Protocol
1. Indledende opsætning
- Indstilling Gas- og temperatur Koncentrationer
- Brug af softwaren, skal du klikke på "Gæst" fanen placeret i det øverste venstre hjørne af den grafiske brugerflade. Login til systemet ved hjælp af en udpeget brugernavn og adgangskode. Kontroller, at hver bruger har deres eget brugernavn og adgangskode.
- Klikke på et modul til at justere (figur 1). Inden det nye vindue, der viser de aktuelle indstillinger, skal du klikke på den eksisterende O 2 setpunkt værdi under "Set punkt", og indtast det ønskede O 2 koncentrationsniveau for dette modul. Indtast 5% O 2, hvis pluripotente stamceller vil blive dyrket eller manipuleres i dette modul, og 9% O 2, hvis neurale stamceller vil blive dyrket eller manipuleret. Klik på det grønne flueben for at bekræfte den indstillede.
Bemærk: To moduler er ikke gas-justerbar: den laminare hætte, og mikroskopet kammeret. De gaskoncentrationer i laminar flow hætte er atmosfærisk while dem i mikroskopet kammeret passivt vedligeholdes af gaskoncentrationerne i proceskammeret. - Gentag dette trin for CO 2. Indtast et sæt punkt af 5% CO2 i alle moduler med undtagelse af buffer kamre, som kun kan justeres til O 2.
- Overvåg de nuværende gaskoncentrationer, der er mærket som "procesværdier", for at sikre, at de når de nye setpunkter.
- Juster gas sæt punkter i alle moduler til de relevante værdier. Match CO 2 og O 2 niveauer af kamre, der vil blive udsat for hinanden. For eksempel, justere proceskammeret til 5% O 2, inden du åbner en inkubator, der vokser celler ved 5% O 2. Også justere til 5% O2 nogen buffer kammer, der bruges til at tilføje elementer til processen kammer i dette tidsrum.
- Indstil temperaturen af proceskammeret til 37 ° C under anvendelse af samme skærm til gas justeringer. Også sat proceskammeret fLoor temperaturen til 37 ° C.
- Klikke på inkubering modul banker under hver inkubator. Juster temperaturen af bankerne til 37 ° C.
- Drift af Buffer Chambers
- Saml alle de leverancer, der er nødvendige for den givne opgave (fodring, spaltning, farvning, etc.) i starten at forhindre en forsinkelse i arbejdet flow. Liberalt sprøjte alle materialer med 70% ethanol og lad dem tørre i laminar hætte. Sprøjt ikke kolber eller plader af celler - tørre dem forsigtigt med en steril gaze svamp mættet med 70% ethanol.
- Kontroller, at både de ydre og indre døre af bufferen kammer er forsvarligt lukket. Derefter åbne uden for døren, og placere elementerne indeni.
- Luk yderdøren. Inden softwaren, skal du vælge buffer-modul, og klik på fanen fortyndingsfaktoren. Indtast 1 ind i log faktor boksen. Klik starte.
Bemærk: En "fortyndingsfaktor" er defineret til at betyde, at bufferen modulets atmosfære vilblive fjernet og erstattet en gang med rent, HEPA-filtreret gas. - Når den grafiske brugerflade er stoppet blinkende "fortyndingsfaktor" åbne buffer kammerets indre port og bringe materialerne inde i proceskammeret.
Forsigtig: Lad ikke de indre og ydre døre til nogensinde være åbne på samme tid og ikke åbne den inderste dør, hvis bufferen kammer ikke har gennemgået en fortyndingsfaktor. - For at fjerne elementer fra proceskammeret, først sikre, at bufferen kammer har gennemgået en fortyndingsfaktor. Åbn derefter den inderste dør, placere de elementer, der skal fjernes inde, og luk det inderste dør. Derefter åbne yderdøren og fjerne elementerne.
Bemærk: En fortyndingsfaktor behøver ikke at blive kørt før åbning af yderdøren.
2. Introduktion og Fodring celler
- Incubator Setup
- Place 3 petriskåle i vandet pan ved basis af hver inkubator. Fyld disse retter med sterile vand. Må ikke direkte fylde vand pan. Vedligehold vandstanden i disse retter, da de er afgørende for at opretholde den relative luftfugtighed (RH) setpunkt i væksthuse.
