Protocol
1. elektroporering av Fibroblast med både expressionsvektorer EYFP-Parkin och pDsRed2-Mito
- Odla immortaliserad mus embryonala fibroblastceller på 10 centimeter vävnadsodlingsplatta med användning av DMEM (Dulbeccos modifierade Eagles medium) medium supplementerat med 10% fetalt bovint serum, 2 mmol / l L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin i fuktad atmosfär innehållande 5% CO2 vid 37 ° C.
- Vid 80% cell confluency, kassera hela DMEM-medium genom steril sug- och tillsätt 10 ml av steril 1x fosfatbuffertlösning (PBS) (80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 och ett L destillerat H2O, pH: 7,4).
- Kassera PBS genom steril sugning och tillsätt 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Inkubera plattan vid 37 ° C tills cellerna lösgörs (2-3 min). Tillsätt 4 ml av komplett DMEM-medium, resuspendera cellerna och ta ut 10 _6; l av cellsuspensionen för hemocytometer-räkning.
OBS: hemocytometer är utformad så att antalet celler i en uppsättning av 16 hörn fyrkanter motsvarar antalet celler x 10 4 / ml.
- Utsäde 1 x 10 6 celler på 10 cm vävnadsodlingsskålar 24 h före elektroporerprocessen.
- Kasta komplett DMEM-medium genom steril sug- och tillsätt 10 ml av steril PBS. Kassera PBS genom steril sugning och tillsätt 1 ml Trypsin-EDTA 0,25%. Inkubera plattan vid 37 ° C tills cellerna lösgörs (2-3 min). Tillsätt 4 ml av komplett DMEM-medium och återsuspendera cellerna i en 15 ml tub.
- Snurra cellerna ner vid 250 xg under 5 min med användning av en kyld-centrifug (4 ° C). Kassera supernatanten genom steril sugning och återsuspendera pelleten i 1 ml steril PBS. Snurra cellerna ner vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten genom steril sug, och tillsätt 100 l of lösning mix för elektroporering (82 pl elektroporering Solution V + 18 pl Kompletterande lösning 1) till cellpelleten och försiktigt suspendera pelleten genom att pipettera (För mer information se bruksanvisningen). Tillsätt 2 mikrogram av EYFP-Parkin (excitation / emission 514/527) och ett mikrogram pDsRed2-Mito (excitation / emission 565/620) vid cellsuspensionen.
- Överför lösningen till den sterila kyvett med hjälp av en engångs Pasteur (båda verktygen är försedda med kitet) och elektroporera använda förinställda program NIH / 3T3 U-030 (Single puls, spänning 200 V, kapacitans 960 iF, puls tid 20 millisekunder , puls nummer: 1).
- Omedelbart efter elektroporering, tillsätt 500 | il färskt förvärmda komplett DMEM-medium och utsäde cellen på en 6 cm vävnadsodlingsplatta levande-imaging-grade och inkubera dem i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO2 vid 37 ° C under 24 timmar.
2. Tidsförlopp Video Mikroskopi
- Vid denna punkt, förbereda en specifik levande bildalstringsmedium att fortsätta med försöksprotokoll. Förbered levande bildalstringsmediumet enligt följande; blanda DMEM fenol fritt kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 2 mmol / l L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin. Pre-värma den levande bildalstringsmediumet vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Kassera mediet av de elektroporerade cellerna genom sterila sug- och tillsätt 1 ml av förvärmda levande bildalstringsmedium, med användning av en P1000 pipett och inkubera plattan under 30 min vid 37 ° C.
- Under plattan inkubationsperioden tillströmning 5% CO2 i mikroskopets kammaren redan vid en stabil temperatur av 37 ° C.
- Placera plattan med elektroporerade celler i mikroskop kammare undvika stora rörelser eller svängningar.
- Med hjälp av programvaran gränssnitt, ställa in mikroskop för att upptäcka både fluoreScence signalerna från de fusionsproteiner som kodas av de samtransfekterade vektorerna, EYFP-Parkin (Excitation intervallet 495-510 nm och emissionsområdet 520-550 nm, grön) och pDsRed2-Mito (excitationsmaximum 558 nm och emission maximum 583 nm, röd).
- Öppna time-lapse video mikroskopi programvara. I den övre menyn väljer FITC för EYFP-Parkin och rodamin för pDsRed2-Mito. I den övre menyn väljer förstoring (20X).
