Protocol
1. الإعداد الأولي
- وضع الغاز ودرجة الحرارة تركيزات
- باستخدام البرامج، انقر فوق "ضيف" علامة التبويب الموجود في الزاوية اليسرى العليا من واجهة رسومية. تسجيل الدخول إلى النظام باستخدام اسم المستخدم وكلمة المرور المعينة. تأكد من أن كل مستخدم لديه اسمهم المستخدم وكلمة السر الخاصة.
- انقر على وحدة لضبط (الشكل 1). ضمن إطار جديد عرض الإعدادات الحالية، انقر على مجموعة قيمة النقطة الحالية O 2 أدناه "نقطة تعيين" وأدخل المطلوبة O 2 مستوى تركيز لهذه الوحدة. إدخال 5٪ O 2 إذا كان سيتم نمت الخلايا الجذعية المحفزة أو التلاعب في هذه الوحدة، و 9٪ O 2 إذا كان سيتم نمت الخلايا الجذعية العصبية أو التلاعب بها. انقر على علامة الاختيار الخضراء لتأكيد وجهة مجموعة.
ملاحظة: وحدتين ليست والغاز قابل للتعديل: غطاء محرك السيارة الصفحي، وغرفة المجهر. تركيزات غاز في غطاء تدفق الصفحي هي whil الغلاف الجويه يتم الاحتفاظ تلك الموجودة في غرفة المجهر بشكل سلبي من قبل تركيزات غاز في غرفة العملية. - كرر هذه الخطوة لثاني أكسيد الكربون 2. أدخل نقطة مجموعة من 5٪ CO 2 لجميع الوحدات باستثناء الدوائر العازلة، التي هي قابلة للتعديل فقط لO 2.
- مراقبة تركيزات غازات الحالية، التي وصفت بأنها "القيم العملية"، للتأكد من وصولها إلى نقطة مجموعة جديدة.
- ضبط نقطة مجموعة الغاز من جميع وحدات إلى القيم المناسبة. تتناسب مع مستويات ثاني أكسيد الكربون 2 و O 2 من الغرف التي سوف يتعرض لبعضها البعض. على سبيل المثال، وضبط غرفة العملية إلى 5٪ O 2 قبل فتح الحاضنة التي تنمو الخلايا في 5٪ O 2. ضبط أيضا إلى 5٪ O 2 أي غرفة عازلة التي تستخدم لإضافة عناصر إلى غرفة العملية خلال هذا الوقت.
- ضبط درجة حرارة الغرفة العملية إلى 37 درجة مئوية باستخدام نفس الشاشة لإدخال تعديلات الغاز. أيضا تعيين عملية غرفة ودرجة الحرارة لور إلى 37 درجة مئوية.
- انقر على ضفاف وحدة الحضانة تحت كل الحاضنة. ضبط درجة الحرارة من البنوك إلى 37 درجة مئوية.
- تشغيل العازلة الدوائر
- جمع جميع المستلزمات المطلوبة لمهمة معينة (التغذية، وتقسيم، والتلوين، وغيرها) في البداية لمنع تأخير في سير العمل. بتحرر رش جميع المواد مع الايثانول 70٪ والسماح لهم لتجف في غطاء محرك السيارة الصفحي. لا ترش قوارير أو لوحات الخلايا - يمسحها بلطف مع اسفنجة شاش معقم مشبعة 70٪ من الإيثانول.
- تأكد من أن كلا يتم إغلاق الأبواب الخارجية والداخلية للغرفة عازلة بشكل آمن. ثم فتح الباب الخارجي، ووضع العناصر في الداخل.
- أغلق الباب الخارجي. ضمن البرنامج، حدد وحدة العازلة، وانقر فوق علامة التبويب عامل التخفيف. أدخل الرقم 1 في مربع عامل السجل. انقر فوق ابدأ.
ملاحظة: أ "عامل التخفيف" ويعرف على أنه يعني أن الغلاف الجوي للوحدة المخزن المؤقت سوفسيتم اجلاؤهم والاستعاضة 1 مرة مع الغاز النظيف، التي تم تصفيتها HEPA. - مرة واحدة توقف واجهة رسومية وامض "عامل التخفيف"، فتح الباب الداخلي لغرفة عازلة وجلب المواد داخل غرفة العملية.
الحذر: لا تسمح الأبواب الداخلية والخارجية من أي وقت مضى أن تكون مفتوحة في نفس الوقت ولا تفتح الباب الداخلي إذا كانت غرفة عازلة لم خضعت لعامل التخفيف. - من أجل إزالة العناصر من غرفة العملية، أولا التأكد من أن غرفة عازلة قد خضعت لعامل التخفيف. ثم فتح الباب الداخلي، ووضع البنود التي سيتم إزالتها في الداخل، وإغلاق الباب الداخلي. ثم فتح الباب الخارجي وإزالة العناصر.