- Inden for den grafiske brugerflade, klik på inkubatoren. Klik på den eksisterende værdi for relativ fugtighed (RH) under setpunktet og indtast 85%. Klik på det grønne flueben for at acceptere denne værdi.
- Forberedelse af Cell Production Facility for Cells
- Hvis det ikke allerede gjort det, justere buffer kamre, proceskammeret og en inkubator til gas setpunkter nødvendige for den type celle at blive indført.
- Rengøre overfladen af proceskammeret med steril gaze og en ikke-brændbar desinfektionsmiddel. Brug ikke pereddikesyre-baserede desinfektionsmiddel, som i et lukket system den stærke, dvælende dampe er giftige for pattedyrceller. Brug i stedet benzalkoniumchlorid-baserede produkter.
- Fortsæt desinfektion. Rengør handsker og overflader, som er commoun rørt, såsom dørhåndtag. Brug desinfektionsmiddel grundigt men sparsomt, som overskydende væske i proceskammeret vil bidrage til fugtighed, kondensation og eventuel mikrobiel vækst.
- Rengøre overfladen af det laminare flow hætte og buffer kammer med 70% ethanol, og lad det tørre. Placer kolben eller plade af celler (i vores tilfælde, kvikskranker eller NSC) i hætten, og kortvarigt tørre dens ydre overflade med en steril gaze svamp mættet med ethanol.
- Sæt kolben eller plade i bufferen kammer, og køre en fortyndingsfaktor (trin 1.2.3).
- Ved afslutningen af fortyndingsfaktoren, straks bevæge kolben eller plade til den passende inkubator. Som inkubatorerne er på bagsiden af proceskammeret, trække en hylde ud i proceskammeret for celle placering. Undgå at åbne inkubatoren døre unødigt eller i længere tid, da processen kammerets luft er meget tør sammenlignes med inkubatorerne, og vil resultere i en betydeligtab af fugtighed i inkubatoren.
- Fodring Cellekulturer
- Saml medium komponenter, serologiske pipetter, en elektronisk pipette, gaze og desinfektionsmiddel. Også samle en affaldscontainer for brugt cellekulturmedium, men ikke fylde den med blegemiddel. Bring materialer ind i proceskammeret gennem en buffer kammer som beskrevet i afsnit 1.2. Forbered cellekulturmedium i proceskammeret, som tidligere beskrevet 9,10 (også se Materialer tabel)
- Arrangere materialer på en sådan måde, at muliggøre en optimal arbejdsplads. Undgå at placere elementer, der ikke bliver brugt i centrum af proceskammeret.
- Tillad for mediet i ligevægt med CO 2 og O 2 niveauer til stede i systemet ved at lade beholderen medier lidt reducerede. Nogle PSC mellemstore fabrikanter angiver ikke at varme medier ved 37 ºC; hvis dette er tilfældet, bruge en buffer kammer ækvilibrere mediet. Tillad migdium ækvilibrere i 20 min.
- Fjern det gamle medium fra brønde med en passende stereologiske pipette og en elektronisk pipette. For kvikskranker, fjerne alle, men en lille resterende mængde af det gamle medium, nok til at forhindre udtørring under fodringen. For NSC'er, fjerne halvdelen af det gamle medie. Pipetter affaldet ind i affaldscontaineren.
- Placer den brugte pipette tilbage i den originale indpakning, og flytte det til den side af proceskammeret, eller ind i en buffer kammer udpeget til fjernelse af affald. Med en frisk steril serologisk pipette, tilsættes frisk medium til celle dyrkningsplader og placere pladerne tilbage i deres udpegede inkubator.
- Ved slutningen af fodring, spray gaze med desinfektionsmiddel og rengøre gulvet og dørhåndtag af processen kammer grundigt. Hvis der er flere cellelinier dyrkes i systemet, sterilisere mellem fodring hver cellelinie. Dette hjælper minimere risikoen for krydskontaminering.
- Ved afslutning, fjern affaldeller andre unødvendige genstande gennem en af de heri kamre.
3. Opdeling Cell Cultures
- Enzymatisk Passage til kvikskranker eller NSC'er
- Saml alle elementer, der er nødvendige for passage. Dette omfatter medier, enzym eller ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning buffer (sidstnævnte er for NSC'er kun), DPBS, plader eller kolber, ekstracellulær matrix (ECM), koniske rør, og serologiske pipetter. Bringe dem i systemet under anvendelse af en puffer kammer.