- Med hjälp av programvaran gränssnitt, leta efter en enda cell som uttrycker både samtransfekterade vektor och registrera positionen. Upprepa detta steg tills minst 10 celler samlas in för varje experimentell tillstånd (experimentell grupp).
- Välj menyn "appar" och klicka på Multi Dimensional Acquisition. I Multi Dimensional Förvärvs fönster väljer de parametrar som behövs, till exempel antal förvärv, tidsintervallet mellan varje förvärv och läget för den inspelade cellen. Klicka på "Skaffa"För att starta förvärvsprocessen.
- Starta den basala förvärv av både EYFP-Parkin och DsRed2-Mito fluorescerande signal insamling av bilder var 5 min under totalt intervall på 15 min.
- Förbered förvärmda levande bildalstringsmediumet med en koncentration av FCCP dubbelt högre än den slutliga bearbetningen koncentration (0,1-10 pM, celltyp beroende).
- Avbryta förvärvsprocessen och tillsätt försiktigt 1 ml förvärmda levande bildalstringsmediumet med FCCP i plattan i mikroskop kammare med hjälp av en P1000 pipett.
- Starta om förvärvsprocessen som tidigare beskrivits, för en total tid av 3 h, med användning av registrerade position. Spara alla förvärvade bilder för att analysera dem och skapa en video av mitophagic processen när förvärvet är över.
3. Analys
- Samla alla förvärvade bilder i "tiff" format på en persondator
- Öppna bilderna med en grafisk mjukware och definiera tidsintervallet inträffade från det mitokondriella inducerad depolarisering med FCCP till den första bilden visar rekryteringen av Parkin i mitokondriemembranet (Bilder förvärvas var 5 min). Upprepa denna analys för varje cell i den experimentella gruppen.
- Märka den första cellen i kolumnen på ett kalkylblad med den experimentella gruppnamnet. För varje experimentgrupp, mäta de temporala intervallen för Parkin rekrytering av minst 10 celler. Göra ett genomsnitt av de beräknade tidsintervallen för Parkin rekrytering och definiera standardavvikelsen för varje experimentgrupp (medelvärde ± SD, N = 10).
- Ordna i kolumner de enskilda beräknade tidsintervaller. Varje kolumn innehåller n = 10 mätningar av den experimentella gruppen.
- Välj funktionen "genomsnittliga" från Formula Builder menyn. Välj data i kolumnen. Välj funktionen "Standardavvikelse" från Formula Builder menyn. Select data i kolumnen.
- Med hjälp av en statistisk metod, jämföra experimentella grupper som tillämpar lämplig statistik i syfte att fastställa en signifikant skillnad i den dynamiska av mitophagy mellan försöksgrupperna. (Till exempel, två grupper = t-test, tre eller flera grupper = ANOVA plus en post-hoc-test)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Häri, visar vi hur tidsförlopp videomikroskopi är en kraftfull teknik som kan användas för att följa molekylära händelser av fluorescerande-märkta proteiner i en enda cell. De representativa Resultaten visar också hur denna teknik gör det möjligt att förvärva högkvalitativa bilder. När bilder av den molekylära processen, erhålles, har vi möjlighet att analysera dem på olika sätt. Här analyserar vi tidsintervallet mellan initieringen av den inducerade mitophagy processen, som är den avgörande molekylär process som upprätthåller den cellulära homeostas selektivt avlägsna de skadade mitokondrier.
Denna teknik grundar ett brett spektrum av tillämpningar. Den kan användas antingen för att övervaka makro cellulär process såsom cellmigration eller mikro molekylära händelser genom märkning av de viktigaste molekyler som är involverade i den process som måste studeras.
o: keep-together.within-page = "1"> Parkin-medierad Mitophagy
Den selektiva Parkin-medierad avlägsnande av skadad och dysfunktionella mitokondrier process sammanfattas i fig 1, där en membran depolarisation inducerat av den frikopplande medlet FCCP utlöser selektiv Parkin-medierad mitophagy, rekrytera Nature1 till det yttre mitokondriemembranet. Efter är Parkin rekryteras till de skadade mitokondrier och interagerar med Nature1. Detta komplex Parkin-Nature1 leder till ubikvitinering av den skadade organell och dess införlivande i en autophagosome, som smälter med en lysosom. Denna process kallas mitophagy anses vara en avgörande metaboliska process för att hålla den cellulära miljön sunt och tillåta regenerering av funktionella mitokondrier 8,15.
