Protocol
1. elettroporazione di fibroblasti con entrambi vettori di espressione EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito
- Far crescere le cellule di fibroblasti embrionali di topo immortalato su 10 centimetri piatto di tessuto-cultura con DMEM (modificata mezzo di Eagle di Dulbecco) medio supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml streptomicina in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C.
- Alla confluenza cella 80%, scartare il mezzo DMEM completo per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di 1x sterile tampone fosfato (PBS) (80 g di NaCl, 2,0 g di KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g di KH 2 PO 4 e 1 L distillata H 2 O, PH: 7.4).
- Eliminare il PBS mediante aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (2 - 3 min). Aggiungere 4 ml di terreno DMEM completo, sospendere nuovamente le cellule ed estrarre 10 _6; l di sospensione cellulare per il conteggio emocitometro.
NOTA: Il emocitometro è progettato in modo che il numero di cellule in un set di 16 quadrati angolo è equivalente al numero di cellule x 10 4 / ml.
- Seed 1 x 10 6 cellule su 10 cm piatti di coltura di tessuti 24 ore prima del processo di elettroporazione.
- Eliminare il terreno completo DMEM per aspirazione sterile e aggiungere 10 ml di PBS sterile. Eliminare il PBS mediante aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (2 - 3 min). Aggiungere 4 ml di terreno DMEM completo e risospendere le cellule in una provetta da 15 ml.
- Spin le celle in basso a 250 xg per 5 minuti usando un-centrifuga refrigerata (4 ° C). Eliminare il supernatante mediante aspirazione sterile e risospendere il pellet in 1 ml di PBS sterile. Spin le cellule giù a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante tramite aspirazione sterili, e aggiungere 100 ml of soluzione mix per l'elettroporazione (82 ml di soluzione elettroporazione V + 18 ml di soluzione supplementare 1) al pellet e risospendere delicatamente il pellet pipettando (Per maggiori dettagli fare riferimento alla guida per l'utente). Aggiungere 2 mg di EYFP-Parkin (eccitazione / emissione 514/527) e 1 mg pDsRed2-Mito (eccitazione / emissione 565/620) alla sospensione cellulare.
- Trasferire la soluzione nella cuvetta sterile utilizzando una Pasteur monouso (entrambi gli strumenti sono forniti con il kit) e l'elettroporazione utilizzando il programma di pre-set NIH / 3T3 U-030 (impulso singolo, tensione a 200 V, capacità 960 uF, tempo di impulso 20 millisecondi , numero di impulsi: 1).
- Subito dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 ml di mezzo fresco pre-riscaldato DMEM completo e inseminare la cella in 6 cm Piatto tessuto-coltura live-imaging grado e incubate in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
2. Time-Lapse Video Microscopia
- A questo punto, preparare un supporto specifico imaging dal vivo di procedere con il protocollo sperimentale. Preparare il supporto di immagini dal vivo come segue; miscela DMEM privo di fenolo supplementato con 10% di siero fetale bovino, 2 mmol / l L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo di imaging in tempo reale a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Eliminare il medium delle cellule elettroporate di aspirazione sterile e aggiungere 1 ml di terreno di immagini dal vivo pre-riscaldato, con una pipetta P1000 e incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C.
- Durante il periodo di incubazione piatto, afflusso 5% di CO 2 nella camera già del microscopio ad una temperatura stabile di 37 ° C.
- Posizionare la piastra con le cellule elettroporate nella camera del microscopio evitando i principali movimenti o oscillazioni.
- Utilizzando l'interfaccia software, impostare il microscopio per rilevare sia fluoresegnali scence dalle proteine di fusione codificate dai vettori co-trasfettate, EYFP-Parkin (range eccitazione 495-510 nm e la gamma di emissione 520-550 nm, verde) e il pDsRed2-Mito (eccitazione massima 558 nm ed emissione massima 583 nm, rosso).
- Aprire il software di video microscopia time-lapse. Nel menu superiore selezionare il FITC per EYFP-Parkin e rodamina per pDsRed2-Mito. Nel menu superiore selezionare l'ingrandimento (20X).
- Utilizzando l'interfaccia del software, cercare la singola cellula che esprime entrambi i vettori co-trasfettate e registrare la posizione. Ripetere questa operazione fino a quando viene raccolto un minimo di 10 cellule per ogni condizione sperimentale (gruppo sperimentale).
