Protocol
1.成纤维细胞的电穿孔用两种表达载体EYFP - 帕金和pDsRed2-美图
- 生长在10厘米组织培养板使用的DMEM（Dulbecco氏改进的Eagle培养基）补充有10％胎牛血清，2毫摩尔/升L-谷氨酰胺，100U / ml青霉素介质永生化小鼠胚胎成纤维细胞，和100毫克/毫升链霉素在含有5％的CO 2，在37℃潮湿气氛。
- 在80％的细胞汇合，通过无菌吸弃完整的DMEM培养基并加入10毫升的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）（80克NaCl，2.0g的氯化钾，14.4克Na 2 HPO 4 2.4克KH的2 PO 4和1升蒸馏水2 O，PH值：7.4）。
- 无菌吸弃PBS，并加入1毫升胰蛋白酶EDTA 0.25％。在37℃下孵育该板直至细胞被分离（2 - 3分钟）。加入4 ml完全DMEM培养基，重悬细胞，并取出10 _6;细胞悬浮液的血球计数的湖
注：血细胞计数被设计为使得在一组的16角正方形的细胞数量相当于细胞×10 4个 / ml的数。
- 种子1×10 6细胞到10厘米组织培养皿前24小时到电穿孔过程。
- 无菌吸弃完整的DMEM中，加入10毫升无菌PBS的。无菌吸弃PBS，并加入1毫升胰蛋白酶EDTA 0.25％。在37℃下孵育该板直至细胞被分离（2 - 3分钟）。加入4 ml完全DMEM培养基和悬浮细胞在一个15毫升管。
- 使用冷冻离心机（4℃）纺细胞向下，在250×g离心5分钟。丢弃无菌吸上清，悬浮颗粒在1毫升无菌PBS。旋细胞向下，在250×g离心5分钟，4℃。
- 丢弃无菌吸上清，加100微升Ø˚F解决方案组合为电（82微升电解决方案V +18μl的补充解决方案1）的细胞沉淀和移液器轻轻悬浮颗粒（欲了解更多详情，请参阅用户指南）。在细胞悬液中加入2微克EYFP - 帕金（激发/发射527分之514）和1微克pDsRed2-美图（激发/发射六百二十〇分之五百六十五）的。
- 转移溶液至用一次性巴斯德灭菌反应杯（这两个工具都随试剂盒提供），使用预先设定的程序的NIH / 3T3的U-030（单脉冲，电压200伏，电容960μF，脉冲时间20毫秒电穿孔，脉冲数：1）。
- 电穿孔后，立即在37℃下在含有5％的CO 2的潮湿气氛中加入500μl新鲜预热完全DMEM培养基和种子上将6cm组织培养板活成像同类细胞孵育它们24小时。
2.时间推移视频显微镜
- 在这一点上，准备一个特定的实时成像介质进行与实验协议。准备实时成像介质如下;混合DMEM苯酚 - 自由补充有10％胎牛血清，2毫摩尔/升L-谷氨酰胺，100U / ml青霉素，和100毫克/毫升链霉素。在37℃的水浴中预暖实时成像介质。
- 丢弃电穿孔的细胞无菌抽吸培养基并加入预热实时成像介质1毫升，使用P1000吸管，并在37℃下孵育该板30分钟。
- 在板潜伏期，流入5％的CO 2在显微镜的腔室已经在37℃的稳定温度。
- 放置板的电穿孔细胞进入显微镜的房间，避免重大变动或振荡。
- 使用软件接口，以便同时检测荧光设置显微镜从由共转染载体编码的融合蛋白刘哲民信号，EYFP-帕金（励磁范围495〜510 nm，发射范围520至550nm，绿色）和pDsRed2-三刀（励磁最大558纳米和最大发射583纳米，红）。
- 打开时间推移视频显微镜软件。在上面的菜单中选择EYFP - 帕金和罗丹明对pDsRed2-三刀FITC。在上面的菜单中选择放大倍率（20X）。
- 使用软件界面，寻找既表达共转染载体的单细胞和注册的位置。直到最少10个细胞的收集对于每个实验条件（实验组）重复此步骤。
- 选择菜单“应用程序”，然后单击多维采集。在多维采集窗口选择所需的参数，如收购的数量，每个采集和记录单元的位置之间的时间间隔。点击“采集“开始采集过程。
- 启动基底采集既EYFP-帕金和采集图像每5分钟的15分钟的总时间间隔的DsRed2-三刀荧光信号。
- 制备预热实时成像介质用浓度FCCP的比最终工作浓度高两倍（0.1 - 10μM，细胞类型依赖性的）。
- 中断采集过程，并添加轻轻地加入1ml用FCCP预热实时成像介质的成用吸管P1000显微镜的室内板。
- 如前所述，为3小时的总时间，使用所记录的位置重新开始获取过程。保存所有采集到的图像，以分析它们，当收购是在创建过程mitophagic的视频。