experimentellt protokoll
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2 visar en schematisk bild av det experimentella protokollet och mikroskopet set-up som används för att följa rekryteringen av EYFP-Parkin före och efter FCCP-inducerad mitophagy process.Parkin Rekrytering till depolariserade mitokondriemembranet
I figur 3A visar vi Parkin fördelning före och efter FCCP administration. Under de basala tidpunkter (BT5, BT10 och BT15 min) EYFP-Parkin (Grön) är homogent spritt i hela cellen och mitokondrierna nätet (Red) tycks vara väl sammankopplade. Efter FCCP administration (FT = 0 min) (figur 3B), observerar vi mitokondrier fraktione (FT = 5 min). Dock är EYFP-Parkin fortfarande homogent spritt även ut cytoplasman. Mitophagy stimuleras vid 55 min efter FCCP administration,EYFP-Parkin rekryteras till skadade mitokondriella membran för att utlösa mitophagy processen (FT = 55).
Figur 1. Schematisk representation av Parkin-medierad Mitophagy. En sänkning av membranpotential (Ψm) förekommer i skadade eller dysfunktionella mitokondrier och kan induceras av koppling agent FCCP. Förlust av membranpotential utlöser selektiv Parkin-medierad mitophagy, rekrytera Nature1 (röd) till det yttre mitokondriemembranet. Parkin (Blue) rekryteras till skadade mitokondrier genom att direkt interagera med Nature1. Närvaron av Parkin leder till ubikvitinering (gul) i den skadade organell och dess införlivande i en autophagosome, som smälter med en lysosom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikroskop Set-up och representation experimentprotokollet. (A) Översikt över experimentella händelser som beskrivs i protokollet avsnitt. De rapporterade experimentella händelser gör det möjligt för operatören att kortvarigt samarbete transfektera cellerna med EYFP-Parkin och pDsRed2-Mito genom elektroporering för att följa FCCP-inducerad mitophagy process med hjälp av en (B) set-up för time-lapse video mikroskopi tillvägagångssätt. BT = basal tidpunkt; FT = FCCP tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Fibroblast Cell Visar Parkin Recruitme nt efter Mitochondrial membrandepolarisering inducerad av EYFP-Parkin (grön) translokation i mitokondrier (röd) FCCP. övervakades med tidsförlopp video mikroskopi under basala tidpunkt (BT) och efter FCCP administration (FT). Från BT = 0, var EYFP-Parkin och mitokondriell fluorescens upptäcks varje 5 min. (A) EYFP-Parkin är homogent sprids över hela basalperioden och den mitokondriella nätverk är intakt (vita pilar). (B) Mitochondrial fraktione grund av membrandepolarisering av FCCP registreras på FT = 5 min (vita pilar) och EYFP-Parkin rekrytering till skadade mitokondriemembranen började på FT = 55 min (vita pilar). De vita rutorna representerar det förstorade området av panelerna (5x). För mer information om tillämpningen av denna experimentella protokoll avser att referera 8. (Skala bar: 10 pm).> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse mikroskopi kan definieras som den teknik som sträcker sig levande cell imaging från en enstaka observation i tid för att observation av cellulära dynamik över långa tidsperioder. Denna metod skiljer sig från en enkel konfokala eller levande cell mikroskopi, eftersom det gör det möjligt för betraktaren att identifiera i realtid en enda fluorescerande-märkta proteinet och följa dess dynamiska i en enda levande cell. I själva verket kan konfokalmikroskopi lätt identifierar immunmärkta proteiner med fluorescerande antikropp, men det tillåter inte observera cell och molekyl händelsen i sin levande miljö.
Time-lapse video mikroskopi används främst inom forskning övervaka molekylära processer i olika celltyper såsom HEK293 16 primära neuroner 17 och Hela-celler 18 men har också klinisk tillämpning som graviditet och förutsäga aneuploidi 19,20. Time-lapse mikroskopi ger embryologister med ytterligare information om embryoutveckling för en klinisk graviditet, och det är möjligt att denna information kan användas för att förbättra vår förmåga att välja livskraftiga embryon för överföring. Ytterligare fördelar med användningen av Time-lapse mikroskopi inkluderar mindre hantering av embryon och deras rätter för mellan observationer, vilket skulle minska risken för förlust eller kontaminering i laboratoriet 19.