- Selezionare il menu "Applicazioni" e cliccare su Multi Dimensional acquisizione. Nelle finestre Multi Dimensional Acquisizione selezionare i parametri necessari, quali il numero di acquisizioni, l'intervallo di tempo tra ogni acquisizione e la posizione della cella registrata. Clicca su "Acquisisci"Per avviare il processo di acquisizione.
- Avviare l'acquisizione basale sia EYFP-Parkin e segnale fluorescente DsRed2-Mito raccolta immagini ogni 5 min per un intervallo totale di 15 min.
- Preparare pre-riscaldato mezzo di imaging in tempo reale con una concentrazione di FCCP due volte superiore alla concentrazione finale di lavoro (0,1 - 10 pM, dipendente dal tipo cellulare).
- Interrompere il processo di acquisizione e aggiungere delicatamente 1 ml di pre-riscaldato medie immagini dal vivo con FCCP nella piastra all'interno della camera del microscopio con una pipetta P1000.
- Riavviare il processo di acquisizione come precedentemente descritto, per un periodo totale di 3 ore, utilizzando la posizione registrata. Salvare tutte le immagini acquisite per analizzare e creare un video del processo mitophagic quando l'acquisizione è finita.
3. Analisi
- Raccogliere tutte le immagini acquisite in formato ".tiff" su un personal computer
- Aprire le immagini con una grafica morbidaware e definire l'intervallo temporale si è verificato dal mitocondriale indotta depolarizzazione con FCCP alla prima immagine che mostra il reclutamento di Parkin nella membrana mitocondriale (Le immagini sono acquisite ogni 5 minuti). Ripetere questa analisi per ogni cella nel gruppo sperimentale.
- Etichettare la prima cella della colonna su un foglio con il nome sperimentale gruppo. Per ogni gruppo sperimentale, misurare gli intervalli temporali per Parkin assunzione di un minimo di 10 cellule. Fare una media degli intervalli temporali calcolati per Parkin reclutamento e definire la deviazione standard per ciascun gruppo sperimentale (Media ± SD, N = 10).
- Organizzare in colonne singoli intervalli temporali calcolati. Ogni colonna contiene il n = 10 misurazioni del gruppo sperimentale.
- Selezionare la "media" funzione dal menu Formula Builder. Selezionare i dati nella colonna. Selezionare la funzione "deviazione standard" dal menu Formula Builder. Select i dati nella colonna.
- Usando un approccio statistico, confrontare i gruppi sperimentali che applicano la statistica appropriata per definire una differenza significativa nella dinamica mitophagy tra i gruppi sperimentali. (Per esempio, due gruppi = di Student t-test, tre o più gruppi = ANOVA più un test post-hoc)
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Representative Results
Qui, si mostra come il video time-lapse microscopia è una tecnica potente che può essere utilizzato per seguire gli eventi molecolari di proteine fluorescenti-taggato in una singola cella. I risultati rappresentativi mostrano anche come questa tecnica permette l'acquisizione di immagini di alta qualità. Quando le immagini del processo molecolare, si ottengono, abbiamo la possibilità di analizzare in modi diversi. Qui, analizziamo l'intervallo di tempo tra l'inizio del processo mitophagy indotta, che è il processo molecolare cruciale che mantenere l'omeostasi cellulare rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati.
Questa tecnica fonda una vasta gamma di applicazioni. Può essere utilizzato per monitorare macro processo cellulare come migrazione cellulare o eventi molecolari micro attraverso l'etichettatura delle molecole chiave coinvolte nel processo che deve essere studiato.
o: keep-together.within-page = "1"> Parkin-mediata Mitophagy
La rimozione selettiva Parkin-mediata del processo mitocondri danneggiati e disfunzionale è riassunta nella figura 1, dove una depolarizzazione della membrana indotta dall'agente disaccoppiamento FCCP innesca selettivo mitophagy Parkin-mediata, reclutando PINK1 alla membrana mitocondriale esterna. In seguito, Parkin è reclutato per i mitocondri danneggiati e interagisce con PINK1. Questo complesso Parkin-PINK1 porta alla ubiquitinazione del organello danneggiato e la sua integrazione in un autofagosoma, che si fonde con un lisosoma. Questo processo noto come mitophagy è considerato un processo metabolico cruciale al fine di mantenere l'ambiente cellulare sano e permettere la rigenerazione dei mitocondri funzionali 8,15.