- Coat friske plader eller kolber med ECM, som tidligere beskrevet 9,10. Nogle ECM-såsom de afledt fra muse sarcoma cellelinier - er kun flydende mellem 4 og 15 ° C, så brug en steriliseret kold blok eller gel is pack at holde ECM koldt under arbejdet i den opvarmede proceskammeret.
- Pipetter off brugte medium fra kulturen og bortskaffe det i affaldscontaineren.
- Skyl brønden eller kolben overflade ved hjælp 1 ml DPBS / brønd og bortskaffe DPBS.
- Tilføj 1 - 2 udml varm enzym til hver brønd. Kun meget tætte kulturer kræver 2 ml.
- bevæge sig straks kultur parabol eller kolbe til mikroskopet kammeret, og observere kulturen omhyggeligt. Hold øje med tegn på enkelte celler begynder at løsne fra fadet. Må ikke vente, indtil cellerne flyder i suspension, før du fortsætter til næste trin.
- Retur cellerne til den vigtigste proces kammeret. Anvendelse af en 5 ml serologisk pipette tilsættes 4 ml DPBS for hver 1 ml af enzym, og derefter kraftigt pipetteres op og ned for at løsne cellerne fra brøndens overflade. Hvis passage flere brønde i en flerlags plade, tilsæt DPBS til hver brønd før løsne cellerne fra de enkelte brønde.
- Overfør enzymet og PBS cellesuspension til en passende størrelse konisk rør.
- Hvis en centrifuge er ikke tilgængelig i cellen produktionsanlæg, stramt forsegle konisk rør, som anbringes i en buffer kammer og forsegle døren lukket.
- Fjern den koniske rør fra buffer kammeret fra den laminare strømning side og spin cellerne ved 100 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Spray konisk rør med 70% ethanol, og bringe det i proceskammeret anvendelse af en buffer kammer og fortyndingsfaktoren.
- Pipetter off supernatanten, og cellerne resuspenderes i 2 ml PSC eller NSC medium. Hvis passage kvikskranker, så sørg for at inkludere ROCK inhibitor i mediet i en koncentration på 10 uM, som tidligere beskrevet 9,10.
- Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer, og bestemme antallet af brønde eller plader påkrævet. Plate PSC'er ved 5 x 10 4 - 1 x 10 5 celler / cm2. Opdele NSC'er ved et 1: 2-forhold.
Bemærk: NSC'er ofte klumper og modstå nøjagtig optælling i et hæmocytometer. - Hvis kryopræservering af cellerne er påkrævet, følge den relevante protokol 9,10, men sikre, at alle forsyninger og frysning medier er forberedt på forhånd og placeret inde i processen kammer. DMSO er meget giftigt for cellerne ved 376; C, så arbejde meget hurtigt. Hold isopropanol-kappe frysning beholder ved stuetemperatur i laminar flow hætte. Når cryokonserveringshætteglas fyldes og forsegles, straks fjerne hætteglassene fra proceskammeret ved at passere dem gennem en buffer kammer.
- Manuel Passage af kvikskranker
- Bekræfter, at kultur skal passeres, som tidligere beskrevet 8. Hvis ja, forberede friske plader eller kolber belagt med ekstracellulære matrix. Så ændre mediet helt.
- Rengør mikroskopet kammeret med steril gaze fugtet med en sparsom mængde ikke-brændbart desinfektionsmiddel - for meget vil resultere i overskydende dug i kammeret. Kun rengøre handsker, gulvareal, og scene. Bring flere 200 pi eller 1000 gi individuelt indpakket pipettespidser ind i kammeret.
- Bring plade af PSC i mikroskopet kammeret, fjernes låget, og læg den med forsiden nedad på frisk renset gulvet. Forlader låget op udsætter undersiden dirrekte til luftstrømme, og til potentiel forurening.
- Pak et pipettespids, og brug af mikroskopet at visualisere kultur, bryde fra hinanden kolonier, der har god morfologi med spidsen af pipetten.
Bemærk: pipettespids kan fastgøres til en pipette, hvis den enkelte bruger finder dette mere komfortabel. - Sæt låget på pladen, og flytte pladen tilbage til proceskammeret.
