Protocol
1. प्रारंभिक सेटअप
- गैस और तापमान सांद्रता की स्थापना
- सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, चित्रमय इंटरफेस के ऊपरी बाएँ कोने पर स्थित "अतिथि" टैब पर क्लिक करें। एक नामित यूज़रनेम और पासवर्ड का उपयोग कर प्रणाली में लॉगिन करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक उपयोगकर्ता अपनी उपयोगकर्ता नाम और पासवर्ड है सुनिश्चित करें।
- एक मॉड्यूल पर क्लिक करें (चित्रा 1) को समायोजित करने के लिए। वर्तमान सेटिंग्स प्रदर्शित नई विंडो के भीतर, नीचे "सेट बिंदु" मौजूदा हे 2 सेट बिंदु मूल्य पर क्लिक करें और इस मॉड्यूल के लिए आवश्यक हे 2 एकाग्रता स्तर में प्रवेश। 5% 2 हे दर्ज स्टेम कोशिकाओं हो जाएगा अगर या इस मॉड्यूल में हेरफेर, और 9% 2 हे तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं हो जाएगा अगर या चालाकी। सेट बिंदु पुष्टि करने के लिए हरे रंग की जाँच चिह्न पर क्लिक करें।
नोट: लामिना हुड, और माइक्रोस्कोप चैंबर: दो मॉड्यूल गैस समायोज्य नहीं कर रहे हैं। लामिना का प्रवाह हुड में गैस की सांद्रता वायुमंडलीय whil हैंई माइक्रोस्कोप कक्ष में उन निष्क्रिय प्रक्रिया चैम्बर में गैस की सांद्रता द्वारा रखा जाता है। - इस चरण को दोहराएँ के लिए सीओ 2. बफर कक्षों, जो ओ 2 के लिए केवल समायोज्य रहे हैं के लिए छोड़कर सभी मॉड्यूल के लिए 5% सीओ 2 का एक सेट बिंदु दर्ज करें।
- मौजूदा गैस की सांद्रता, जो "प्रक्रिया मूल्यों" चिह्नित कर रहे हैं मॉनिटर, यकीन है कि वे नए सेट अंक तक पहुंच बनाने के लिए।
- उचित मूल्यों के लिए सभी मॉड्यूल के गैस सेट अंक समायोजित करें। कि एक दूसरे को उजागर किया जाएगा कक्षों के सीओ 2 और हे 2 स्तरों मैच। उदाहरण के लिए, इसके अलावा 5% 2 हे किसी भी बफर कक्ष है कि इस समय के दौरान प्रक्रिया चैम्बर के लिए आइटम जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है को समायोजित 5% ओ 2 पर एक मशीन है कि कोशिकाओं बढ़ता खोलने से पहले 5% 2 हे करने के लिए प्रक्रिया चैम्बर समायोजित करें।
- गैस समायोजन के लिए एक ही स्क्रीन का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस तक की प्रक्रिया के चैम्बर के तापमान सेट करें। इसके अलावा प्रक्रिया चैम्बर च सेट37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान loor।
- ऊष्मायन मॉड्यूल बैंकों को एक इनक्यूबेटर के नीचे पर क्लिक करें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए बैंकों के तापमान को समायोजित।
- बफर चैंबर्स ऑफ ऑपरेशन
- सब भी कार्य (खिला, विभाजन, धुंधला, आदि) के शुरुआत में काम के प्रवाह में देरी को रोकने के लिए आवश्यक आपूर्ति को इकट्ठा। उदारतापूर्वक 70% इथेनॉल के साथ सभी सामग्री स्प्रे और उन्हें लामिना हुड में सूखे के लिए अनुमति देते हैं। स्प्रे बोतल या कोशिकाओं की प्लेटों मत - उन्हें एक बाँझ धुंध स्पंज 70% इथेनॉल के साथ संतृप्त के साथ धीरे साफ कर लें।
- यकीन है कि दोनों बफर चैम्बर के बाहरी और भीतरी दरवाजे सुरक्षित रूप से बंद कर रहे हैं। फिर बाहर दरवाजा खुला, और अंदर आइटम जगह है।
- बाहरी दरवाजा बंद कर दें। सॉफ्टवेयर के भीतर, बफर मॉड्यूल का चयन करें, और कमजोर पड़ने कारक टैब पर क्लिक करें। लॉग कारक बॉक्स में 1 दर्ज करें। प्रारंभ क्लिक करें।
नोट: एक "कमजोर पड़ने कारक" मतलब करने के लिए परिभाषित किया गया है कि बफर मॉड्यूल के वायुमंडल होगाखाली और साफ, HEPA फ़िल्टर गैस के साथ 1 समय को बदला जाएगा। - एक बार जब चित्रमय इंटरफेस चमकती "कमजोर पड़ने कारक" बंद कर दिया गया है, बफर चैम्बर के भीतरी दरवाजा खुला है और इस प्रक्रिया को कक्ष के अंदर माल लाने के लिए।
सावधानी: कभी भीतरी और बाहरी दरवाजे एक ही समय में खुला होना अनुमति नहीं है और भीतरी दरवाजा खुला नहीं है, तो बफर चैम्बर एक कमजोर पड़ने कारक नहीं आया है। - प्रक्रिया चैम्बर से आइटम हटाने के लिए आदेश में, पहले यह सुनिश्चित करें कि बफर चैम्बर एक कमजोर पड़ने कारक आया है। फिर, भीतरी दरवाजा खोलने के लिए जगह आइटम के अंदर हटा दिया है, और भीतर से दरवाजा बंद। तब बाहरी दरवाजा खुला और आइटम को हटा दें।
नोट: एक कमजोर पड़ने कारक बाहरी दरवाजा खोलने से पहले चलाने के लिए जरूरत नहीं है।
2. परिचय और दूध पिलाने प्रकोष्ठों
- इनक्यूबेटर सेटअप
- प्रत्येक इनक्यूबेटर के आधार पर पानी पैन में 3 पेट्री डिश रखें। STERIL के साथ इन व्यंजनों भरेंई पानी। सीधे पानी पैन भरने मत करो। , इन व्यंजनों में पानी के स्तर को बनाए रखने के रूप में वे इन्क्यूबेटरों में सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) सेट बिंदु को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
- चित्रमय इंटरफेस के भीतर, इनक्यूबेटर पर क्लिक करें। सेट बिंदु के तहत सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) के लिए मौजूदा मूल्य पर क्लिक करें और 85% दर्ज करें। हरे रंग की जाँच चिह्न पर क्लिक करें इस मूल्य को स्वीकार करने के लिए।
- कोशिकाओं के लिए सेल उत्पादन सुविधा की तैयारी
