos de células, tales como células HEK293, 16 neuronas primarias 17 y 18 células Hela, pero tiene también aplicación clínica como el embarazo y la predicción de la aneuploidía 19,20. La microscopía de lapso de tiempo proporciona embryologistas con información adicional sobre el desarrollo del embrión para un embarazo clínico, y es posible que esta información puede ser utilizada para mejorar nuestra capacidad de seleccionar embriones viables para la transferencia. Otras ventajas de la utilización de la microscopía de lapso de tiempo incluyen una menor manipulación de embriones y sus platos para observaciones intermedias, lo que reduciría el riesgo de pérdida o contaminación en el laboratorio 19.
Las células son capaces de mantener una homeostasis mitocondrial saludable mediante la degradación de las mitocondrias dañadas y disfuncionales a través mitofagia. Mitofagia defectuoso se relaciona con la enfermedad de Parkinson 21, la apoptosis 22, el envejecimiento y el cáncer 23 24. Mitofagia es impulsado por la ubiquitina ligasa Parkin y PINK1 21. Debido a la importancia de este proceso para mantener un estado saludable mitocondrial, encontramos que es importante para el estudio de la dinámica de este evento usando una microscopía de vídeo de lapso de tiempo. La propuesta proProtocolo proporcionará pruebas de cómo la homeostasis de las mitocondrias se ve afectada en diferentes condiciones celulares, incluyendo cambios en la expresión de genes y proteínas funciones.
En este estudio, transfectadas transitoriamente por electroporación fibroblastos. El método de electroporación se aplica un impulso eléctrico a una tensión optimizada que dura unos pocos microsegundos a la suspensión de células con el fin de aumentar la permeabilidad de la membrana celular por perturbar la bicapa de fosfolípidos de la membrana. Esta acción resulta en la formación de poros temporales. La permeabilización de la membrana permite que el ADN que se introduce en la célula 25. Elegimos este proceso para transfectar de forma transitoria fibroblastos con el fin de tener una mayor eficiencia de transfección de ambos plásmidos EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito. De hecho, el proceso de electroporación es aproximadamente diez veces más eficaz que la transfección química 26. El proceso de adquisición de imágenes puede verse comprometida por tanto extefactores rno; fluctuaciones de temperatura, vibraciones, humedad y factores internos; pH, motilidad celular. La electroporación y seguimiento fluorescente dos pasos que se consideran los más críticos para el éxito de este protocolo experimental. Incluso si la eficiencia de transfección es más alta que otros métodos, la electroporación mata a ~ 20% de las células electroporadas. Otra cuestión importante es la calidad de adquisición de las imágenes durante la etapa de vigilancia. Dado que el entorno celular es dinámica, el plano de enfoque necesita ajustes continuos con el fin de mantener el foco en todo el proceso de adquisición.
daño mitocondrial puede ser causada por la despolarización de la membrana mitocondrial y el estrés oxidativo. Estos factores inducen una respuesta mitophagic. La evidencia de que la despolarización de las mitocondrias puede inducir mitofagia selectiva viene de experimentos fotodaño que conducen a la producción de ROS y el daño mitocondrial 27-30. Con el fin de inducir la mem mitocondrialdespolarización brana y la respuesta mitophagic, FCCP se ha utilizado como protonóforo 10. FCCP es un ionóforo que permite a los protones para cruzar bicapas lipídicas que inducen despolarización de la membrana. Usando este enfoque se indujo mitofagia y seguimos la dinámica del marcador molecular.
La concentración de FCCP es crucial, ya que puede ser citotóxico y promover la muerte celular. Puesto que este enfoque se basa en la observación de células vivas, la concentración final de FCCP tiene que ser ajustado de una manera dependiente tipo de célula con el fin de inducir mitofagia sin desencadenar los mecanismos que conducen a la muerte celular.
En general, pensamos que después de la dinámica de mitofagia, utilizando EYFP-Parkin como un marcador fluorescente, proporcionará nuevos conocimientos sobre la función mitocondrial. La eliminación selectiva de las mitocondrias a través de mitofagia es un proceso crucial en el mantenimiento de la calidad mitocondrial, la viabilidad celular y la homeostasis. Este enfoque de formación de imágenes en vivo se lelp para entender el proceso mitophagic en condiciones saludables y estresados.
Los enfoques modernos están ampliando aún más las observaciones de microscopía de lapso de tiempo más allá de hacer películas de la dinámica celular. Cada vez más esta frontera es borrosa como las técnicas de citometría se están integrando con las técnicas de imagen para el seguimiento y la medición de las actividades dinámicas de células y estructuras subcelulares 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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