- Pipetter overskydende ECM fra den nye plade, og overføre medier fra den gamle plade (indeholdende koloni stykker i suspension) til den nye plade. Hvis den gamle plade stadig indeholder kolonier, der ikke er klar til at blive plukket, fodre det så godt.
4. Specialized Culture Techniques
- Sendai Transduktion af fibroblaster i PSC
- I cellen produktionsanlæg, udvide humane hudfibroblaster 1 i fibroblast medium indeholdende DMEM / F12, 10% FBS, og 20 ng / ml FGF2, ved 5% O2. Brug 6-brønd kultur dishes overtrukket med 0,1% gelatine.
- Forbered cellerne, der skal transduceres af dissociere dem med 1 ml 0,25% trypsin per brønd. Inaktivere trypsin med 1 ml fibroblast medium. Centrifugering ved 200 xg, cellerne resuspenderes i 1 ml fibroblast medium, og tælle dem ved hjælp af et hæmocytometer.
- Resuspender 2,0 x 10 5 celler i 2 ml fibroblast medium og tilføj cellesuspensionen til 1 brønd i en gelatineovertrukket brønds plade 6 (2,1 x 10 4 celler / cm2). Sætte cellerne tilbage i inkubatoren.
- Tillad 24 timer for cellerne at fastgøre til bunden af pladen.
- Placer frisk fibroblast mediet inden i proceskammeret (1 ml medium per brønd af celler, der skal transduceres), og lad det ækvilibrere til gasserne.
- Sterilisere en pre-kølet kold blok med 70% ethanol og læg den i en buffer kammer. Brug en gel ispose med huller skåret i det, hvis en kommerciel kold blok er ikke tilgængelig.
Bemærk: Der er 3 - 4 separate Sendaivira (afhængigt af versionen af transduktion kit), der skal optøs hurtigt, men holdes i den kolde blok når optøet. - Dyp den nederste halvdel af rørene i et 37 ° C vandbad i 15 sek (ikke nedsænke rørene), derefter straks rense rør udendørsbrug med 70% ethanol. Anbring glassene på den steriliserede kold blokeret bufferkammeret og køre en fortyndingsfaktor.
- Arbejde hurtigt, tilføjer den nødvendige volumen af hver Sendai omprogrammering virus til den ligevægt medium 2. Dette volumen er bestemt af tre variabler - antallet af celler, titeren af hvert virus, og den ønskede infektionsmultiplicitet for hvert virus. Kontakt kit manual for anbefalede MOI. Formlen er:
[(Antal celler transficeres) (infektionsmultiplicitet) (1.000)] / (viral titer) = nødvendig pi virus - Fjern supernatanten fra brønden (r) af celler, der skal omprogrammeres. For hver brønd tilsættes 1 ml af medium indeholdende vira. Vip forsigtigt pladen, og pas på ikke at spilde medier, og placer pladen tilbage i 5% O 2 inkubator.
- Efter 2 timer forsigtigt klippe pladen igen og gentage igen efter endnu 2 timer.
- Efter 24 timer (dag 1 efter transduktion), foder godt med 1 ml pluripotente stamcelle medium. Gentag på dag 2, men ikke fjerne mediet fra brønden.
- På dag 3 og 4, ændre halvdelen af mediet.
- På dag 5 og videre, ændre hele medium.
- Når kolonier vises, plette kultur med sterile antistoffer for at bekræfte, at kolonierne er faktisk pluripotente, som tidligere 2 beskrevne. Som med fodring celler, at de PSC medier indeholdende antistofferne er blevet ækvilibreret til gasserne i cellen produktionsanlæg.
Bemærk: I et vellykket omprogrammering bør IPSC kolonier være til stede cirka to uger efter transduktion en. - Når kolonierne er vokset stornok bruge mikroskop for at markere og mekanisk passage dem på en ECM-belagt plade, som beskrevet i afsnit 3.2.
- Expand kolonierne enten manuelt eller enzymatisk, som tidligere beskrevet 9,10.
5. rydde op efter daglig brug
- Læg alle affaldsmaterialer, herunder kolben flydende affald, i en steril buffer kammer. Tør overfladen af behandlingen kammeret og alle de områder, der er kommet i kontakt med forsyninger med steril gaze og ikke-brændbart desinfektionsmiddel.
- Fjern alle faste materialer affald fra bufferen kammer og kassér i passende affaldsbeholder.