- यदि पहले से ही ऐसा नहीं किया, बफर कक्षों, प्रक्रिया चैम्बर, और गैस सेट सेल के प्रकार पेश किया जा रहा करने के लिए आवश्यक अंक के लिए एक मशीन को समायोजित।
- बाँझ धुंध और एक गैर ज्वलनशील कीटाणुनाशक के साथ इस प्रक्रिया चैम्बर की सतह को साफ करें। मजबूत एक बंद व्यवस्था में के रूप में, किसी भी peracetic एसिड आधारित कीटाणुनाशक का प्रयोग न करें, सुस्त वाष्प स्तनधारी कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं। इसके बजाय, benzalkonium क्लोराइड आधारित उत्पादों का उपयोग करें।
- disinfecting जारी रखें। दस्ताने और सतहों कि commo हैं साफnly इस तरह के दरवाज़े के हैंडल के रूप में, छुआ। अच्छी तरह से, लेकिन संयम से कीटाणुनाशक का प्रयोग करें, के रूप में प्रक्रिया कक्ष में अतिरिक्त तरल आर्द्रता, संक्षेपण और संभव माइक्रोबियल विकास के लिए योगदान देगा।
- लामिना का प्रवाह हुड की सतह को साफ और 70% इथेनॉल के साथ चैम्बर बफर, और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं। कुप्पी या कोशिकाओं की प्लेट हुड में (हमारे मामले में, पीएससी या एनएससी में) प्लेस, और संक्षेप में एक बाँझ धुंध स्पंज इथेनॉल के साथ संतृप्त साथ इसकी बाहरी सतह पोंछे।
- बफर चैम्बर में कुप्पी या थाली रखो, और एक कमजोर पड़ने कारक (कदम 1.2.3) चलाते हैं।
- कमजोर पड़ने कारक के पूरा होने पर, तुरंत कुप्पी ले जाएँ या उचित इनक्यूबेटर के लिए थाली। इन्क्यूबेटरों प्रक्रिया चैम्बर के पीछे हैं, एक शेल्फ सेल प्लेसमेंट के लिए प्रक्रिया कक्ष में बाहर खींच। , या समय की विस्तारित अवधि के लिए अनावश्यक रूप से इनक्यूबेटर दरवाजे खोलने के रूप में इस प्रक्रिया चैम्बर की हवा इन्क्यूबेटरों की तुलना में बहुत शुष्क है से बचें, और एक महत्वपूर्ण में परिणाम होगाइनक्यूबेटर में नमी की हानि।
- दूध पिलाने सेल संस्कृतियों
- मध्यम घटकों, सीरम वैज्ञानिक pipettes, एक इलेक्ट्रॉनिक pipettor, धुंध और कीटाणुनाशक इकट्ठा। इसके अलावा बिताया सेल संस्कृति माध्यम के लिए बर्बादी कंटेनर इकट्ठा होते हैं, लेकिन ब्लीच के साथ इसे भरने के लिए नहीं है। धारा 1.2 में वर्णित के रूप में एक बफर कक्ष के माध्यम से प्रक्रिया के चेंबर में माल ले आओ। प्रक्रिया कक्ष में सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार है, के रूप में पहले से वर्णित 9,10 (देखें भी सामग्री तालिका)
- के रूप में एक इष्टतम काम अंतरिक्ष सक्षम करने के लिए इस तरह के एक तरीके से सामग्री की व्यवस्था। प्रक्रिया चैम्बर के केंद्र में इस्तेमाल नहीं किया जा रहा आइटम रखने से बचें।
- मध्यम मीडिया कंटेनर थोड़ा नवोदित छोड़ कर प्रणाली के भीतर मौजूद सीओ 2 और हे 2 स्तर के साथ संतुलित करने के लिए अनुमति दें। कुछ पीएससी मध्यम निर्माताओं 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया गर्म करने के लिए नहीं संकेत मिलता है; यदि यह मामला है, मध्यम संतुलित करने के लिए एक बफर चैम्बर का उपयोग करें। मुझे अनुमति देंdium 20 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए।
- एक उचित stereological पिपेट और एक इलेक्ट्रॉनिक pipettor का उपयोग कुओं से पुराने मध्यम निकालें। पीएससी के लिए, लेकिन पुराने मध्यम के एक छोटे से शेष राशि, खिलाने की प्रक्रिया के दौरान सुखाना को रोकने के लिए पर्याप्त सभी को हटा दें। एनएससी के लिए, पुराने मध्यम के आधे हटा दें। Pipet अपशिष्ट कंटेनर में बेकार।
- इस्तेमाल किया पिपेट वापस अपने मूल आवरण में रखें और इस प्रक्रिया चैम्बर की ओर से यह कदम, या कचरे को हटाने के लिए नामित एक बफर के चेंबर में। एक ताजा बाँझ सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ, संस्कृति प्लेटों सेल और प्लेटों उनके नामित इनक्यूबेटर में वापस जगह के लिए ताजा माध्यम जोड़ें।
- भोजन के अंत में, स्प्रे कीटाणुनाशक के साथ धुंध और अच्छी तरह से प्रक्रिया कक्ष के फर्श और दरवाज़े के हैंडल को साफ। तो देखते हैं कई सेल लाइनों प्रणाली में विकसित किया जा रहा है, प्रत्येक कोशिका लाइन खिलाने के बीच में बाँझ। इस पार संक्रमण के जोखिम को कम मदद मिलती है।
- पूरा होने पर, हटाने अपशिष्टबफर कक्षों में से एक के माध्यम से या अन्य अनावश्यक मदों।
3. बंटवारे सेल संस्कृतियों
- पीएससी या एनएससी के enzymatic Passaging
- passaging के लिए आवश्यक सभी आइटम इकट्ठा। यह मीडिया, एंजाइम या गैर enzymatic सेल हदबंदी बफर शामिल (उत्तरार्द्ध एनएससी के लिए ही है), DPBS, प्लेट या बोतल, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), शंक्वाकार ट्यूब, और सीरम वैज्ञानिक pipettes। उन्हें एक बफर कक्ष का उपयोग कर प्रणाली में लाओ।
- कोट ताजा प्लेटों या ईसीएम के साथ बोतल, जैसा कि पहले 9,10 का वर्णन किया। कुछ ईसीएम -such के रूप में माउस सार्कोमा सेल लाइनों से प्राप्त उन - 4 और 15 डिग्री सेल्सियस के बीच केवल तरल कर रहे हैं, इसलिए जब तक गर्म प्रक्रिया चैम्बर में काम कर ईसीएम ठंडा रखने के लिए एक निष्फल ठंड ब्लॉक या जेल आइस पैक का उपयोग करें।
- Pipet संस्कृति से खर्च मध्यम बंद और कचरे के कंटेनर में इसे के निपटान।
