Protocol
1. L'électroporation de fibroblaste avec deux vecteurs d'expression EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito
- Cultiver les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris immortalisée sur 10 cm plaque de culture tissulaire en utilisant du DMEM (le milieu de Eagle modifié par Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C.
- À 80% de confluence des cellules, éliminer le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml d' une solution tampon de phosphate de 1x stérile (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 et 1 L distillation de H 2 O, pH: 7,4).
- Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu complet DMEM, remettre les cellules et sortir 10 _6, l de la suspension cellulaire pour le comptage hémocytomètre.
NOTE: Le hémocytomètre est conçu de telle sorte que le nombre de cellules dans une série de 16 cases d'angle est égal au nombre de cellules x 10 4 / ml.
- Semences 1 x 10 6 cellules sur 10 cm boîtes de culture tissulaire de 24 heures avant le processus d'électroporation.
- Jeter le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml de PBS stérile. Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu DMEM complet et remise en suspension des cellules dans un tube de 15 ml.
- Faites tourner les cellules vers le bas à 250 xg pendant 5 min en utilisant une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C). Jeter le surnageant par aspiration stérile et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile. Faites tourner les cellules vers le bas à 250 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Jeter le surnageant par aspiration stérile, et ajouter 100 pi of solution mélange pour l'électroporation (82 pi de solution d'électroporation V + 18 pi de solution supplémentaire 1) au culot cellulaire et resuspendre doucement le culot par pipetage (Pour plus de détails reportez-vous au guide de l'utilisateur). Ajouter 2 pg de EYFP-Parkin (excitation / émission 514/527) et 1 ug Mito-pDsRed2 (excitation / émission 565/620) à la suspension cellulaire.
- Transférer la solution dans la cuvette stérile à l'aide d'un pasteur jetable (les deux outils sont fournis avec le kit) et l'électroporation en utilisant le programme de pré-série NIH / 3T3 U-030 (impulsion unique, tension 200 V, capacité 960 uF, temps d'impulsion de 20 millisecondes , nombre d'impulsions: 1).
- Immédiatement après l'électroporation, ajouter 500 pi de milieu préchauffé frais DMEM complet et ensemencer la cellule sur un 6 cm plaque de culture tissulaire live-imagerie de qualité et de les incuber dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.
2. Time-Lapse Video Microscopy
- À ce stade, préparer un support d'imagerie en direct spécifique de procéder au protocole expérimental. Préparer le milieu de l'imagerie en direct de la manière suivante; mélanger du DMEM exempt de phénol supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine. Préchauffer le moyen d'imagerie en temps réel à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Jeter le milieu des cellules électroporées par aspiration stérile et ajouter 1 ml de milieu préchauffé imagerie en temps réel, en utilisant une pipette P1000 et incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 ° C.
- Pendant la période d'incubation de la plaque, l' afflux 5% de CO 2 dans la chambre du microscope déjà à une température stable de 37 ° C.
- Placer la plaque avec les cellules électroporées dans la chambre du microscope évitant les mouvements ou oscillations majeures.
- Utilisation de l'interface du logiciel, réglez le microscope afin de détecter à la fois fluoreles signaux de Scence des protéines de fusion codées par les vecteurs cotransfectées, EYFP-Parkin (plage d'excitation 495-510 nm et la plage d'émission de 520-550 nm, vert) et le pDsRed2-Mito (excitation maximum de 558 nm et une émission maximale de 583 nm, rouge).
- Ouvrez le logiciel de microscopie vidéo time-lapse. Dans le menu supérieur sélectionnez le FITC pour EYFP-Parkin et rhodamine pour pDsRed2-Mito. Dans le menu supérieur sélectionnez le grossissement (20X).
- Utilisation de l'interface du logiciel, recherchez la cellule unique exprimant les deux vecteurs co-transfectées et enregistrer la position. Répétez cette étape jusqu'à un minimum de 10 cellules est recueilli pour chaque condition expérimentale (groupe expérimental).
- Sélectionnez le menu "Applications" et cliquez sur multi dimensionnelle Acquisition. Dans les fenêtres multi dimensionnelles Acquisition sélectionner les paramètres nécessaires, tels que le nombre d'acquisitions, l'intervalle de temps entre chaque acquisition et la position de la cellule enregistrée. Cliquez sur "Acquire"Pour démarrer le processus d'acquisition.