- Kassér flydende affald i en egnet affaldsbeholder, eller blot blandes med blegemiddel og hæld ned i afløbet. Rengør affaldsbeholderen med sæbe og en børste. Sterilisere beholderen med 70% ethanol og flytte den tilbage til processen kammeret via en buffer kammer.
Bemærk: Det anbefales ikke at bruge blegemiddel iaffaldsbeholderen, mens det er inde i systemet, som blegemiddel dampe kan recirkulere og skade cellekulturer. - Af hygiejniske overvejelser, tørre ned foran plastoverflade af systemets behandling kammer med 70% ethanol. Dette hjælper med at rense ud sved og hud olier fra brugerens pande.
- Hvis kondens har opbygget inde i processen kammer, køre en fortyndingsfaktor at rydde kondens. Tillad mindst 1 time for at dette kan fuldføre.
6. Rutinemæssig Ikke-daglige opgaver
- Genopbygge vandskåle i cellekultur væksthuse med sterilt, destilleret vand efter behov. Top fra opvasken mindst en gang om ugen. Dog vil fordampningshastigheden svinge baseret på, hvor ofte inkubatoren dørene åbnes, mængden af væske i kulturer, og indstillingerne inkubator.
- En gang om måneden, justere de O 2 og CO 2 indstillinger i alle kamre. Dette kræver brug af SPAN (kalibrering) gas, som fortsatains kendte koncentrationer niveauer af O2 og CO2 som et sammenligningsgrundlag. Sørg for, at der er tilstrækkelig SPAN gasforsyning, før du starter kalibreringen. Systemet anvender specifikke gas sensorer, der ligger i hvert modul, til at detektere gaskoncentrationer; Anvendelsen af høj kvalitet SPAN gasser sikrer, at sensorerne pålideligt give nøjagtige gaskoncentrationer.
- Erstat handskerne i proceskammeret og mikroskop kammer regelmæssigt. Udskift handsker hver 2. måned, uanset hvor ofte systemet udnyttes. Før installationen, sterilisere de nye handsker med desinfektionsmiddel. Kør en fortyndingsfaktor på proceskammeret efter handskerne er blevet erstattet.
Bemærk: Når strækkes over manchetterne af systemet, nitril har en tendens til at udvikle huller i områder udsat for fysisk stress og varme. Dette er normalt og uundgåeligt slitage. - Skift ud sprøjtefiltre i alle kamre hver 6. måned.
- Udskift eller vaske than forfilterovervågning på laminar flow hætte, så snart det begynder at dukke snavset.
- Se producentens dokumenter regelmæssigt for oplysninger om udskiftning af større dele.
7. Rengøring af systemet
- I tilfælde af en større kontaminering begivenhed påvirker størstedelen af cellekulturer, flytte eventuelle overlevende cellekulturer ud af systemet, eller (hvis muligt) i en upåvirket inkubator.
- Sluk for kontrol gas til alle kamre, bortset fra at i upåvirket væksthuse.
- Fjern det fleksible frontpanel af apparatet, og fjern de stålreoler fra det berørte cellekultur inkubator. Fjern også vand pan.
- Autoklaver inkubatoren hylder og vand pan, og læg dem tilbage i inkubatoren. Tør de indvendige overflader af inkubator med 70% ethanol. Tillad ethanol til at fordampe, og lukke inkubatoren døren.
- Tør overfladerne af processen og mikroskop kammer med 70% ethanol. Sæt frontpanelet af apparatet.
- Tør de indvendige overflader af apparatet, herunder at den berørte inkubator, med ikke-brændbart desinfektionsmiddel. Lad døren af den påvirkede inkubator åben, og køre en fortyndingsfaktor på processen kammer. Sørg for, at mikroskop kammer døre er også åbne.
- Til rutinemæssig rengøring af cellekultur inkubatorer, at inkubatoren og proces kammer er i de samme atmosfæriske indstillinger. Åbn inkubator døren, og placere alle celle dyrkningsskåle på overfladen af proceskammeret.
- Tør inkubatoren hylder og indvendige overflader med ikke-brændbart desinfektionsmiddel. Tillad desinfektionsmidlet at fordampe, og flytte cellekulturerne tilbage til inkubatoren. Arbejd så hurtigt som muligt for at undgå udtørring af cellekulturer.