- अच्छी तरह से अच्छी तरह से या कुप्पी सतह DPBS / के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर कुल्ला और DPBS के निपटान के।
- जोड़े 1 - 2प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म एंजाइम की मिलीलीटर। केवल बहुत ही घने संस्कृतियों 2 मिलीलीटर की आवश्यकता होती है।
- इसके तत्काल बाद माइक्रोस्कोप चैम्बर के लिए संस्कृति डिश या कुप्पी ले जाते हैं, और संस्कृति को ध्यान से निरीक्षण करते हैं। पकवान बंद ढीला करने के लिए शुरुआत व्यक्ति की कोशिकाओं के संकेत के लिए देखो। जब तक कोशिकाओं अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले निलंबन में नाव से जाने न दें।
- मुख्य प्रक्रिया चैम्बर में कोशिकाओं लौटें। एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, एंजाइम के प्रत्येक 1 मिलीलीटर के लिए DPBS के 4 मिलीलीटर जोड़ने, और फिर जबरदस्ती नीचे अच्छी तरह से सतह से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए ऊपर pipet और। यदि एक multiwall प्लेट के भीतर कई कुओं passaging, अच्छी तरह से व्यक्तिगत कुओं से कोशिकाओं dislodging से पहले प्रत्येक को DPBS जोड़ें।
- एक उचित आकार शंक्वाकार ट्यूब एंजाइम और पीबीएस सेल निलंबन स्थानांतरण।
- एक अपकेंद्रित्र सेल उत्पादन सुविधा में उपलब्ध नहीं है, तो कसकर शंक्वाकार ट्यूब सील, एक बफर चैम्बर में डाल दिया है और सील दरवाजा बंद कर दिया।
- buf से शंक्वाकार ट्यूब निकालेंलामिना का प्रवाह की ओर से फेर कक्ष और आरटी पर 5 मिनट के लिए 100 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
- 70% इथेनॉल के साथ शंक्वाकार ट्यूब स्प्रे, और यह प्रक्रिया चैम्बर एक बफर चैम्बर और कमजोर पड़ने कारक का उपयोग में लाना।
- Pipet सतह पर तैरनेवाला बंद है, और पीएससी या एनएससी मध्यम 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। अगर पीएससी passaging, के रूप में पहले 9,10 वर्णित 10 माइक्रोन की एकाग्रता पर मध्यम में रॉक अवरोध शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें।
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना, और कुओं या प्लेटों की आवश्यकता की संख्या का निर्धारण। 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी - 5 एक्स 10 4 में प्लेट पीएससी। 2 अनुपात: एक 1 पर एनएससी विभाजित।
नोट: एनएससी अक्सर पेड़ों का झुरमुट और एक hemocytometer में सटीक गिनती का विरोध। - कोशिकाओं के cryopreservation की आवश्यकता है, उचित प्रोटोकॉल 9,10 पालन करें, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि सभी आपूर्ति और ठंड मीडिया पहले से तैयार है और इस प्रक्रिया कक्ष के अंदर रखा जाता है। DMSO 37 पर कोशिकाओं के लिए बहुत विषैला होता है6, सी, तो बहुत जल्दी से काम करते हैं। लामिना का प्रवाह हुड में आरटी पर isopropanol जैकेट ठंड कंटेनर में रखें। एक बार जब cryopreservation शीशियों भरा और सील कर रहे हैं, तुरंत एक बफर कक्ष के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा प्रक्रिया कक्ष से शीशियों को हटा दें।
- पीएससी के मैनुअल Passaging
- पुष्टि करें कि संस्कृति, passaged हो के रूप में पहले 8 वर्णित की जरूरत है। यदि हां, तो ताजा प्लेटों या बाह्य मैट्रिक्स के साथ लेपित बोतल तैयार करते हैं। तो मध्यम पूरी तरह से बदल जाते हैं।
- साफ एक बख्शते राशि गैर ज्वलनशील कीटाणुनाशक के साथ सिक्त बाँझ धुंध के साथ खुर्दबीन कक्ष - बहुत ज्यादा कक्ष में अतिरिक्त फॉगिंग में परिणाम होगा। केवल दस्ताने, फर्श क्षेत्र, और मंच साफ। चैम्बर में कई 200 μl या 1,000 μl व्यक्तिगत लिपटे pipet सुझावों लाओ।
- माइक्रोस्कोप के चेंबर में पीएससी की प्लेट ले आओ, ढक्कन हटा दें, और यह हौसले से साफ फर्श पर नीचे का सामना जगह है। ढक्कन के ऊपर छोड़कर नीचे दीर उजागरectly हवा के बहाव के लिए, और संभावित संदूषण के लिए।
- एक pipet टिप खोलना, और संस्कृति कल्पना करने के लिए, के अलावा कालोनियों अच्छा pipet की नोक का उपयोग कर आकारिकी है कि लेने माइक्रोस्कोप का उपयोग।
नोट: व्यक्तिगत उपयोगकर्ता इस और अधिक आरामदायक पाता है pipet टिप एक pipet से जुड़ा जा सकता है। - थाली पर ढक्कन बदलें, और थाली वापस प्रक्रिया चैम्बर के लिए ले जाते हैं।
- Pipet नई प्लेट से अतिरिक्त ईसीएम बंद, और पुराने प्लेट नई प्लेट (निलंबन में कॉलोनी टुकड़े युक्त) से मीडिया को हस्तांतरण। पुराने प्लेट अभी भी कालोनियों कि उठाया जा करने के लिए तैयार नहीं हैं शामिल हैं, तो यह रूप में अच्छी तरह खिलाओ।
4. विशेष कल्चर तकनीक
- पीएससी में fibroblasts की सेंडाइ पारगमन
- सेल उत्पादन सुविधा के भीतर, fibroblast मीडिया में मानव त्वचा fibroblasts 1 DMEM / F12, 10% FBS, और 20 एनजी / एमएल FGF2 युक्त विस्तार 5% 2 हे पर। 6 अच्छी तरह से संस्कृति dishe का प्रयोग करें0.1% जिलेटिन के साथ लेपित रहा है।