ملاحظة: عامل التخفيف لا تحتاج إلى أن تدار من قبل فتح الباب الخارجي.
2. تقديم وتغذية الخلايا
- إعداد الحاضنة
- ضع 3 أطباق بتري في عموم الماء في قاعدة كل الحاضنة. ملء هذه الأطباق مع STERILالبريد الماء. لا تملأ مباشرة عموم المياه. الحفاظ على منسوب المياه في هذه الأطباق، كما أنها حاسمة للحفاظ على نقطة مجموعة الرطوبة النسبية (RH) في حاضنات.
- ضمن واجهة رسومية، انقر على الحاضنة. انقر على القيمة الحالية للرطوبة النسبية (RH) تحت نقطة مجموعة وإدخال 85٪. انقر على علامة الاختيار الأخضر لقبول هذه القيمة.
- إعداد مرفق إنتاج الخلايا لخلايا
- إذا لم تقم بذلك، وضبط غرف عازلة، وغرفة العمليات، وحاضنة لنقطة مجموعة الغاز المطلوبة لنوع من الخلايا يجري إدخالها.
- تنظيف السطح من غرفة عملية بشاش معقم ومطهر غير قابلة للاشتعال. لا تستخدم أي مطهر القائم على حمض البيروكسي، كما هو الحال في نظام مغلق القوي، الأبخرة العالقة سامة للخلايا الثدييات. بدلا من ذلك، استخدام المنتجات القائمة على كلوريد البنزالكونيوم.
- تواصل تطهير. تنظيف القفازات والأسطح التي هي commoنلي مسها، مثل مقابض الأبواب. استخدام مطهر تماما ولكن لماما، والسوائل الزائدة في غرفة عملية سيسهم في الرطوبة والتكاثف ونمو الجراثيم ممكن.
- تنظيف سطح غطاء تدفق الصفحي والعازلة غرفة مع 70٪ من الإيثانول، واتركه حتى يجف. ضع قارورة أو لوحة من الخلايا (في حالتنا، الأمنية الخاصة أو NSCs) في غطاء محرك السيارة، لفترة وجيزة مسح سطحه الخارجي مع اسفنجة شاش معقم مشبع الايثانول.
- ضع قارورة أو لوحة في غرفة عازلة، وتشغيل معامل التخفيف (الخطوة 1.2.3).
- عند الانتهاء من عامل التخفيف، ونقل على الفور قارورة أو لوحة إلى الحاضنة المناسبة. إلى محاضن هي في الجزء الخلفي من غرفة العملية، وسحب الرف للخروج الى غرفة عملية لوضع الخلية. تجنب فتح الأبواب الحاضنة دون داع أو لفترات طويلة من الزمن، والهواء للغرفة العملية وجاف للغاية مقارنة بما كان عليه من الحاضنات، وسيؤدي إلى أهميةفقدان الرطوبة في الحاضنة.
- تغذية الثقافات خلية
- جمع المكونات المتوسطة، الماصات المصلية، وهو pipettor الإلكترونية، شاش ومطهر. جمع أيضا حاوية النفايات لقضى خلية ثقافة المتوسط، ولكن لا ملء مع التبييض. جلب المواد الى غرفة العملية من خلال غرفة عازلة كما هو موضح في القسم 1.2. إعداد مستنبت الخلية في غرفة العملية، كما هو موضح سابقا 9،10 (انظر أيضا مواد الجدول)
- ترتيب المواد بطريقة تمكن مساحة العمل الأمثل. تجنب وضع البنود غير المستخدمة في مركز حجرة العملية.
- تسمح على المدى المتوسط لتتوازن مع مستويات CO 2 و O 2 الموجودة داخل النظام من خلال ترك الحاوية وسائل الإعلام لم يسبق لهم اللعب قليلا. وتشير بعض الشركات المصنعة المتوسطة PSC ليس لتسخين سائل الإعلام في 37 درجة مئوية. إذا كانت هذه هي الحالة، استخدم غرفة عازلة للتوازن على المدى المتوسط. السماح للليdium لكي تتوازن لمدة 20 دقيقة.
- إزالة المتوسطة القديمة من الآبار باستخدام ماصة stereological المناسبة وpipettor الإلكترونية. لشركات الأمن الخاصة، وإزالة كافة ولكن المبلغ المتبقي قليل من المتوسط القديم، بما يكفي لمنع جفاف أثناء عملية التغذية. لNSCs، وإزالة نصف المتوسط القديم. الماصة النفايات في حاوية النفايات.
- وضع ماصة استخدامها مرة أخرى في غلافه الأصلي ونقله إلى جانب غرفة العملية، أو في غرفة عازلة مخصصة لإزالة النفايات. مع ماصة المصلية العقيمة جديدة، إضافة متوسطة جديدة إلى الخلية لوحات ثقافة ووضع لوحات العودة إلى الحاضنة المحددة لها.