Representative Results
Dette manuskript beskriver i detaljer en celle produktionsanlæg, og de unikke aspekter ved dyrkning af celler i et lukket system. Hovedparten af cellen produktionsanlæg omfatter en skræddersyet, Lukkede, cellekulturapparatet som har en lille fodaftryk og let kan rummes inden for en 6 x 7,5 m 2 rum (figur 2). På intet tidspunkt er cellerne i apparatet udsættes for laboratoriepersonalet eller miljø. Apparatet består af flere moduler: et proceskammer, en laminar flow hætte, 2 buffering Airlock kamre i mellem hætten og proceskammeret, to cellekultur inkubatorer, og et mikroskop kammer ved siden af proceskammeret (figur 3). Systemet styres af software tillader miljømæssige variabler, der skal kontrolleres og overvåges (figur 1). Den computer, der kører denne software er på en nødstrømsforsyning. Gasser føres ind the system ved et sæt manifolder til oxygen, nitrogen og carbondioxid (figur 4). Gasser for enheden er leveret af manifold systemer, der har to sæt tanke hver - et aktivt sæt og en reserve sæt. Når det aktive sæt trækkes ned, skifter manifolden automatisk til reserven sæt og personale orden udskiftning tanke. Den effekt er på en backup generator system.
Pluripotente og neurale stamceller kan dyrkes i hypoxiske betingelser i denne facilitet under anvendelse af tidligere udviklede protokoller 9, med den ekstra komplikationer forbundet til den hidtil ukendte udstyr. Pluripotente stamceller kan afledes under anvendelse af Sendai-virus, under anvendelse pluripotens-specifikke antistoffer til at identificere fuldt transficerede kolonier, som derefter isoleres og ekspanderes. (Figur 5A og B), fra disse iPSCs, neurale stamceller og neuroner kan afledes under anvendelse af dobbelt SMAD hæmning, og deres fænotype er verificeret USI NG NSC-specifikke antistoffer (figur 5C og D).
Figur 1. Grafisk interface for Cell Production Facility. (A) Den grafiske repræsentation af CPF er standard-skærmen og matcher CAD-tegning er vist i figur 3. Et klik med musen over Buffer Modul 1 (2F i figur 1) åbner sin kontrol skærm (B), hvor O 2 værdier er indstillet til at matche behandlingen kammer (3 i figur 3). Tilsvarende klikke på Process afdeling eller Incubator en bringer deres respektive kontrolskærme (C og D, henholdsvis), hvor værdier kan ændres eller overvåget som passende. rFå = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cell Production Facility. (A) Systemet set fra en forreste højre visning. Bemærk strøm- og gas forbindelser i loftet og vognen med mikroskopet tilbehør og computer til højre. (B) Den laminare flow hætte med adgangsdøre til buffer-moduler ses til højre. (C) Processen kammer med de to væksthuse (sorte døre) ses på bagsiden. (D) Et kig gennem højre side af systemet viser mikroskop og overvåge med dørene til bufferen kamre ses i det fjerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. En CAD Tegning af Cell Production Facility. Alle elementer inde i enheden først tørres af med alkohol og lufttørret i laminar flow hætte (1). Poster er da skiftet til det passende atmosfære i forreste buffer modul (2F), før den ledes ind i UCPC modul, eller proceskammer (3). Celler dyrkes i de to inkubatorer (4, 5). Levende cellefarvning, koloni plukning, vurdering af generel cellulær morfologi og migration analyse finder sted i UPC-modulet, eller mikroskop Afdeling (6). Endelig affald forlader systemet gennem den bageste buffer modul (2R). Klik her for at se en større version af dette tal. < / P>
Figur 4. Kilder til Gasser og Power. (A) CO 2 manifold er et 4 x 4 setup som det leverer alle væksthuse for laboratoriet. (B) O 2 manifold er et 2 x 2 opsætning og forsyninger kun cellens produktionsanlæg. Nitrogen i systemet genereres i en fordamper (C, lige under Exit tegn) fastgjort til en flydende nitrogen manifold (til højre), som fylder også automatisk cryofreezers (nederst til venstre). Manifolden er et 2 x 2 setup forsynes af to par 160 L flydende nitrogen tanke. CO 2, O 2 og N 2 tilføres fra loftet gennem shutoffs (D). leveres også husvakuum på denne placering. Set lige bag gasforsyningen shutoffs er et par strømkabler, der leverer strøm til systemet.