- कोशिकाओं को तैयार उन्हें अच्छी तरह से प्रति 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ अलग से transduced किया जाना है। 1 मिलीलीटर fibroblast मध्यम के साथ trypsin निष्क्रिय। 200 XG पर स्पिन, fibroblast माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend, और एक hemocytometer का उपयोग कर उन्हें गिनती।
- 2 मिलीलीटर fibroblast मध्यम में Resuspend 2.0 x 10 5 कोशिकाओं, और एक जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से थाली (2.1 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी) के 1 अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन जोड़ें। कोशिकाओं इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया।
- कोशिकाओं प्लेट के नीचे करने के लिए संलग्न करने के लिए 24 घंटा की अनुमति दें।
- प्रक्रिया कक्ष के अंदर ताजा fibroblast मध्यम (कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से मध्यम के 1 मिलीलीटर transduced जा सकता है) की जगह है, और यह गैसों को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं।
- 70% इथेनॉल के साथ एक पूर्व ठंडा ठंडा ब्लॉक जीवाणुरहित और एक बफर चैम्बर में जगह है। उस में कटौती करता है, तो एक व्यावसायिक ठंड ब्लॉक उपलब्ध नहीं है छेद के साथ एक जेल आइस पैक का प्रयोग करें।
नोट: वहाँ रहे हैं 3 - 4 अलग सेंडाइवायरस है, जो जल्दी thawed किया जाना चाहिए, लेकिन एक बार thawed ठंड ब्लॉक में रखा (पारगमन किट के संस्करण पर निर्भर करता है)। - 15 सेकंड (नलियों डूब नहीं है) के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों के नीचे आधा डुबकी, तो तुरंत 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब एक्सटीरियर साफ। बफर चैम्बर में निष्फल ठंड ब्लॉक पर ट्यूबों प्लेस और एक कमजोर पड़ने कारक चलाते हैं।
- जल्दी से काम करते हुए, equilibrated मध्यम 2 के लिए प्रत्येक सेंडाइ reprogramming वायरस की आवश्यक मात्रा में जोड़ें। कोशिकाओं की संख्या, प्रत्येक वायरस के अनुमापांक, और प्रत्येक वायरस के लिए संक्रमण के वांछित बहुलता - यह मात्रा तीन चर द्वारा निर्धारित किया जाता है। सिफारिश MOI के लिए किट का मार्गदर्शन से परामर्श करें। सूत्र है:
[(कोशिकाओं की संख्या ट्रांसफ़ेक्ट जा रहा है) (संक्रमण की बहुलता) (1000)] / (वायरल अनुमापांक) = वायरस के μl आवश्यक - reprogrammed किया जा कोशिकाओं की अच्छी तरह से (एस) से सतह पर तैरनेवाला निकालें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए, दवा के 1 मिलीलीटर जोड़ेंउम वायरस युक्त। धीरे थाली रॉक, मीडिया गिर करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, और प्लेट 5% ओ 2 इनक्यूबेटर में वापस जगह है।
- 2 घंटे के बाद धीरे फिर से प्लेट रॉक और एक और 2 घंटे के बाद फिर से दोहराने।
- 24 घंटा (1 दिन बाद पारगमन) के बाद, स्टेम सेल के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह खिलाओ। 2 दिन दोहराएँ, लेकिन अच्छी तरह से मध्यम दूर नहीं है।
- दिन 3 और 4 पर, मध्यम के आधे बदल जाते हैं।
- 5 और उससे आगे के दिन, पूरे मध्यम बदल जाते हैं।
- जब कालोनियों दिखाई देते हैं, संस्कृति बाँझ एंटीबॉडी का उपयोग कर पुष्टि करने के लिए कि वास्तव में कालोनियों pluripotent हैं, जैसा कि पहले 2 वर्णित दाग। खिला कोशिकाओं के साथ के रूप में, यह सुनिश्चित करें कि पीएससी मीडिया एंटीबॉडी युक्त सेल उत्पादन सुविधा में गैसों को equilibrated किया गया है।
नोट: एक सफल reprogramming में, IPSC कालोनियों पारगमन 1 के बाद उपस्थित लगभग दो सप्ताह होना चाहिए। - जब कालोनियों बड़े हो गए हैंबहुत हो गया, धारा 3.2 में वर्णित के रूप में चिह्नित करने और एक ईसीएम लेपित थाली पर यंत्रवत् पारित होने के लिए उन्हें करने के लिए, माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
- कालोनियों का विस्तार या तो स्वयं या enzymatically, जैसा कि पहले 9,10 का वर्णन किया।
5. को साफ करने के बाद दैनिक उपयोग
- सब बेकार सामग्री प्लेस, तरल अपशिष्ट कुप्पी सहित, एक बाँझ बफर कक्ष में। प्रसंस्करण के चैम्बर की सतह और सभी क्षेत्रों में है कि संपर्क में बाँझ धुंध और गैर ज्वलनशील कीटाणुनाशक के साथ आपूर्ति से आए हैं नीचे साफ कर लें।
- बफर कक्ष से सभी ठोस अपशिष्ट पदार्थों निकालें और उचित अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें।
- एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में तरल अपशिष्ट त्यागें, या बस ब्लीच के साथ मिश्रण और नाली नीचे डालना। साबुन और एक ब्रश के साथ कचरे के कंटेनर को साफ करें। 70% इथेनॉल के साथ कंटेनर जीवाणुरहित और एक बफर चैम्बर के माध्यम से इसे वापस प्रक्रिया चैम्बर के लिए ले जाते हैं।
नोट: यह ब्लीच का उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं हैअपशिष्ट कंटेनर यह सिस्टम के अंदर है, के रूप में ब्लीच धुएं recirculate और सेल संस्कृतियों को नुकसान हो सकता है। - स्वच्छता के विचार के लिए, 70% इथेनॉल के साथ प्रणाली के प्रसंस्करण कक्ष के सामने प्लास्टिक की सतह के नीचे पोंछे। इस उपयोगकर्ता के माथे से पसीना और त्वचा तेलों को साफ करने के लिए मदद करता है।