- في نهاية التغذية، رش الشاش مع مطهر وتنظيف الأرض ومقابض الأبواب من غرفة العملية بدقة. إذا كان هناك خطوط الخلايا متعددة تزرع في النظام، وتعقيم بين إطعام كل سطر الخلية. هذا يساعد على التقليل من خطر التلوث.
- عند الانتهاء، وإزالة النفاياتأو البنود غير الضرورية الأخرى من خلال إحدى الغرف العازلة.
3. الثقافات تقسيم الخلية
- الأنزيمية الركض من شركات الأمن الخاصة أو NSCs
- جمع كل العناصر اللازمة لالركض. وهذا يشمل وسائل الإعلام، الانزيم أو عازلة تفارق الخلية غير الأنزيمية (وهذا الأخير هو لNSCs فقط)، DPBS، لوحات أو قوارير، المصفوفة خارج الخلية (ECM)، أنابيب مخروطية، والماصات المصلية. جعلها النظام باستخدام غرفة عازلة.
- معطف لوحات جديدة أو قوارير مع ECM، كما هو موضح سابقا 9،10. بعض موبينيل -such مثل تلك المستمدة من خطوط الخلايا الماوس ساركوما - تكون سائلة فقط بين 4 و 15 درجة مئوية، لذلك تستخدم تعقيمها الباردة كتلة أو هلام الجليد حزمة للحفاظ على البرودة ECM بينما كان يعمل في غرفة عملية ساخنة.
- الماصة قبالة المتوسط أمضى من الثقافة والتخلص منها في حاوية النفايات.
- شطف جيدا أو قارورة السطح باستخدام 1 مل من DPBS / جيد والتخلص من DPBS.
- إضافة 1-2مل من انزيم الحار إلى كل بئر. لا يتطلب سوى الثقافات كثيفة جدا 2 مل.
- على الفور تحريك الطبق الثقافة أو قارورة إلى غرفة المجهر، ومراقبة ثقافة بعناية. لمشاهدة علامات الخلايا الفردية بداية لتخفيف خارج الطبق. لا تنتظر حتى تطفو الخلايا في تعليق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
- عودة الخلايا إلى غرفة العملية الرئيسية. باستخدام ماصة 5 مل المصلية، إضافة 4 مل من DPBS لكل 1 مل من انزيم، ثم الماصة بقوة صعودا وهبوطا لإزاحة الخلايا من السطح جيدا. إذا الركض آبار متعددة ضمن لوحة متعدد الطبقات، إضافة DPBS إلى كل بئر قبل طرد الخلايا من الآبار الفردية.
- نقل الانزيم وتعليق خلية برنامج تلفزيوني لأنبوب مخروطي بشكل مناسب الحجم.
- إذا كان الطرد المركزي ليست متاحة في منشأة لانتاج الخلية، وختم بإحكام أنبوب مخروطي الشكل، وضعه في غرفة عازلة وختم الباب مغلق.
- إزالة أنبوب مخروطي الشكل من BUFفر غرفة من الجانب تدفق الصفحي وتدور الخلايا في 100 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- رش أنبوب مخروطي مع 70٪ من الإيثانول، وجعله في غرفة عملية باستخدام غرفة عازلة وعامل التخفيف.
- الماصة قبالة طاف، و resuspend الخلايا في 2 مل من PSC أو مجلس الأمن القومي المتوسطة. إذا الركض الأمنية الخاصة، تأكد من تضمين المانع ROCK في المتوسط عند تركيز من 10 ميكرومتر، كما هو موضح سابقا 9،10.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وتحديد عدد الآبار أو لوحات المطلوبة. شركات الأمن الخاصة لوحة في 5 × 04-01 أكتوبر × 10 5 خلية / سم 2. تقسيم NSCs في نسبة 1: 2.
ملاحظة: NSCs غالبا ما تتجمع ومقاومة فرز دقيق في عدادة الكريات. - إذا كنت بحاجة الحفظ بالتبريد من الخلايا، اتبع البروتوكول المناسب 9،10، ولكن تأكد من أن يتم إعداد جميع اللوازم وتجميد وسائل الاعلام في وقت مبكر وضعت داخل غرفة العملية. DMSO شديد السمية بالنسبة للخلايا في 376؛ C، لذلك يعمل بسرعة جدا. إبقاء الحاويات تجميد-تغلف الأيسوبروبانول في RT في غطاء تدفق الصفحي. مرة واحدة يتم تعبئة قوارير الحفظ بالتبريد ومختومة، وعلى الفور بإزالة قارورة من غرفة العملية التي يمر بها من خلال غرفة عازلة.
- الركض اليدوي لشركات الأمن الخاصة
- تأكد من أن الثقافة يجب أن تكون passaged، كما هو موضح سابقا 8. إذا كان الأمر كذلك، وإعداد لوحات جديدة أو قوارير المغلفة مع المصفوفة خارج الخلية. ثم تغيير المتوسطة تماما.