- Lancer l'acquisition basale des deux EYFP-Parkin et DsRed2-Mito signal fluorescent collecte des images toutes les 5 minutes pour un intervalle total de 15 min.
- Préparer moyen d'imagerie en temps réel préchauffée à une concentration de FCCP deux fois supérieure à la concentration finale de travail (0,1 à 10 uM, dépendant du type cellulaire).
- Interrompre le processus d'acquisition et ajouter doucement 1 ml de pré-chauffé support d'imagerie en temps réel avec FCCP dans la plaque à l'intérieur de la chambre du microscope à l'aide d'une pipette P1000.
- Redémarrer le processus d'acquisition, comme décrit précédemment, pendant une durée totale de 3 heures, à l'aide de la position enregistrée. Enregistrer toutes les images acquises afin de les analyser et de créer une vidéo du processus mitophagic lorsque l'acquisition est terminée.
3. Analyse
- Collecter toutes les images acquises en format ".tiff" sur un ordinateur personnel
- Ouvrez les images avec un chiffon doux graphiqueWare et définir l'intervalle de temps se sont produites à partir de la mitochondriale induite par dépolarisation au FCCP à la première image montrant le recrutement de Parkin dans la membrane mitochondriale (Les images sont acquises toutes les 5 minutes). Répéter cette analyse pour chaque cellule dans le groupe expérimental.
- Étiquette de la première cellule de la colonne sur une feuille de calcul avec le nom du groupe expérimental. Pour chaque groupe expérimental, mesurer les intervalles temporels pour Parkin recrutement d'un minimum de 10 cellules. Faire une moyenne des intervalles temporels calculés pour le recrutement Parkin et de définir l'écart-type pour chaque groupe expérimental (moyenne ± SD, N = 10).
- Organiser en colonnes les intervalles temporels calculés simples. Chaque colonne contient n = 10 mesures du groupe expérimental.
- Sélectionnez la fonction «moyenne» dans le menu Formula Builder. Sélectionner les données contenues dans la colonne. Sélectionnez la fonction "Déviation standard" dans le menu Formula Builder. Select les données contenues dans la colonne.
- En utilisant une approche statistique, comparer les groupes expérimentaux appliquant la statistique appropriée afin de définir une différence significative dans la dynamique de mitophagy entre les groupes expérimentaux. (Par exemple, deux groupes = test t de Student, trois ou plusieurs groupes = ANOVA plus un test post-hoc)
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Representative Results
Ici, nous montrons comment la microscopie time-lapse vidéo est une technique puissante qui peut être utilisé pour suivre les événements moléculaires des protéines par fluorescence marqués dans une seule cellule. Les résultats représentatifs montrent aussi comment cette technique permet l'acquisition d'images de haute qualité. Lorsque les images du processus moléculaire, sont obtenus, nous avons la possibilité de les analyser de différentes manières. Ici, nous analysons l'intervalle de temps entre le début du processus de mitophagy induite, qui est le processus moléculaire crucial que maintenir l'homéostasie cellulaire éliminer sélectivement les mitochondries endommagées.
Cette technique fonde une large gamme d'applications. Il peut être utilisé soit pour la surveillance de processus cellulaire macro tels que la migration des cellules ou des événements moléculaires micro grâce à l'étiquetage des molécules clés impliquées dans le processus qui doit être étudié.
o: keep-together.within-page = "1"> Mitophagy Parkin médiée
L'élimination sélective Parkin médiée par des processus de mitochondries endommagées et dysfonctionnel est résumée à la figure 1, où une dépolarisation membranaire induite par l'agent de désolidarisation FCCP déclenche sélective mitophagy Parkin médiation, le recrutement PINK1 à la membrane mitochondriale externe. Après, Parkin est recruté pour les mitochondries endommagées et interagit avec PINK1. Ce complexe Parkin-PINK1 conduit à l'ubiquitination de l'organite endommagé et son incorporation dans un autophagosome, qui fusionne avec un lysosome. Ce processus connu sous le nom mitophagy est considéré comme un processus métabolique essentiel pour maintenir l'environnement cellulaire sain et permettre la régénération des mitochondries fonctionnelles 8,15.