- संघनन की प्रक्रिया कक्ष के अंदर बनाया गया है, तो एक कमजोर पड़ने कारक संक्षेपण स्पष्ट करने को चलाते हैं। कम से कम 1 इस के लिए मानव संसाधन पूरा करने के लिए अनुमति दें।
6. नियमित गैर दैनिक कार्यों
- जरूरत के रूप में बाँझ, आसुत जल के साथ सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों में पानी के बर्तन की भरपाई होगी। एक सप्ताह व्यंजन बंद शीर्ष पर कम से कम एक बार। हालांकि, वाष्पीकरण की दर कितनी बार इनक्यूबेटर दरवाजे खोल रहे हैं के आधार पर उतार चढ़ाव होंगे, संस्कृतियों में तरल पदार्थ की मात्रा और इनक्यूबेटर सेटिंग्स।
- महीने में एक बार, सभी कक्षों में 2 हे और सीओ 2 सेटिंग्स recalibrate। इस अवधि (अंशांकन) गैस है, जो शेष भाग के उपयोग की आवश्यकताains संदर्भ का एक मानक के रूप में जाना जाता हे 2 और सीओ 2 की सांद्रता का स्तर। यकीन है कि वहाँ अंशांकन शुरू करने से पहले पर्याप्त स्पैन गैस की आपूर्ति है कि सुनिश्चित करें। प्रणाली विशिष्ट गैस सेंसर, प्रत्येक मॉड्यूल में स्थित है, गैस की सांद्रता का पता लगाने के लिए उपयोग करता है; इस प्रकार, उच्च गुणवत्ता स्पैन गैसों का उपयोग सुनिश्चित करता है कि सेंसर मज़बूती से सटीक गैस की सांद्रता उपज।
- एक नियमित आधार पर प्रक्रिया चैम्बर और माइक्रोस्कोप के चैम्बर में दस्ताने बदलें। दस्ताने हर 2 महीने, कितनी बार सिस्टम उपयोग किया जाता है की परवाह किए बिना बदलें। स्थापना से पहले, कीटाणुनाशक के साथ नए दस्ताने बाँझ। प्रक्रिया कक्ष पर एक कमजोर पड़ने कारक चलाने के बाद दस्ताने प्रतिस्थापित किया गया है।
नोट: जब प्रणाली के कफ पर फैला, nitrile दस्ताने शारीरिक तनाव और गर्मी से अवगत कराया क्षेत्रों में छेद को विकसित करने की प्रवृत्ति है। यह सामान्य है और अपरिहार्य पहनते हैं और आंसू है। - हर 6 महीने में सभी कक्षों में सिरिंज फिल्टर बाहर बदलें।
- बदलें या धोने टीवह जैसे ही लामिना का प्रवाह हुड पर prefilter के रूप में यह गंदा प्रकट करने के लिए शुरू होता है।
- प्रमुख भागों के प्रतिस्थापन के बारे में जानकारी के लिए नियमित रूप से निर्माता के दस्तावेजों को देखें।
7. प्रणाली की सफाई
- सेल संस्कृतियों के बहुमत को प्रभावित करने के लिए एक प्रमुख संदूषण घटना की स्थिति में, सिस्टम से बाहर किसी भी जीवित सेल संस्कृतियों ले जाते हैं, या (यदि संभव हो तो) एक अप्रभावित इनक्यूबेटर में।
- अप्रभावित इन्क्यूबेटरों के सिवाय इसके कि सभी कक्षों के लिए गैस नियंत्रण बंद कर दें।
- तंत्र के लचीला सामने पैनल निकालें, और प्रभावित सेल संस्कृति इनक्यूबेटर से स्टेनलेस स्टील अलमारियों को हटा दें। इसके अलावा पानी पैन को हटा दें।
- इनक्यूबेटर अलमारियों और पानी पैन आटोक्लेव, और इनक्यूबेटर में उन्हें वापस डाल दिया। साफ कर लें 70% इथेनॉल के साथ इनक्यूबेटर के आंतरिक सतहों। इथेनॉल लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें, और इनक्यूबेटर दरवाजा बंद करो।
- 70% एट के साथ इस प्रक्रिया और माइक्रोस्कोप चैम्बर की सतहों को साफ कर लेंhanol। तंत्र के सामने पैनल बदलें।
- साफ कर लें तंत्र के आंतरिक सतहों, प्रभावित इनक्यूबेटर, गैर ज्वलनशील कीटाणुनाशक के साथ की है कि सहित। प्रभावित इनक्यूबेटर ओपन के दरवाजे छोड़ दो, और इस प्रक्रिया कक्ष पर एक कमजोर पड़ने कारक चलाते हैं। यकीन खुर्दबीन कक्ष के दरवाजे भी खुले हैं।
- सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों की नियमित सफाई के लिए, यह सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर और इस प्रक्रिया चैम्बर ही वायुमंडलीय सेटिंग्स पर हैं। इनक्यूबेटर दरवाजा खोलो, और इस प्रक्रिया चैम्बर की सतह पर सभी सेल संस्कृति व्यंजन जगह है।
- इनक्यूबेटर अलमारियों और गैर ज्वलनशील कीटाणुनाशक के साथ आंतरिक सतहों के नीचे साफ कर लें। कीटाणुनाशक लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें, और सेल संस्कृतियों वापस इनक्यूबेटर के लिए कदम। के रूप में जल्दी संभव के रूप में काम सेल संस्कृतियों के dessication से बचने के लिए।
Representative Results
यह पांडुलिपि एक सेल उत्पादन सुविधा, और एक बंद व्यवस्था के अंदर संवर्धन कोशिकाओं के अद्वितीय पहलुओं कुछ विस्तार से वर्णन है। सेल उत्पादन सुविधा के थोक एक कस्टम बनाया, संलग्न, सेल संस्कृति है जो एक छोटे पदचिह्न है और आसानी से एक 6 x 7.5 मीटर 2 कमरे (चित्रा 2) के भीतर रखे जा सकती है, तंत्र शामिल हैं। कुछ ही समय में प्रयोगशाला कर्मियों या वातावरण के संपर्क तंत्र के भीतर कोशिकाओं रहे हैं। तंत्र कई मॉड्यूल के होते हैं: एक प्रक्रिया चैम्बर, एक लामिना का प्रवाह हुड, डाकू और प्रक्रिया चैम्बर, दो सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों, और एक माइक्रोस्कोप चैम्बर प्रक्रिया चैम्बर से सटे बीच में 2 बफरिंग airlock कक्षों (चित्रा 3)। सिस्टम सॉफ्टवेयर की इजाजत दी पर्यावरण चर नियंत्रण और निगरानी की जा करने के लिए (चित्रा 1) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कंप्यूटर इस सॉफ्टवेयर चल रहा है एक uninterruptible बिजली की आपूर्ति पर है। गैसों वीं में खिलाया जाता हैऑक्सीजन, नाइट्रोजन और कार्बन डाइऑक्साइड (चित्रा 4) के लिए कई गुना का एक सेट द्वारा ई प्रणाली। एक सक्रिय सेट और एक रिजर्व सेट - डिवाइस के लिए गैसों कई गुना सिस्टम टैंक के दो सेट प्रत्येक है द्वारा आपूर्ति की जाती है। जब सक्रिय सेट नीचे खींचा जाता है, कई गुना स्वचालित रूप से रिजर्व की स्थापना की और कर्मचारियों को आदेश प्रतिस्थापन टैंकों के लिए स्विच। बिजली की एक बैकअप जेनरेटर सिस्टम पर है।