- تنظيف غرفة المجهر بشاش معقم مبلل مع كمية تجنيب مطهر غير قابلة للاشتعال - أكثر من اللازم سيؤدي تعفير الزائد في الغرفة. فقط تنظيف القفازات، والمساحة الأرضية، ومرحلة. جلب العديد من 200 ميكرولتر أو 1000 ميكرولتر نصائح الماصة ملفوفة بشكل فردي في غرفة.
- تقديم لوحة من شركات الأمن الخاصة في غرفة المجهر، وإزالة الغطاء، ووضع وجهه لأسفل على الأرض تنظيفها حديثا. ترك الغطاء حتى يعرض دير السفليectly لتيارات الهواء، وتلوث محتمل.
- بسط طرف الماصة، واستخدام المجهر لتصور الثقافة، واختيار بصرف النظر المستعمرات التي مورفولوجيا جيد باستخدام غيض من الماصة.
ملاحظة: يمكن أن تعلق غيض الماصة للالماصة إذا وجد مستخدم فردي هذا أكثر راحة. - استبدال غطاء على لوحة، ونقل لوحة إلى غرفة العملية.
- الماصة قبالة ECM الزائدة من لوحة جديدة، ونقل وسائل الإعلام من لوحة القديمة (التي تحتوي على قطع مستعمرة في تعليق) لوحة جديدة. إذا كانت لوحة قديمة لا تزال تحتوي على المستعمرات التي ليست جاهزة ويمكن الحصول عليها، وإطعام أنها كذلك.
4. تقنيات الثقافة المتخصصة
- سينداي تنبيغ من الخلايا الليفية إلى شركات الأمن الخاصة
- داخل مصنع لإنتاج الخلايا، وتوسيع الخلايا الليفية الجلد البشري 1 في وسائل الإعلام الليفية التي تحتوي على DMEM / F12، و 10٪ FBS، و 20 نانوغرام / مل FGF2، في 5٪ O 2. استخدام 6 جيدا dishe الثقافةق المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪.
- إعداد الخلايا لتكون transduced التي كتبها النأي عليها مع 1 مل من 0.25٪ التربسين لكل بئر. إبطال نشاط التربسين مع المتوسط 1 مل الليفية. تدور في 200 x ج، resuspend الخلايا في 1 مل من المتوسط الخلايا الليفية، ويعول عليها باستخدام عدادة الكريات.
- و resuspend 2.0 × 10 5 الخلايا في 2 مل الخلايا الليفية المتوسطة، وإضافة تعليق الخلية إلى 1 بئر من 6 لوحة جيدا المغلفة الجيلاتين (2.1 × 10 4 خلية / سم 2). وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة.
- اسمحوا 24 ساعة للخلايا أن نعلق على الجزء السفلي من لوحة.
- ضع المتوسطة الليفية النقي داخل غرفة العمليات (1 مل من المتوسط لكل بئر من الخلايا لتكون transduced)، والسماح لها لكي تتوازن إلى الغازات.
- تعقيم كتلة البارد يبرد قبل مع 70٪ من الإيثانول ووضعه في غرفة عازلة. استخدام كيس من الثلج هلام مع الثقوب في قطع ذلك إذا كتلة الباردة التجاري غير متوفر.
ملاحظة: هناك 3-4 منفصل سيندايالفيروسات (اعتمادا على إصدار عدة التنبيغ)، والتي يجب إذابة بسرعة، لكنها أبقت في كتلة البارد إذابة مرة واحدة. - تراجع في النصف السفلي من الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 ثانية (لا تغرق الأنابيب)، ثم على الفور تنظيف الخارجيات أنبوب مع الايثانول 70٪. وضع أنابيب على الكتلة الباردة تعقيمها في الغرفة العازلة وتشغيل عامل التخفيف.
- العمل بسرعة، إضافة الحجم اللازم من كل فيروس برمجة سينداي الى المتوسط معايرتها 2. يتم تحديد هذا الحجم من قبل ثلاثة متغيرات - عدد الخلايا، وعيار من كل الفيروسات، وتعدد المطلوب من العدوى لكل الفيروس. راجع دليل عدة لوزارة الداخلية الموصى بها. الصيغة:
[(عدد الخلايا التي transfected) (تعدد العدوى) (1000)] / (عيار الفيروسية) = المطلوبة ميكرولتر من الفيروس - إزالة طاف من البئر (ق) من الخلايا لإعادة برمجتها. لكل بئر، إضافة 1 مل من ميديأم تحتوي على فيروسات. صخرة بلطف لوحة، والحرص على عدم تسرب سائل الإعلام، ووضع لوحة مرة أخرى في 5٪ O 2 الحاضنة.