Protocole expérimental
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> La figure 2 montre une représentation schématique du protocole expérimental et le microscope set-up utilisé pour suivre le recrutement de EYFP-Parkin avant et après le processus de mitophagy FCCP-induite.Parkin Recruitment à dépolarisée mitochondrial Membrane
Sur la figure 3A, nous montrons la distribution Parkin administration FCCP avant et après. Pendant les moments basales (BT5, BT10 et BT15 min) EYFP-Parkin (vert) est diffusé de manière homogène dans toute la cellule et le réseau de mitochondries (Rouge) semble être bien interconnecté. Après administration FCCP (FT = 0 min) (figure 3B), on observe des mitochondries fractionnement (FT = 5 min). Cependant, EYFP-Parkin est encore homogène diffusé si le cytoplasme. Mitophagy est stimulée à l'administration post-FCCP 55 min,EYFP-Parkin est recruté au niveau des membranes mitochondriales endommagés pour déclencher le processus de mitophagy (FT = 55).
Figure 1. Représentation schématique de Parkin à médiation Mitophagy. Une diminution du potentiel de membrane (Ψm) est présent dans les mitochondries endommagées ou dysfonctionnelles et peut être induite par l'agent de désaccouplement FCCP. La perte de potentiel de membrane sélective déclenche mitophagy Parkin-médiée, le recrutement PINK1 (rouge) à la membrane mitochondriale externe. Parkin (Bleu) est recruté pour les mitochondries endommagées en interagissant directement avec PINK1. La présence de Parkin conduit à l'ubiquitination (jaune) de l'organite endommagé et son incorporation dans un autophagosome, qui fusionne avec un lysosome. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Microscope Set-up et représentation du protocole expérimental. (A) Vue d' ensemble des événements expérimentaux décrits dans la section de protocole. Les événements expérimentaux rapportés permettent à l'opérateur de transitoirement co-transfecter les cellules avec EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito par électroporation afin de suivre le processus de mitophagy induite par FCCP- en utilisant un (B) mise en place pour time-lapse approche de microscopie vidéo. BT = point de temps de base; FT = FCCP point de temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Fibroblast cellulaire Affichage Parkin Recruitme nt après mitochondrial dépolarisation de la membrane induite par FCCP. EYFP-Parkin (vert) translocation dans les mitochondries (rouge) a été surveillé par vidéo time-lapse microscopie au cours du point de temps de base (BT) et après l' administration du FCCP (FT). De BT = 0, EYFP-Parkin et la fluorescence mitochondrial ont été détectées toutes les 5 min. (A) EYFP-Parkin de façon homogène sur toute la diffusées période de base et le réseau mitochondrial intact (flèches blanches). (B) fractionnement mitochondrial en raison de dépolarisation de la membrane par FCCP est enregistré à FT = 5 min (flèches blanches) et le recrutement EYFP-Parkin aux membranes mitochondriales endommagées commencé à FT = 55 min (flèches blanches). Les boîtes blanches représentent la zone agrandie des panneaux (5 x). Pour plus de détails concernant l'application de ce protocole expérimental se référer à la référence 8. (Barre d'échelle: 10 um).> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Vidéomicroscopie peut être définie comme la technique qui étend l'imagerie des cellules vivantes à partir d'une seule observation dans le temps pour l'observation de la dynamique cellulaire sur de longues périodes de temps. Cette méthodologie se distingue d'un confocal simple, ou la microscopie de cellules vivantes, car elle permet à l'observateur d'identifier en temps réel une seule protéine fluorescente étiquetée et suivre sa dynamique à l'intérieur d'une seule cellule vivante. En fait, la microscopie confocale peut facilement identifie des protéines immuno-marqué en utilisant un anticorps fluorescent, mais il ne permet pas l'observation de la cellule et l'événement moléculaire dans son environnement réel.
La vidéo microscopie time-lapse est principalement utilisé dans la recherche de suivi des processus moléculaires dans différents types cellulaires tels que HEK293 16, les neurones primaires 17 et les cellules HeLa 18 mais a également des applications cliniques telles que la grossesse et la prévision de l' aneuploïdie 19,20. Vidéomicroscopie fournit embryologists avec des informations supplémentaires sur le développement de l'embryon pour une grossesse clinique, et il est possible que cette information peut être utilisée pour améliorer notre capacité à sélectionner des embryons viables pour le transfert. D' autres avantages de l'utilisation de la microscopie time-lapse comprennent moins de manipulation d'embryons et de leurs plats pour les observations intermédiaires, ce qui réduirait le risque de perte ou de contamination au sein du laboratoire 19.