Pluripotent और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पहले से विकसित प्रोटोकॉल 9 का उपयोग कर, उपन्यास उपकरण के लिए निहित जोड़ा जटिलताओं के साथ इस सुविधा में कमी वाली स्थिति में उगाया जा सकता है। स्टेम कोशिकाओं pluripotency-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग पूरी तरह से ट्रांसफ़ेक्ट कालोनियों है, जो फिर अलग-थलग और विस्तार कर रहे हैं की पहचान करने के लिए सेंडाइ वायरस का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। (चित्रा 5 ए और बी), इन IPSCs से, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स दोहरी SMAD निषेध का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, और उनके phenotype सत्यापित यूएसआई एनजी एनएससी विशिष्ट एंटीबॉडी (चित्रा 5C और डी)।
सेल उत्पादन सुविधा के लिए चित्रा 1. ग्राफिकल इंटरफ़ेस। (ए) सीपीएफ की चित्रमय प्रतिनिधित्व डिफ़ॉल्ट स्क्रीन है और (चित्रा 1 में 2 एफ) सीएडी ड्राइंग चित्रा 3। बफर मॉड्यूल 1 से अधिक माउस की एक क्लिक में दिखाया गया मैच इसके नियंत्रण के स्क्रीन (ख) हे 2 मूल्यों (चित्रा 3 में 3) प्रसंस्करण चैम्बर मैच के लिए सेट कर रहे हैं खोलता है। इसी तरह, प्रक्रिया पर क्लिक चैंबर या इनक्यूबेटर 1 उनके संबंधित नियंत्रण स्क्रीन (सी और डी, क्रमशः), जहां मूल्यों बदल गया है या पर नजर रखी जा सकती है के रूप में उपयुक्त लाता है। rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
2. सेल उत्पादन सुविधा चित्रा। (ए) प्रणाली एक सामने सही दृष्टि से देखा जाता है। नोट माइक्रोस्कोप सामान और सही करने के लिए कंप्यूटर के साथ छत में बिजली और गैस कनेक्शन और गाड़ी। (बी) के बफर सही पर देखा मॉड्यूल के लिए उपयोग दरवाजे के साथ लामिना का प्रवाह हुड। (ग) दो इन्क्यूबेटरों (काला दरवाजे) के साथ इस प्रक्रिया चैम्बर पीछे में देखा। (डी) प्रणाली के सही पक्ष के माध्यम से एक दृश्य माइक्रोस्कोप दिखा रहा है और बफर दूरी में देखा कक्षों के दरवाजे के साथ निगरानी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. एक सीएडी सेल उत्पादन सुविधा के ड्राइंग। डिवाइस में प्रवेश सभी आइटम पहले शराब और हवा लामिना का प्रवाह हुड में सूखे के साथ नीचे नष्ट कर रहे हैं (1)। मदों तो UCPC मॉड्यूल में पारित होने से पहले सामने बफर मॉड्यूल (2 एफ) में उचित माहौल को संक्रमित कर रहे हैं, या प्रक्रिया चैंबर (3)। प्रकोष्ठों दो इन्क्यूबेटरों (4, 5) में सुसंस्कृत हैं। लाइव सेल धुंधला, कॉलोनी उठा, सामान्य सेलुलर आकारिकी और प्रवास के विश्लेषण के आकलन UPC मॉड्यूल में जगह लेता है, या माइक्रोस्कोप चैंबर (6)। अंत में, अपशिष्ट पीछे बफर मॉड्यूल (2R) के माध्यम से व्यवस्था से बाहर निकालता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। < / P>
चित्रा 4. गैसों और पावर के सूत्रों का कहना है। (ए) सीओ 2 कई गुना एक 4 x 4 सेटअप के रूप में यह प्रयोगशाला के सभी इन्क्यूबेटरों की आपूर्ति करती है। (बी) के ओ 2 कई गुना एक 2 x 2 सेटअप और आपूर्ति केवल सेल उत्पादन सुविधा है। प्रणाली के लिए नाइट्रोजन एक vaporizer में उत्पन्न होता है (सी, बस से बाहर निकलें पर हस्ताक्षर के नीचे) एक तरल नाइट्रोजन कई गुना (सही करने के लिए) से जुड़ा हुआ भी है कि स्वचालित रूप से (बाएं नीचे) भरता cryofreezers। कई गुना एक 2 x 2 सेटअप 160 एल तरल नाइट्रोजन टैंक के दो जोड़े द्वारा आपूर्ति की जा रही है। सीओ 2, 2 हे, और एन 2 के माध्यम से shutoffs (डी) छत से आपूर्ति की जाती है। घर निर्वात भी इस स्थान पर आपूर्ति की है। बिजली तारों कि इस प्रणाली के लिए बिजली की आपूर्ति की एक जोड़ी सिर्फ आपूर्ति गैस shutoffs पीछे देखा जाता है।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. pluripotent स्टेम सेल सेंडाइ वायरस से हाइपोक्सिया में निकाली गई। (ए) SC187-SF4-2I0-E3 IPSCs IPSCs (नामकरण पशुओं का चारा एट अल। 9 में पाया जाता है), चरण विपरीत 10X। (बी) SC88.1-UH1-2I0 IPSCs वायुसेना 594 लेबल ट्रा-1-60, 1 के साथ लाइव से सना हुआ: मीडिया में 100 कमजोर पड़ने। सभी IPSCs सेंडाइ वायरस के साथ 5% 2 हे में सेल उत्पादन सुविधा में transduced थे। (सी) SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC व्युत्पन्न एनएससी के चरण विपरीत, चैम्बर स्लाइड्स में 5% 2 हे से बढ़ी। कोशिकाओं तो 4% paraformaldehyde में तय किया गया है और विरोधी मानव Nestin प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग, और एलेक्स-488 माध्यमिक एंटीबॉडी। सभी स्केल सलाखों 100 पर हैं1;। एम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