- بعد 2 ساعة صخرة بلطف لوحة مرة أخرى وأكرر مرة أخرى بعد 2 ساعة أخرى.
- بعد 24 ساعة (يوم 1 بعد تنبيغ)، وإطعام جيدا مع 1 مل من المحفزة المتوسطة الخلايا الجذعية. كرر في يوم 2، ولكن لا تقم بإزالة المتوسطة من البئر.
- في أيام 3 و 4، تغيير نصف المتوسط.
- في يوم 5 وما بعدها، تغيير المتوسطة بأكمله.
- عندما تظهر المستعمرات، وصمة عار على الثقافة باستخدام أجسام مضادة عقيمة لتأكيد أن المستعمرات هي في الواقع المحفزة، كما هو موضح سابقا (2). كما هو الحال مع خلايا التغذية، وضمان أن وسائل الإعلام PSC التي تحتوي على الأجسام المضادة قد تم المتوازنة للغازات في منشأة لانتاج الخلية.
ملاحظة: في إعادة برمجة ناجحة، يجب أن تكون مستعمرات التوجيهية الحالية حوالي أسبوعين بعد تنبيغ 1. - عندما نمت المستعمرات كبيربما فيه الكفاية، واستخدام المجهر للاحتفال وميكانيكيا مرور لهم على لوحة المغلفة ECM، كما هو موضح في القسم 3.2.
- توسيع المستعمرات إما يدويا أو إنزيمي، كما هو موضح سابقا 9،10.
5. تنظيف بعد استخدام اليومي
- وضع جميع المواد من النفايات، بما في ذلك قارورة النفايات السائلة، في غرفة عازلة معقمة. مسح أسفل سطح غرفة المعالجة وجميع المناطق التي تأتي في اتصال بواسطة الامدادات مع شاش معقم ومطهر غير قابلة للاشتعال.
- إزالة جميع المواد النفايات الصلبة من الغرفة العازلة وتجاهل في حاوية النفايات المناسبة.
- التخلص من النفايات من السائل في وعاء النفايات المناسبة، أو لمجرد خلط مع مواد التبييض وتصب هباء. تنظيف حاوية النفايات مع الصابون وفرشاة. تعقيم الحاويات مع 70٪ من الإيثانول ونقله مرة أخرى إلى غرفة العملية عن طريق الغرفة العازلة.
ملاحظة: لا ينصح به لاستخدام التبييض فيحاوية النفايات بينما هو داخل النظام، وأبخرة التبييض قد تعيد توزيع ويضر مزارع الخلايا. - لاعتبارات النظافة، ويمسح أسفل سطح البلاستيك الأمامي من غرفة معالجة النظام مع 70٪ من الإيثانول. وهذا يساعد على تنظيف قبالة العرق والجلد الزيوت من جبهته المستخدم.
- إذا قامت ببناء التكثيف حتى داخل غرفة العملية، تشغيل عامل تخفيف لمسح التكثيف. سماح لا يقل عن 1 ساعة لهذا لإكمال.
6. المهام الروتينية غير اليومية
- تجديد الأطباق المياه في حاضنات ثقافة الخلية مع عقيم الماء المقطر، حسب الحاجة. أعلى قبالة الأطباق مرة واحدة على الأقل في الأسبوع. ومع ذلك، فإن معدل تبخر تتقلب على أساس عدد المرات التي فتح الأبواب حاضنة، وحجم السائل في الثقافات، وإعدادات الحاضنة.
- مرة واحدة في الشهر، إعادة ضبط إعدادات O 2 و CO 2 في جميع الدوائر. هذا يتطلب استخدام سبان (المعايرة) الغاز الذي تابعاهلية ت معروفة تركيزات مستويات O 2 و CO 2 كمعيار مرجعي. تأكد من أن هناك كاف امدادات الغاز سبان قبل بدء المعايرة. ويستخدم هذا النظام أجهزة الاستشعار الغاز محددة، وتقع في كل وحدة، للكشف عن تركيزات غازات. وبالتالي، فإن استخدام الغازات سبان جودة عالية يضمن أن أجهزة الاستشعار تسفر موثوق تركيزات غازات دقيقة.
- استبدال القفازات في غرفة العمليات وغرفة المجهر على أساس منتظم. استبدال قفازات كل 2 أشهر، بغض النظر عن عدد المرات التي يستخدم النظام. قبل التثبيت، تعقيم قفازات جديدة مع مطهر. تشغيل عامل التخفيف على الغرفة العملية بعد أن تم استبدال القفازات.
ملاحظة: عندما امتدت على مدى الأصفاد من النظام، قفازات النتريل لديهم ميل لتطوير الثقوب في المناطق المعرضة للإجهاد البدني والحرارة. وهذا أمر طبيعي وارتداء لا مفر منه والمسيل للدموع. - تغير من المرشحات المحاقن في جميع غرف كل 6 أشهر.