Celler kan bibehålla en sund mitokondrie homeostas genom nedbrytning skadade och dysfunktionella mitokondrier genom mitophagy. Defekt mitophagy är kopplad till Parkinsons sjukdom 21, apoptos 22, åldrande 23 och cancer 24. Mitophagy drivs av ubiquitin ligas Parkin och Nature1 21. På grund av betydelsen av denna process för att upprätthålla en hälsosam mitokondriell status, fann vi att det är viktigt att studera dynamiken i denna händelse med en time-lapse video mikroskopi. Den föreslagna proprotokoll kommer att tillhandahålla bevis på hur mitokondrierna homeostas påverkas under olika cellulära förhållanden, inklusive förändringar i genuttryck och proteinfunktioner.
I denna studie, vi transfekterades fibroblaster genom elektroporering. Elektroporeringsmetoden applicerar en elektrisk puls vid en optimerad spänning varar några mikrosekunder till cellsuspensionen för att öka permeabiliteten hos cellmembranet genom att störa den fosfolipid tvåskiktsmembran av membranet. Denna åtgärd resulterar i bildandet av tillfälliga porer. Membran permeabilization kan det DNA som skall införas i cellen 25. Vi valde denna process för att transient transfektera fibroblaster i syfte att ha högre transfektionseffektivitet av båda plasmiderna EYFP-Parkin och pDsRed2-Mito. I själva verket är elektroporering processen ungefär tio gånger mer effektivt än kemisk transfektion 26. Bilderna förvärvsprocessen kan äventyras av både Electroluxrnal faktorer; temperaturvariationer, vibrationer, fuktighet och interna faktorer; pH, cellrörlighet. Elektroporering och fluorescerande spårning är två åtgärder som anses vara den mest kritiska för att lyckas med detta försöksprotokoll. Även om transfektionseffektiviteten är högre än andra metoder, dödar elektroporation ~ 20% av de elektroporerade cellerna. En annan viktig fråga är förvärvet kvaliteten på bilderna under övervakningssteget. Eftersom den cellulära miljön är dynamisk, måste fokusplanet kontinuerliga justeringar för att bibehålla fokus genom hela förvärvsprocessen.
Mitokondriell skada kan orsakas av membran mitokondrie depolarisation och oxidativ stress. Dessa faktorer inducerar en mitophagic respons. Bevis för att mitokondrierna depolarisation kan inducera selektiv mitophagy kommer från fotoskador experiment som leder till ROS produktion och mitokondriell skada 27-30. För att förmå mitokondriella membrane depolarisation och mitophagic svar har FCCP använts som protonophore 10. FCCP är en jonofor som tillåter protoner att korsa lipiddubbelskikt inducerande membrandepolarisering. Med denna metod vi inducerade mitophagy och följde dynamiken i molekylär markör.
Koncentrationen av FCCP är avgörande, eftersom det kan vara cytotoxiska och främja celldöd. Eftersom detta tillvägagångssätt bygger på observation av levande celler, har den slutliga koncentrationen av FCCP justeras i en celltyp beroende sätt för att inducera mitophagy utan utlösa mekanismer som leder till celldöd.
Sammantaget tror vi att följa dynamiken i mitophagy, med hjälp av EYFP-Parkin som en fluorescerande markör, kommer att ge nya insikter i mitokondriefunktion. Det selektiva avlägsnandet av mitokondrier via mitophagy är en avgörande process för att upprätthålla mitokondriell kvalitet, cellviabilitet och homeostas. Denna levande avbildningsteknik kommer hanlp att förstå mitophagic processen under hälsosamma och stressade förhållanden.
Moderna metoder ytterligare utvidga tidsförlopp mikroskopi observationer utöver att göra filmer av cellulära dynamik. Alltmer denna gräns är suddig som cytometrisk teknik integreras med avbildningstekniker för att övervaka och mäta dynamiska aktiviteter av celler och subcellulära strukturer 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Phenol-free DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | Pre-warm at 37 °C before use |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Pre-warm at 37 °C before use |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Penicillin/streptomycin | Corning Life Science | 30-002-CI | Pre-warm at 37 °C before use |
| EYFP-PARKIN expression vector | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito expression vector | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B device | LONZA | AAD-1001S | |
| Nucleofector for kit R NIH/3T3 | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscope | CARL ZEISS | ||
| Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | National Institute of Health | Experimental Builder |
References
- Youle, R. J., Narendra, D. P.
- Zhi, X., Zhong, Q.
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
- Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
- Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
- Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
- Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
- Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
- Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
- Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002 (2012).
- Trinh, J., Farrer, M.
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
- Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
- Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
- Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
- Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
- Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
- Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
- Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
- Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
- Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
- Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
- Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
- Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
- Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
- Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
- Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
- Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).