सीपीएफ के भीतर विकसित कोशिकाओं में ऑक्सीजन या कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता में कोई बदलाव नहीं देखने के रूप में वे चैम्बर प्रसंस्करण चैम्बर माइक्रोस्कोप और वापस करने के लिए इनक्यूबेटर से चलते हैं। यह महत्वपूर्ण है प्रत्येक कक्ष में स्थिति विशेष इनक्यूबेटर में जो कोशिकाओं कोशिकाओं इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं इससे पहले रखा जाता है करने के लिए मिलान कर रहे हैं। तंत्र के भीतर माहौल लगातार HEPA फ़िल्टर है और ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता के संबंध में प्रचलित है। प्रकोष्ठों पीएससी या एनएससी, 5% और 9%, क्रमशः के लिए मानक मात्रा में उगाया जा सकता है; या वैकल्पिक सांद्रता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए या विशिष्ट प्रयोगों के लिए चुना जा सकता है। इस प्रकार, तंत्र चिकित्सा ग्रेड ऑक्सीजन, कार्बन डाइऑक्साइड और नाइट्रोजन (चित्रा 4) के लगातार स्रोतों के साथ आपूर्ति की है। इन गैसों के सभी तीन गैस विशिष्ट कई गुना प्रणाली है कि निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित द्वारा आपूर्ति की जाती है। तंत्र भी एक अंशांकन गैस मिश्रण से मिलकर साथ आपूर्ति की है10% (± 0.01%) ऑक्सीजन में कार्बन डाइऑक्साइड। कई गुना सिस्टम सेल उत्पादन सुविधा के बाहर रखे जाते हैं और गैसों छत के माध्यम से सुविधा में पहुंचाया जाता है। अंशांकन गैस सुविधा के भीतर रखे है। तंत्र इसके अतिरिक्त, घर वैक्यूम के साथ आपूर्ति की है भी छत के माध्यम से। एक इलेक्ट्रॉनिक निगरानी प्रणाली का उपयोग करते हुए और वायरलेस इकाइयों को भेजने, सभी manifolds के उत्पादन के दबाव लगातार निगरानी कर रहे हैं। घटना है कि किसी भी दबाव रेंज से बाहर जाता है, सेल उत्पादन सुविधा ऑपरेटरों स्वचालित रूप से फोन किया और इस तरह के अधिसूचित किया है कि उचित कार्रवाई की जा सकता है।
तंत्र की बिजली की आवश्यकताओं को छह समर्पित 120 वी सर्किट छत से उतरते से मुलाकात की और एक निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए अस्पताल के बैक-अप जनरेटर से जुड़े हैं। तंत्र के आपरेशन सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है एक uninterruptible बिजली की आपूर्ति के माध्यम से संचालित एक पीसी आधारित कंप्यूटर पर। इन बिजली और कंप्यूटर की व्यवस्थायह सुनिश्चित करें कि कार्य प्रणाली लगातार यहां तक कि एक सार्वजनिक बिजली व्यवस्था की विफलता की स्थिति में। सॉफ्टवेयर तंत्र को नियंत्रित करने के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल इंटरफ़ेस (चित्रा 1) जो ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता के नियंत्रण के साथ ही तापमान, आर्द्रता, और चैम्बर दबाव के लिए अनुमति देता है। इन सभी मापदंडों के मूल्यों में लगातार सभी तंत्र मापदंडों के चल रहे एक रिकॉर्ड उपलब्ध कराने के लिए दर्ज हैं। इस डेटा उनकी अखंडता की रक्षा के लिए हर रात एक रिमोट सर्वर पर समर्थित है। कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर का आकलन और / या किसी भी पैरामीटर को बदलने के लिए प्रशासनिक उपयोगकर्ताओं द्वारा दूर से पहुँचा जा सकता है। साथ ही, कंप्यूटर और सॉफ्टवेयर दूर तक पहुँचा जा सकता है, तंत्र मापदंडों के इंटरैक्टिव आकलन की अनुमति और स्थानीय उपयोगकर्ताओं के साथ समस्या निवारण। एक अतिरिक्त अलार्म इकाई भेजने के तंत्र से जुड़ा है कि इस तरह के सेल उत्पादन सुविधा ऑपरेटरों तंत्र के किसी भी आउट-ऑफ-सीमा की स्थिति की सूचना दी जाती है। दूरदराज के उपयोग की गapabilities में लॉग इन करें और आउट-ऑफ-सीमा हालत की बारीकियों के आकलन के लिए अनुमति देते हैं।
तंत्र एक मॉड्यूलर प्रणाली के रूप में दोनों एक स्थूल और सूक्ष्म एक अर्थ में बनाया गया है। ऐसे इन्क्यूबेटरों और प्रसंस्करण के कक्षों के रूप में अलग-अलग सेल संस्कृति मॉड्यूल, एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ उनके आयामों और आवश्यकताओं के संबंध में के रूप में अच्छी तरह से अपने लेआउट में अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, व्यक्तिगत मॉड्यूल के नियंत्रण कार्यों का सबसे खुद को मॉड्यूलर कि इस तरह के व्यक्तिगत वायुमंडलीय गैस नियंत्रकों, उदाहरण के लिए, आसानी से व्यवस्था करने के लिए महत्वपूर्ण विघटन के बिना बदला जा सकता है।
इस तरह के सूक्ष्म दृश्य और सेल संस्कृतियों के हेरफेर के लिए एक के रूप में विशेष प्रसंस्करण कक्षों, आसानी से व्यवस्था करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। दोनों चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रणाली (चित्रा 6) इतना है कि कोशिकाओं को लाइव कलंकित किया जा सकता अंदर हैं, और कालोनियों टी अंदर के रूप में एक ही वातावरण की स्थिति में विच्छेदित किया जा सकतावह इन्क्यूबेटरों। प्रसंस्करण के चैम्बर की ओर दीवारों में बंद grommets के माध्यम से केबल की रूटिंग उपकरण जैसे बिजली की आपूर्ति और कंप्यूटर तंत्र के बाहर रखा जाना है, आमतौर पर एक गाड़ी (चित्रा 6) पर अनुमति देता है।