- استبدال أو غسل رانه prefilter على غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي بمجرد أن يبدأ في الظهور القذرة.
- الرجوع إلى وثائق الشركة المصنعة بانتظام للحصول على معلومات حول استبدال أجزاء رئيسية.
7. تنظيف النظام
- في حال حدث تلوث خطير يؤثر على الغالبية العظمى من مزارع الخلايا، نقل أي مزارع الخلايا على قيد الحياة خارج النظام، أو (إن أمكن) إلى حاضنة تتأثر.
- إيقاف التحكم في الغاز لجميع الدوائر باستثناء أن حاضنات تتأثر.
- إزالة اللوحة الأمامية مرنة للجهاز، وإزالة رفوف الفولاذ المقاوم للصدأ من المتأثرة حاضنة الثقافة الخلية. أيضا إزالة عموم المياه.
- الأوتوكلاف الرفوف الحاضنة وعموم المياه، ووضعها مرة أخرى في الحاضنة. مسح الأسطح الداخلية للحاضنة مع 70٪ من الإيثانول. السماح للإيثانول لتتبخر، وإغلاق الباب الحاضنة.
- مسح السطوح من غرفة العمليات والمجهر مع وآخرون 70٪hanol. استبدال اللوحة الأمامية للجهاز.
- مسح الأسطح الداخلية للجهاز، بما في ذلك من الحاضنة المتضررة، مع مطهر غير قابلة للاشتعال. ترك باب مفتوح حاضنة المتضررين، وتشغيل عامل التخفيف على غرفة العملية. تأكد من أبواب الغرفة المجهر مفتوحة أيضا.
- لتنظيف الروتيني للحاضنات ثقافة الخلية، وضمان أن الحاضنة وغرفة العملية هي في إعدادات الغلاف الجوي نفسه. فتح باب الحاضنة، وإخضاع كافة أطباق زراعة الخلايا على سطح غرفة العملية.
- مسح أسفل الرفوف الحاضنة والأسطح الداخلية مع مطهر غير قابلة للاشتعال. السماح للمطهر لتتبخر، ونقل الثقافات الخلية إلى الحاضنة. العمل بأسرع وقت ممكن لتجنب أصاب من مزارع الخلايا.
Representative Results
توضح هذه المخطوطة في بعض التفاصيل منشأة لانتاج الخلية، والجوانب الفريدة لزراعة الخلايا داخل نظام مغلق. الجزء الأكبر من منشأة لانتاج الخلية يتكون جهاز حسب الطلب، المغلقة، ثقافة الخليوي الذي لديه بصمة صغيرة، ويمكن أن يضم بسهولة ضمن 6 × 7.5 م 2 غرفة (الشكل 2). في أي وقت من الأوقات هي الخلايا داخل جهاز تتعرض لموظفي المختبر أو البيئة. يتكون الجهاز من عدة وحدات: غرفة العملية، غطاء تدفق الصفحي، 2 غرف التخزين المؤقت غرفة معادلة الضغط في فترة ما بين غطاء المحرك وغرفة العملية، وهما حاضنات ثقافة الخلية، وغرفة المجهر المجاورة لغرفة العمليات (الشكل 3). يتم التحكم في النظام عن طريق برنامج يسمح المتغيرات البيئية أن يكون للرقابة ومراقبة (الشكل 1). الكمبيوتر تشغيل هذا البرنامج على توفير إمدادات الطاقة غير المنقطعة. ويتم تغذية الغازات في النظام البريد من قبل مجموعة من الفتحات للالأوكسجين والنيتروجين وثاني أكسيد الكربون (الشكل 4). يتم تزويد الغازات للجهاز من قبل أنظمة المتعددة التي لديها مجموعتين من الدبابات كل - مجموعة نشطة ومجموعة الاحتياطي. عندما يتم رسمها مجموعة نشطة أسفل، مشعب مفاتيح تلقائيا إلى وضع الاحتياط والموظفين الدبابات طلب الاستبدال. انقطاع التيار الكهربائي في نظام مولد كهربائي احتياطي.
المحفزة والخلايا الجذعية العصبية يمكن زراعتها في ظروف نقص الأوكسجين في هذا المرفق باستخدام بروتوكولات التي سبق وضعها 9، مع مضاعفات وأضاف الملازمة لمعدات الرواية. يمكن استخلاص الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام فيروس سينداي، وذلك باستخدام الأجسام المضادة تعدد القدرات المحددة لتحديد المستعمرات transfected بالكامل، وبعد ذلك يتم عزل وتوسيع نطاقها. (الشكل 5A وباء)، من هذه iPSCs، والخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية يمكن استخلاصها باستخدام مزدوج تثبيط حدثت لوملامحهم التحقق باليود نانوغرام الأجسام المضادة NSC-محددة (الشكل 5C وD).