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. pluripotente stamceller Afledte i Hypoxi med Sendai-virus. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenklatur findes i Stover et al. 9), fasekontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs levende farvet med AF-594-mærket Tra-1-60, 1: 100 fortynding i medierne. Alle iPSCs blev transduceret i cellen produktionsenhed i 5% O2 med Sendai-virus. (C) Fase kontrast SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-afledte NSC'er, vokset med 5% O 2 i kammer dias. Celler blev derefter fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med anti-humant Nestin primært antistof, og Alex-488 sekundært antistof. Alle skala barer er på 1001,. M Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Celler dyrket inden for CPF se nogen ændringer i ilt eller kuldioxid koncentrationer så de flytter fra inkubator til forarbejdning kammer til mikroskop kammer og tilbage. Det er afgørende, at forholdene i hvert kammer er tilpasset den særlige inkubator, hvor cellerne holdes inden cellerne fjernet fra inkubatoren. Atmosfæren inden i apparatet kontinuerligt HEPA-filtreret og kan tilpasses med hensyn til oxygen og carbondioxid koncentrationer. Celler kan dyrkes ved standard koncentrationer for kvikskrankerne eller NSC'er, 5% og 9%; eller alternative koncentrationer kan vælges til forskellige celletyper eller for specifikke eksperimenter. Således er apparatet forsynet med konstante kilder til medicinsk oxygen, carbondioxid og nitrogen (figur 4). Alle tre af disse gasser er leveret af gas-specifikke manifold systemer, der sikrer konstant forsyninger. Apparatet er også forsynet med en blanding kalibreringsgas bestående af10% (± 0,01%) carbondioxid i oxygen. De mangfoldige systemer er opstaldet uden for cellen produktionsanlæg og gasserne ledes ind i anlægget gennem loftet. Den kalibreringsgas har til huse i anlægget. Apparatet er yderligere forsynet med husvakuum, også gennem loftet. Ved hjælp af en elektronisk overvågningssystem og trådløst sende enheder, er output pres fra alle manifolds konstant overvåget. I tilfælde af, at enhver trykket falder uden for rækkevidde, er celle produktionsanlæg operatører automatisk ringede og meddelte således, at der kan træffes passende foranstaltninger.
De strømkrav af apparatet er opfyldt af seks dedikerede 120 V kredsløb faldende fra loftet og er forbundet med hospitalets back-up-generatorer til at sikre en konstant forsyning. Driften af apparatet styres via software på en PC-baseret computer drevet gennem en nødstrømsforsyning. Disse magt og computer Arrangementersikre, at systemet fungerer kontinuerligt selv i tilfælde af en offentlig magt systemfejl. Den software styring af apparatet har en brugervenlig grafisk grænseflade (figur 1), der giver mulighed for kontrol af ilt og kuldioxid koncentrationer såvel som temperatur, fugtighed, og kammertryk. Værdierne for alle disse parametre registreres løbende for at tilvejebringe en løbende optegnelse af alle apparater parametre. Disse data er bakket op på en ekstern server hver nat for at beskytte deres integritet. Computeren og softwaren kan fjernadgang af administrative brugere at vurdere og / eller ændre enhver parameter. Derudover kan computeren og software tilgås via fjernadgang, så interaktiv vurdering af apparater parametre og fejlfinding med lokale brugere. En ekstra alarm afsendende enhed er forbundet til apparatet, således at celle produktion facilitet erhvervsdrivende bliver gjort bekendt nogen out-of-range tilstand af apparatet. Den fjernadgang capabilities tillader logge ind og vurdere detaljerne i out-of-range tilstand.
Apparatet er udformet som et modulsystem både i en makro og en mikro forstand. Individuelle cellekultur moduler, såsom væksthuse og behandling af kamre, kan tilpasses med hensyn til deres dimensioner og krav samt i deres layout i forhold til hinanden. Derudover er de fleste af de kontrolfunktioner for de enkelte moduler er selv modulopbygget således at de enkelte atmosfæriske gas controllere, for eksempel, kan nemt udskiftes uden væsentlig forstyrrelse af systemet.