सेल उत्पादन सुविधा में प्रसंस्करण कक्षों पारंपरिक BSCs तुलना में एक अलग airflow के पैटर्न है। पारंपरिक BSCs में, airflow के एक केंद्रीय निकास वेंट से नीचे बहती है और दो अलग-अलग धाराओं, जो है तो आगे और पीछे कैबिनेट की मंजिल के हिस्से में दो अलग अलग सेवन vents के द्वारा लिया जाता है में विभाजन। इसके विपरीत, सीपीएफ छत के आगे के हिस्से में एक भी वेंट है। एयर नीचे की ओर और कक्ष, जहां यह तो एक सेवन वेंट में ऊपर की तरफ खींचा है के पीछे की ओर बहती है। हालांकि सीपीएफ स्वाभाविक बहुत साफ है, इस अद्वितीय airflow के पैटर्न का मतलब तकनीशियनों थोड़ा संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए उनकी तकनीक को समायोजित करने के लिए किया है। एक पारंपरिक बीएससी, एक प्रयोगशाला कार्यकर्ता एस के साथ के रूप मेंHould से बचने के लिए खुला सेल संस्कृति प्लेटों और मीडिया की बोतलों के अपस्ट्रीम उनके हाथ रखकर। हालांकि, जिस दिशा नदी के ऊपर है सीपीएफ में बदल दिया गया है
सेल उत्पादन सुविधा प्रयोगशाला में ही काफी मानक है और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से सुसज्जित आता है, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज, एक सेंट्रीफ्यूज, और एक पानी के स्नान। प्रयोगशाला भी सुविधाजनक हाथों से मुक्त आपरेशन के लिए पैर नियंत्रण के साथ एक सिंक है। इस प्रयोगशाला के लिए आदेश में एक कार्यात्मक नैदानिक सेल उत्पादन सुविधा बनने के लिए, हालांकि, कई अतिरिक्त संशोधनों अभी भी किया जाना चाहिए। सबसे पहले, तंत्र खुद वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों, विविक्त, और क्लोरीन डाइऑक्साइड जो परिशोधन के लिए प्रयोग किया जाता है की सांद्रता की निगरानी करने की क्षमता है करने के लिए उन्नत किया जाना चाहिए। दूसरे, एक प्रसंस्करण के लिए एक FACS मशीन युक्त चैम्बर रखे और एक बफर मॉड्यूल के माध्यम से तंत्र के बाकी हिस्सों से जुड़ा जा सकता है। यह सेल छँटाई और टीआर की शुद्धि के लिए अनुमति देगाउचित पर्यावरणीय परिस्थितियों में ansplantable सेल आबादी। अन्त में, पूरे तंत्र एक नरम दीवार साफ कमरे के भीतर रखे जाना चाहिए। इस तंत्र 5 के लिए मानकीकरण (आईएसओ) कक्षा 8 पर्यावरण के लिए एक अंतरराष्ट्रीय संगठन है।
उच्च बाँझपन और सीपीएफ के कंप्यूटर नियंत्रित प्रकृति यह सेल आधारित चिकित्सा और अच्छा विनिर्माण प्रक्रियाओं के साथ भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए एक आदर्श व्यवस्था बना देता है। संक्रमण के जोखिम को बहुत कम किया जाता है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, सेल विस्तार की शर्तों स्वचालित रूप से दर्ज की गई और कंप्यूटर सिस्टम द्वारा संग्रहीत हैं। गैस की सांद्रता, तापमान, आर्द्रता, और सिस्टम में पहुँच की सभी घटनाओं में विचलन कड़ाई से दस्तावेज हैं। यह बहुत मदद कर सकते हैं जब उत्पाद की गुणवत्ता की समस्याओं की जांच। हालांकि, अब भी सीमाएं हैं। किसी भी और सभी अभिकर्मकों और आपूर्ति के उपयोग (जैसे, मीडिया घटकों, pipettes, प्लेट) को अलग से प्रलेखित किया जाना चाहिए। जोड़नाitionally, वहाँ (मानव त्रुटि के कई रूपों सहित) संभावित समस्या है कि पैदा कर सकते हैं जो पूरी तरह से चर सीपीएफ की निगरानी प्रणाली द्वारा दस्तावेज से संबंधित नहीं है की एक भीड़ हैं। इस प्रकार, उच्च प्रशिक्षित कर्मियों और कार्यों का विस्तृत मार्गदर्शन प्रलेखन के लिए जरूरत जगह में रहता है।
Acknowledgments
लेखकों Xvivo संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली, विशेष रूप से मैट फ्रीमैन का उपयोग करने के लिए सीखने में उनकी मदद के लिए Biospherix में कर्मचारियों स्वीकार करना चाहते हैं; मीलों और केली कंस्ट्रक्शन कंपनी, प्रयोगशाला के बुनियादी ढांचे, विशेष रूप से Russ ह्यूजेस की स्थापना में उनके काम के लिए इंक के कर्मचारियों; प्रयोगशाला फिर से तैयार करना, विशेष रूप से एडम Lukhard और डेविन Hugie समन्वय में सुविधाएं और समर्थन सेवा से अपने काम के लिए की ऑरेंज काउंटी विभाग के बच्चों के अस्पताल के कर्मचारियों; डेटा प्रबंधन के बुनियादी ढांचे और दूरदराज के उपयोग, विशेष रूप से वियतनाम ट्रॅन को स्थापित करने में उनकी मदद के लिए सूचना प्रणाली का ऑरेंज काउंटी विभाग के बच्चों के अस्पताल के कर्मचारियों; परियोजना है, विशेष रूप से डॉ मारिया Minon और ब्रेंट Dethlefs के अपने लम्बे समय से समर्थन के लिए ऑरेंज काउंटी के कार्यकारी प्रबंधन दल के बच्चों के अस्पताल। इस काम ऑरेंज काउंटी के बच्चों के अस्पताल और पुनर्योजी Medicin के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट द्वारा वित्त पोषित किया गयाPHS को अनुदान TR3-05476 के माध्यम से ई। सभी लेखकों को इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
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- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
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