الشكل 1. واجهة رسومية لمرفق إنتاج الخلية. (أ) تمثيل رسومي للCPF هي الشاشة الافتراضية ويطابق CAD الرسم هو مبين في الشكل (3). وبنقرة من الفأرة على وحدة العازلة 1 (2F في الشكل 1) يفتح شاشة سيطرتها (B) حيث يتم تعيين O 2 القيم لتتناسب مع غرفة المعالجة (3 في الشكل 3). وبالمثل، والنقر على عملية غرفة أو حاضنة 1 إحضار شاشات مراقبة كل منها (C و D، على التوالي)، حيث يمكن تغيير القيم أو مراقبتها حسب الاقتضاء. r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مرفق إنتاج الخلية. (A) نظام كما يرى من وجهة نظر الأمامي الأيمن. لاحظ صلات الكهرباء والغاز في السقف وعربة مع الملحقات المجهر والكمبيوتر إلى اليمين. (ب) تدفق غطاء محرك السيارة الصفحي مع أبواب الوصول إلى وحدات عازلة ينظر في الحق. (C) وغرفة العملية مع اثنين من الحاضنات (الأبواب السوداء) ينظر في العمق. (D) وجهة نظر من خلال الجانب الأيمن من نظام تبين المجهر ومراقبة مع الأبواب إلى غرف عازلة ينظر في المسافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. رسم CAD مرفق إنتاج الخلية. يتم محو جميع العناصر التي تدخل الجهاز أولا إلى أسفل مع الكحول والهواء المجفف في غطاء تدفق الصفحي (1). ثم انتقلت المواد في الغلاف الجوي المناسب في وحدة عازلة الأمامية (2F) قبل أن تنتقل إلى وحدة UCPC، أو عملية الغرفة (3). الخلايا المستزرعة في اثنين من الحاضنات (4، 5). تلطيخ الخلية الحية، مستعمرة قطف، وتقييم التشكل الخلوي العام وتحليل الهجرة تجري في وحدة اتحاد الوطنيين الكونغوليين، أو غرفة مجهر (6). وأخيرا، والنفايات يخرج النظام من خلال وحدة عازلة الخلفي (2R). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. < / P>
الشكل 4. مصادر الغازات والطاقة. (A) ومشعب CO 2 هو الإعداد 4 × 4، حيث أنها تورد جميع حاضنات للمختبر. (ب) المتعددة O 2 هو الإعداد واللوازم فقط منشأة لانتاج الخلايا 2 × 2. يتم إنشاء النيتروجين للنظام في المرذاذ (C، أقل بقليل من علامة خروج) تعلق على مشعب النيتروجين السائل (إلى اليمين) التي أيضا يملأ تلقائيا cryofreezers (أسفل اليسار). مشعب هو الإعداد 2 × 2 يتم توريدها من قبل اثنين من أزواج من 160 L الدبابات النيتروجين السائل. يتم تزويد CO 2، O 2، وN 2 من السقف من خلال shutoffs (D). يتم توفير فراغ المنزل أيضا في هذا الموقع. رأيت للتو وراء shutoffs إمدادات الغاز هي زوج من الكابلات الكهربائية التي توفر الطاقة للنظام.و = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة في نقص الأكسجة مع فيروس سينداي. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (التسميات الموجودة في ستوفر وآخرون. 9)، النقيض من المرحلة 10X. (ب) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs الملون يعيش مع-594 المسمى AF ترا-1-60، 1: 100 التخفيف في وسائل الإعلام. تم transduced كل iPSCs في منشأة لانتاج خلية في 5٪ O 2 مع فيروس سينداي. (C) على النقيض المرحلة من NSCs-UH0-2I0-M0S13-N2G6 SC68.1 IPSC المشتقة، ونمت بنسبة 5٪ O 2 في الشرائح غرفة. ثم تم إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق وملطخة الأجسام المضادة الأولية Nestin مكافحة الإنسان، وأليكس-488 الضد الثانوية. جميع الحانات على نطاق وفي 1001؛ م الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
الخلايا المزروعة داخل CPF ترى أي تغييرات في الأكسجين أو ثاني أكسيد الكربون تركيزات لأنها تتحرك من الحاضنة لتجهيز غرفة إلى غرفة المجهر والظهر. ومن الأهمية بمكان أن الظروف في كل غرفة تتم مطابقة إلى الحاضنة الخاصة التي يتم الاحتفاظ الخلايا قبل أن يتم إزالة الخلايا من الحاضنة. الجو داخل الجهاز بشكل مستمر HEPA تصفية وتخصيص فيما يتعلق تركيزات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون. يمكن زراعتها الخلايا بتركيزات موحدة لشركات الأمن الخاصة أو NSCs، 5٪ و 9٪ على التوالي. أو تركيزات بديلة يمكن اختيار لأنواع مختلفة من الخلايا أو لتجارب محددة. وبالتالي، يتم تزويد الجهاز مع مصادر ثابتة من الأكسجين الصف الطبية، وثاني أكسيد الكربون، والنيتروجين (الشكل 4). يتم تزويد كل ثلاثة من هذه الغازات من خلال أنظمة متعددة الغاز محدد ضمان امدادات ثابتة. ويتم تزويد الجهاز أيضا مع خليط الغاز المعايرة تتكون من10٪ (± 0.01٪) غاز ثاني أكسيد الكربون في الأكسجين. ويضم أنظمة متعددة خارج منشأة لانتاج الخلية ويتم إيصالها الغازات في منشأة من خلال السقف. وتقع الغاز المعايرة داخل المنشأة. يتم تزويد الجهاز بالإضافة إلى ذلك مع فراغ المنزل، وأيضا من خلال السقف. باستخدام نظام المراقبة الإلكترونية واللاسلكية وحدة الإرسال، يتم مراقبة باستمرار الضغوط إخراج جميع الفتحات. في حال أن يقع أي ضغط خارج النطاق، واتصل هاتفيا مشغلي منشأة لانتاج الخلايا تلقائيا وأخطرت هذه أن التدابير الملائمة يمكن أن تؤخذ.