protocollo sperimentale
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 2 mostra una rappresentazione schematica del protocollo sperimentale e il microscopio set-up utilizzato per seguire il reclutamento di EYFP-Parkin prima e dopo il processo mitophagy FCCP-indotta.Parkin reclutamento di depolarizzato membrana mitocondriale
Nella Figura 3A, mostriamo la distribuzione Parkin amministrazione prima e dopo l'FCCP. Durante i punti di tempo basali (BT5, Bt10 e BT15 min) EYFP-Parkin (verde) è omogeneamente diffuso in tutto il cellulare e la rete di mitocondri (rosso) sembra essere ben interconnessa. A seguito di somministrazione FCCP (FT = 0 min) (Figura 3B), osserviamo mitocondri frazionamento (FT = 5 min). Tuttavia, EYFP-Parkin è ancora omogeneamente diffuso anche se fuori il citoplasma. Mitophagy è stimolato a amministrazione postale FCCP 55 min,EYFP-Parkin è reclutato a livello delle membrane mitocondriali danneggiate per innescare il processo mitophagy (FT = 55).
Figura 1. Rappresentazione schematica di Parkin-mediata Mitophagy. Una diminuzione del potenziale di membrana (Ψm) si verifica nei mitocondri danneggiati o disfunzionali e può essere indotta dall'agente disaccoppiamento FCCP. La perdita di potenziale di membrana innesca selettivo mitophagy Parkin-mediata, reclutando PINK1 (rosso) alla membrana mitocondriale esterna. Parkin (blu) viene reclutato per i mitocondri danneggiati interagendo direttamente con PINK1. La presenza di Parkin porta alla ubiquitinazione (giallo) del organello danneggiata e la sua integrazione in un autofagosoma, che si fonde con un lisosoma. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Microscopio Set-up e Rappresentazione del protocollo sperimentale. (A) Panoramica degli eventi sperimentali descritte nella sezione del protocollo. Gli eventi sperimentali riportati consentono all'operatore di transitoriamente co-trasfezione delle cellule con EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito mediante elettroporazione, al fine di seguire il processo mitophagy FCCP indotta utilizzando un (B) di set-up per il time-lapse approccio di video microscopia. BT = punto di tempo basale; FT = FCCP punto di tempo. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. fibroblasti cellulari che mostrano Parkin Recruitme nt dopo membrana mitocondriale depolarizzazione indotta da EYFP-Parkin (verde) traslocazione nei mitocondri (rosso) FCCP. è stato monitorato da microscopio video time-lapse durante il punto di tempo basale (BT) e inviare amministrazione FCCP (FT). Da BT = 0, EYFP-Parkin e fluorescenza mitocondriale sono stati rilevati ogni 5 minuti. (A) EYFP-Parkin è omogeneamente diffuso in tutto il tutto il periodo basale e la rete mitocondriale è intatto (frecce bianche). (B) frazionamento mitocondriale a causa di depolarizzazione della membrana da FCCP è registrato a FT = 5 min (frecce bianche) e il reclutamento EYFP-Parkin alle membrane mitocondriali danneggiate iniziato a FT = 55 min (frecce bianche). Le caselle bianche rappresentano l'area ingrandita dei pannelli (5X). Per maggiori dettagli riguardanti l'applicazione di questo protocollo sperimentale riferimento a riferimento 8. (Bar Scala: 10 micron).> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
microscopia time-lapse può essere definita come la tecnica che si estende cellule vive da una singola osservazione in tempo per l'osservazione delle dinamiche cellulari per lunghi periodi di tempo. Questa metodologia è distinto da un semplice confocale microscopia cellule in vivo perché permette all'osservatore di identificare in tempo reale una singola proteina fluorescente-tag e seguire la sua dinamica all'interno di una singola cella vivo. Infatti, la microscopia confocale può facilmente identifica proteine immuno-marcato utilizzando anticorpi fluorescenti, ma non consente osservando la cella e l'evento molecolare nel suo ambiente vivo.
Il microscopio video time-lapse è utilizzato principalmente nella ricerca monitoraggio dei processi molecolari in diversi tipi di cellule, come HEK293 16, neuroni primari 17 e 18 cellule HeLa, ma ha anche l'applicazione clinica come la gravidanza e la previsione aneuploidie 19,20. Time-lapse microscopia fornisce embryologists con ulteriori informazioni sullo sviluppo embrionale per una gravidanza clinica, ed è possibile che queste informazioni possono essere utilizzate per migliorare la nostra capacità di selezionare gli embrioni vitali per il trasferimento. Ulteriori vantaggi dell'uso di microscopia time-lapse includono meno la manipolazione degli embrioni e dei loro piatti per osservazioni intermedie, che ridurrebbe il rischio di perdita o contaminazione all'interno del laboratorio 19.