Specialiserede behandlingskamre, såsom en for mikroskopisk visualisering og manipulation af cellekulturer, der let tilpasses til systemet. Både fase-kontrast og fluorescensmikroskop er inde i systemet (figur 6), således at celler kan levende farves, og kolonier kan dissekeres i de samme atmosfæriske forhold som inde than væksthuse. Kabler gennem forseglede øskner i sidevæggene af behandlingskammeret tillader udstyr såsom strømforsyninger og computere skal holdes uden for apparatet, som regel på en vogn (figur 6).
Forarbejdningsomkostninger kamre i cellen produktionsanlæg har en anden luftstrøm mønster end konventionelle BSC. I konventionelle BSC, luftstrøm strømmer ned fra en central udstødning og deler sig i to separate strømme, som derefter optages af to forskellige luftindtagene i den forreste og bageste del af kabinettet gulv. Derimod CPF har en enkelt aftræk i den forreste del af loftet. Luft strømmer nedad og mod bagsiden af kammeret, hvor det trækkes derefter opad i en indsugning. Selv CPF er i sagens natur meget ren, denne unikke luftstrøm mønster betyder, at teknikere har til let tilpasse deres teknik til at reducere risikoen for forurening. Som med en konventionel BSC, en lab arbejdstager should Undgå at placere deres hænder opstrøms af åbne cellekultur plader og medier flasker. Men den retning, der er opstrøms er blevet ændret på CPF,
Cellen produktionsanlæg laboratorium selv er temmelig standard og er udstyret med en -20 ° C fryser, en -80 ° C fryser, en 4 ° C køleskab, en centrifuge, og et vandbad. Laboratoriet har også en vask med mund kontrol for bekvem håndfri betjening. For dette laboratorium for at blive en funktionel klinisk celle produktionsanlæg imidlertid adskillige yderligere modifikationer skal stadig foretages. For det første skal apparatet selv opgraderes til at have kapacitet til at overvåge flygtige organiske forbindelser, partikler, og koncentrationer af chlordioxid, som anvendes til dekontaminering. For det andet kan en forarbejdning kammer indeholdende en FACS maskine anbringes og forbindes til resten af apparatet via en buffer modul. Dette vil give mulighed for celle sortering og rensning af transplantable cellepopulationer under de relevante miljøforhold. Endelig skal hele apparatet skal placeres i en blød væg clean room. Dette giver en International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 miljø for apparatet fem.
Den høje sterilitet og computerstyret karakter af CPF gør det til et ideelt system til fremtidige applikationer med celle-baseret behandling og gode fremstillingsprocesser. Risikoen for forurening er væsentligt mildnet, men endnu vigtigere, er betingelserne for celleekspansion automatisk registreres og arkiveres af computersystemet. Afvigelser i gaskoncentrationer, temperatur, luftfugtighed, og alle arrangementer for adgang til systemet er strengt dokumenteret. Dette kan i høj grad hjælpe når han undersøger produktkvalitet problemer. Der er imidlertid stadig begrænsninger. Brugen af enhver og alle reagenser og forsyninger (fx medier komponenter, pipetter, plader) skal dokumenteres separat. Tilføjeitionally, er der et væld af potentielle problemer (herunder mange former for menneskelige fejl), der kan opstå som er fuldstændig uden forbindelse til de variabler, dokumenteret af CPF overvågningssystem. Således forbliver behovet for højt uddannet personale og detaljeret manual dokumentation af opgaver på plads.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende personalet på Biospherix for deres hjælp i at lære at bruge Xvivo medfølgende cellekultursystem, især Matt Freeman; de ansatte i Miles & Kelley Construction Company, Inc. for deres arbejde med at etablere laboratoriet infrastruktur, især Russ Hughes; de ansatte i Børnehospital i Orange County afdeling af Faciliteter og Support Services for deres arbejde med at koordinere laboratoriet remodel, især Adam Lukhard og Devin Hugie; de ansatte i Børnehospital i Orange County afdeling af informationssystemer for deres hjælp til at oprette den data management infrastruktur og fjernadgang, især Viet Tran; Børnenes Hospital i Orange County Executive Management Team for deres mangeårige støtte til projektet, især Dr. Maria Minon og Brent Dethlefs. Dette arbejde blev finansieret af Børns Hospital i Orange County og California Institute for regenerativ Medicine gennem tilskud TR3-05476 til PHS. Alle forfattere bidrog ligeligt til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