3.分析
- 收集的个人计算机上的所有在“.TIFF”格式所获取的图像
- 与图形软打开图片洁具及定义时间间隔由线粒体引起的去极化与FCCP以显示进入线粒体膜帕金招募的第一个形象出现（图像采集每5分钟）。重复此分析在实验组中的每个小区。
- 标签上与实验组名的电子表格的列的第一个单元。对于每个实验组，测量为帕金招募最少10个细胞的的时间间隔。作出帕金招募所计算的时间间隔的平均值，并定义为每个实验组的标准偏差（平均值±SD，N = 10）。
- 整理成单个计算时间间隔列。每列包含N =实验组10次测量。
- 选择从公式生成器菜单功能“平均”。选择列中的数据。选择从公式生成器菜单功能“标准差”。塞莱克拉列中的数据。
- 使用统计方法，比较以确定在实验组之间mitophagy的动态一个显著差施加适当的统计实验组。 （例如，两组=学生t-检验 ，三个或更多个基团= ANOVA加一个事后检验 ）
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Representative Results
这里，我们显示的时间推移的视频显微镜如何是一个强大的技术，可用于遵循荧光标记的蛋白质的分子事件在单个小区。代表结果还表明，该技术是如何允许采集高质量的图像。当分子过程的图象，而得到的，我们有机会来分析他们以不同的方式。这里，我们分析的感应mitophagy过程，这是至关重要的分子过程，维持细胞稳态选择性地除去受损的线粒体的起始之间的时间间隔。
这种技术开创了广泛的应用范围。它可以用于监控宏蜂窝过程如细胞迁移或通过涉及具有待研究的过程中的关键分子的标记微分子事件中使用。
○：保together.within页=“1”> 帕金介导Mitophagy
选择性帕金介导的清除受损和不正常的线粒体过程的总结在图1中，其中，通过解偶联剂FCCP诱发膜的去极化触发选择性帕金介导mitophagy，招募PINK1至线粒体外膜。之后，帕金被招募到受损的线粒体和PINK1进行交互。这种复杂的帕金，PINK1导致受损的细胞器的泛素化并将其纳入了自噬体，它与溶酶体融合。称为mitophagy该过程被认为是为了保持细胞环境健康和允许官能线粒体8,15的再生的关键代谢过程。
实验协议
核苷酸“FO：保持-together.within页=”1“> 图2示出了实验的协议和用于前和FCCP诱导mitophagy过程之后下列EYFP-帕金招募的显微镜设置的示意性表示。帕金招聘消偏到线粒体膜
在图3A中，我们显示帕金分配前和后FCCP管理。在基底的时间点（BT5，BT10和BT15分钟）EYFP-帕金（绿色）在整个细胞均匀地扩散和线粒体网络（红色）似乎是良好互联。以下FCCP施用（FT = 0分钟）（ 图3B），我们观察到线粒体分馏（FT = 5分钟）。然而，EYFP - 帕金仍在扩散均匀虽然出细胞质中。 Mitophagy在55分钟后FCCP管理的刺激下，EYFP - 帕金是在受损的线粒体膜招募触发mitophagy工艺（FT = 55）。
图1.帕金介导Mitophagy的示意图。递减膜电位（膜电势）的发生损坏或不正常的线粒体，可以通过解偶联剂FCCP诱导。膜电位的损失会触发选择性帕金介导mitophagy，招募PINK1（红）到线粒体外膜。帕金（蓝色）是通过用PINK1直接交互招募到损伤线粒体。帕金的存在导致泛素化损坏的细胞器（黄色），并将其纳入了自噬体，它与溶酶体融合。 请点击此处查看该图的放大版本。
实验方案的图2.显微镜设置和表示。（A）在协议部分中描述的实验事件概述。在报道的实验事件允许操作者瞬时通过电穿孔以遵循使用（B）中的FCCP诱导mitophagy过程建立时间推移的视频显微镜的方法共转染与EYFP-帕金和pDsRed2-三刀细胞。 BT =基础时间点; FT = FCCP时间点。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.成纤维细胞显示帕金Recruitme NT后线粒体膜去极化由FCCP。EYFP -帕金（绿色）易位进入线粒体（红色）诱导被时间推移视频显微镜基础的时间点（BT）在监测和发布FCCP管理（FT）。从BT = 0，EYFP - 帕金和线粒体荧光检测每5分钟。 （A）EYFP -帕金被均匀在整个基础期扩散和线粒体网络是否完好（白色箭头）。由FCCP（B）线粒体分离，由于膜的去极化记录在FT = 5分钟（白色箭头）和EYFP -帕金募集到受损的线粒体膜开始在FT = 55分钟（白色箭头）。白色框，表示面板（5X）的放大区域。有关本实验方案的应用程序的更多详细信息，请参阅参考8。 （比例尺：10微米）。>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