Les cellules sont capables de maintenir une homéostasie mitochondriale saine en dégradant les mitochondries endommagées et dysfonctionnelles par mitophagy. Mitophagy défectueux est lié à la maladie de Parkinson 21, l' apoptose 22, le vieillissement et le cancer 23 24. Mitophagy est entraîné par l'ubiquitine - ligase Parkin et 21 PINK1. En raison de l'importance de ce processus pour maintenir un statut mitochondrial sain, nous avons trouvé qu'il est important d'étudier la dynamique de cet événement en utilisant une vidéo microscopie time-lapse. Le pro proposétocol fournira des preuves sur la façon dont les mitochondries homéostasie est affecté dans différentes conditions cellulaires, y compris les changements dans les fonctions de l'expression des gènes et des protéines.
Dans cette étude, nous avons transfecté des fibroblastes par transitoirement électroporation. La méthode d'électroporation applique une impulsion électrique optimisée à une tension qui dure quelques microsecondes à la suspension cellulaire afin d'augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire en perturbant la bicouche phospholipidique de la membrane. Cette action se traduit par la formation de pores temporaires. La perméabilisation de la membrane permet à l'ADN d'être introduit dans la cellule 25. Nous avons choisi ce processus pour transfecter transitoirement des fibroblastes afin d'avoir une plus grande efficacité de transfection des deux plasmides EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito. En effet, le processus d'électroporation est environ dix fois plus efficace que la transfection chimique 26. Le processus d'acquisition d'images peut être compromise par les deux extefacteurs rne; les fluctuations de température, les vibrations, l'humidité et les facteurs internes; le pH, la motilité cellulaire. L'électroporation et le suivi fluorescent sont deux étapes considérées comme les plus critiques pour le succès de ce protocole expérimental. Même si l'efficacité de transfection est supérieur à d'autres procédés, l'électroporation ~ tue 20% des cellules électroporées. Un autre problème majeur est la qualité d'acquisition des images lors de l'étape de surveillance. Depuis l'environnement cellulaire est dynamique, le plan de mise au point nécessite des ajustements continus afin de maintenir la mise au point tout au long du processus d'acquisition.
dommages mitochondriale peut être causée par la dépolarisation mitochondriale membrane et le stress oxydatif. Ces facteurs induisent une réponse mitophagic. La preuve que les mitochondries dépolarisation peut induire mitophagy sélective provient des expériences de photovieillissement qui conduisent à la production de ROS et de blessures mitochondrial 27-30. Afin d'induire mem mitochondrialbrane dépolarisation et la réponse mitophagic, FCCP a été utilisé comme protonophore 10. FCCP est un ionophore qui permet aux protons de traverser bicouches lipidiques induisant dépolarisation de la membrane. En utilisant cette approche, nous mitophagy induit et suivi la dynamique du marqueur moléculaire.
La concentration de FCCP est crucial, car il peut être cytotoxique et de promouvoir la mort cellulaire. Étant donné que cette approche repose sur l'observation des cellules vivantes, la concentration finale de FCCP doit être ajusté d'une manière dépendante du type cellulaire afin d'induire mitophagy sans déclencher les mécanismes qui conduisent à la mort cellulaire.
Dans l'ensemble, nous pensons que la suite de la dynamique de mitophagy, en utilisant EYFP-Parkin comme un marqueur fluorescent, fournira de nouvelles connaissances sur la fonction mitochondriale. L'élimination sélective des mitochondries par l'intermédiaire mitophagy est un processus crucial dans le maintien de la qualité mitochondriale, la viabilité des cellules et de l'homéostasie. Cette approche en direct d'imagerie sera illp pour comprendre le processus mitophagic dans des conditions saines et stressées.
Les approches modernes étendent encore les observations de microscopie time-lapse au-delà de la réalisation de films de la dynamique cellulaire. De plus en plus cette limite est floue que les techniques cytométrie sont intégrées avec des techniques d'imagerie pour le suivi et la mesure des activités dynamiques de cellules et structures subcellulaires 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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