Le cellule sono in grado di mantenere un sano omeostasi mitocondriale degradando mitocondri danneggiati e disfunzionali attraverso mitophagy. Mitophagy difettoso è legata alla malattia di Parkinson 21, l'apoptosi 22, invecchiamento e cancro 23 24. Mitophagy è guidato dalla ubiquitina ligasi Parkin e PINK1 21. Data l'importanza di questo processo per mantenere uno status mitocondriale sano, abbiamo trovato importante per studiare la dinamica di questo evento con un video microscopia time-lapse. Il pro propostoProtocollo fornirà la prova di come i mitocondri omeostasi è influenzato in diverse condizioni di cellulari, compresi i cambiamenti nelle funzioni di espressione genica e di proteine.
In questo studio, abbiamo trasfettate fibroblasti mediante elettroporazione. Il metodo elettroporazione applica un impulso elettrico ad una tensione ottimale della durata di alcuni microsecondi alla sospensione cellulare per aumentare la permeabilità della membrana cellulare disturbando il doppio strato fosfolipidico della membrana. Questa azione provoca la formazione di pori temporanei. La permeabilizzazione della membrana consente il DNA da introdurre nella cella 25. Abbiamo scelto questo processo trasfezione transitoriamente fibroblasti in modo da avere una maggiore efficienza trasfezione di entrambi i plasmidi EYFP-Parkin e pDsRed2-Mito. Infatti, il processo di elettroporazione è circa dieci volte più efficace di trasfezione chimica 26. Il processo di acquisizione immagini possono essere compromesso da entrambi exteFattori rnal; sbalzi di temperatura, vibrazioni, umidità e fattori interni; pH, la motilità cellulare. L'elettroporazione e il monitoraggio fluorescenti sono due passaggi considerato il più critico per il successo di questo protocollo sperimentale. Anche se l'efficienza di trasfezione è superiore ad altri metodi, l'elettroporazione uccide ~ 20% delle cellule elettroporate. Un'altra questione importante è la qualità di acquisizione delle immagini durante la fase di monitoraggio. Poiché l'ambiente cellulare è dinamico, il piano di messa a fuoco deve continui aggiustamenti per mantenere l'attenzione durante il processo di acquisizione.
danno mitocondriale può essere causato da membrane depolarizzazione mitocondriale e lo stress ossidativo. Questi fattori inducono una risposta mitophagic. La prova che i mitocondri depolarizzazione può indurre mitophagy selettivo viene da esperimenti fotodanneggiamento che portano alla produzione di ROS e lesioni mitocondriale 27-30. Al fine di indurre mem mitocondrialedepolarizzazione brane e la risposta mitophagic, FCCP è stato utilizzato come protonophore 10. FCCP è uno ionoforo che permette ai protoni di attraversare doppi strati lipidici che inducono depolarizzazione della membrana. Usando questo approccio abbiamo indotto mitophagy e seguito la dinamica del marcatore molecolare.
La concentrazione di FCCP è fondamentale, in quanto può essere citotossici e promuovere la morte cellulare. Poiché questo approccio si basa sull'osservazione delle cellule viventi, la concentrazione finale di FCCP deve essere regolata in modo dipendente tipo cellulare per indurre mitophagy senza innescare i meccanismi che portano alla morte cellulare.
Nel complesso, riteniamo che a seguito della dinamica di mitophagy, utilizzando EYFP-Parkin come un marcatore fluorescente, fornirà nuovi elementi in funzione mitocondriale. La rimozione selettiva dei mitocondri tramite mitophagy è un processo cruciale nel mantenimento della qualità mitocondriale, la vitalità cellulare e l'omeostasi. Questo approccio immagini dal vivo sarà luilp per comprendere il processo di mitophagic in condizioni sane e stressate.
approcci moderni stanno estendendo ulteriormente time-lapse osservazioni al microscopio di là di fare film di dinamiche cellulari. Sempre questo confine è sfocata, come tecniche di citometria vengono integrati con tecniche di imaging per il monitoraggio e la misurazione delle attività dinamiche di cellule e strutture subcellulari 31.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
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