时间推移显微镜可以被定义为，能在一次观测中时间延长活细胞成像到细胞动力学的过长时间的观察的技术。这种方法是从简单的共焦或活细胞显微镜分辨，因为它允许观察者能够实时识别单个荧光标记的蛋白质，并按照其一个单一的活细胞内的动态。事实上，共焦显微镜可以使用荧光抗体容易识别免疫标记的蛋白质，但它不允许观察细胞，并在其实际环境中的分子事件。
时间推移的视频显微术研究主要用于在不同类型的细胞，如HEK293 16，初级神经元17和Hela细胞18监测分子过程，但有亦临床应用，如怀孕和预测非整倍体19,20。时间推移显微镜提供embryolog用约胚胎发育的临床妊娠的其他信息派，这是可能的，这信息可被用于改善我们选择可行的胚胎转移的能力。利用定时显微镜的其他优点包括胚胎的较少处理和其对中间的观察，这将减少在实验室19内的损失或污染的风险菜肴。
细胞能够通过mitophagy降解损坏和不正常的线粒体保持健康的线粒体动态平衡。缺陷mitophagy链接到帕金森氏病21，凋亡22，老化23和癌症24。 Mitophagy由泛素连接酶帕金和PINK1 21驱动。由于这一过程中保持一个健康的线粒体地位的重要性，我们发现它的重要研究动态使用时间推移视频显微镜本次活动。建议亲母育酚将提供线粒体稳态是如何不同的细胞的条件，包括在基因表达和蛋白质的功能变化下的影响的证据。
在这项研究中，我们通过瞬时转染电成纤维细胞。电穿孔方法在优化的电压持续几微秒到细胞悬浮液，以通过干扰膜的磷脂双层，以增加细胞膜的渗透性施加的电脉冲。这个动作将导致暂时的孔的形成。的膜通透性允许被引入到细胞25的DNA。我们选择了这个过程，瞬时转成纤维细胞，才能有两个质粒EYFP - 帕金和pDsRed2-美图更高的转染效率。实际上，电穿孔过程是约10倍，比化学转染26更有效。该图像采集过程可由两个EXTE受到影响RNAL因素;温度波动，振动，湿度和内部因素;的pH值，细胞运动性。电穿孔和荧光跟踪被认为是对本实验方案的成功的最关键的两个步骤。即使转染效率比其它方法高，电穿孔杀死〜的电穿孔的细胞的20％。另一个主要的问题是在监视步骤的图像的采集质量。由于蜂窝环境是动态的，在聚焦平面需要，以维持在整个采集过程中的焦点连续调整。
线粒体损伤可以通过膜的线粒体去极化和氧化应激所引起的。这些因素诱发mitophagic响应。证据表明，线粒体去极化能诱发选择性mitophagy来自光损伤的实验从而导致活性氧的产生和线粒体损伤27-30。为了促使线粒体纪念品brane去极化和mitophagic响应，FCCP已被用作protonophore 10。 FCCP是一种离子载体，使质子穿过脂双层诱导细胞膜去极化。我们使用这种方法诱导mitophagy跟着分子标记的动态。
FCCP的浓度是至关重要的，因为它可以是细胞毒性和促进细胞死亡。由于这种方法依赖于活细胞的观察，FCCP的最终浓度必须在一个细胞类型依赖性以诱导mitophagy而不触发，导致细胞死亡的机制来调节。
总体而言，我们认为mitophagy的动态，用EYFP - 帕金作为荧光标记下，将提供新的见解线粒体功能。经由mitophagy选择性除去线粒体的是在维持线粒体的质量，细胞活力和稳态的关键过程。这种实时成像的方法，他将LP了解健康，并强调条件下mitophagic过程。
现代方法进一步超出使细胞动力学的电影时间推移显微镜观察。由于越来越多的技术，流式细胞仪正在与成像技术集成了监视和测量细胞和亚细胞结构31动态活动这个边界是模糊的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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