تلبية متطلبات الطاقة للجهاز لمدة ستة مخصصة 120 V الدوائر تنازلي من السقف وتوصيل مولدات احتياطية في المستشفى لضمان امدادات ثابتة. يتم التحكم في تشغيل الجهاز عن طريق برنامج على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام الكمبيوتر بالطاقة من خلال توفير إمدادات الطاقة غير المنقطعة. هذه الترتيبات الكهرباء والكمبيوترتأكد من أن وظائف النظام بشكل مستمر حتى في حالة حدوث فشل نظام السلطة العامة. برنامج السيطرة على جهاز يحتوي على واجهة رسومية سهلة الاستخدام (الشكل 1)، التي تتيح للتحكم في تركيز الأكسجين وثاني أكسيد الكربون وكذلك الضغوط درجة الحرارة، والرطوبة، والغرفة. وسجلت قيم كل هذه المعايير بشكل مستمر لتوفير سجل تشغيل جميع المعلمات الجهاز. ويدعم هذه البيانات حتى على خادم بعيد كل ليلة لحماية سلامتها. يمكن الوصول إلى جهاز الكمبيوتر والبرامج عن بعد من قبل المستخدمين الإدارية لتقييم و / أو تغيير أي معلمة. بالإضافة إلى ذلك، الكمبيوتر والبرمجيات ويمكن الوصول عن بعد، مما يتيح تقييم تفاعلية من المعلمات أجهزة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها مع المستخدمين المحليين. يتم توصيل وحدة وإرسال إنذار إضافية للجهاز بحيث يتم إخطار مشغلي منشأة لانتاج الخلية من أي حالة خارج نطاق الجهاز. الوصول عن بعد جapabilities سماح تسجيل الدخول وتقييم خصوصيات حالة خارج النطاق.
تم تصميم الجهاز كنظام وحدات في كل من ماكرو والشعور الجزئي. وحدات زراعة الخلايا الفردية، مثل الحاضنات وغرف المعالجة، يمكن تخصيص فيما يتعلق أبعاد ومتطلباتها وكذلك في التخطيط مع الاحترام لبعضهما البعض. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم وظائف السيطرة على وحدات فردية هي في حد ذاتها وحدات مثل التي تحكم الغاز في الغلاف الجوي الفردية، على سبيل المثال، يمكن الاستعاضة عنها بسهولة دون اضطراب كبير في النظام.
غرف المعالجة المتخصصة، مثل واحد لرؤية المجهري والتلاعب في مزارع الخلايا، يتم تكييفها بسهولة إلى النظام. كلا على النقيض من المرحلة ومضان المجهر هي داخل النظام (الشكل 6) بحيث الخلايا يمكن أن تكون ملطخة على الهواء مباشرة، والمستعمرات يمكن تشريح في الظروف الجوية نفسها كما في الداخل رانه الحاضنات. التوجيه من الكابلات من خلال الحلقات أغلقت في الجدران الجانبية من غرفة معالجة يسمح المعدات مثل امدادات الكهرباء وأجهزة الكمبيوتر أن تبقى خارج الجهاز، وعادة على عربة (الشكل 6).
غرف المعالجة في منشأة لانتاج الخلايا لديها نمط تدفق الهواء مختلفة من BSCs التقليدية. في BSCs التقليدية، يتدفق تدفق الهواء إلى أسفل من فتحة العادم المركزي وانشقاقات في مسارين منفصلين، والتي يتم تناولها من قبل اثنين من فتحات كمية مختلفة في الجزء الأمام والخلف من الطابق مجلس الوزراء. على النقيض من ذلك، فإن CPF ديه تنفيس واحدة في الجزء الأمامي من السقف. تدفق الهواء إلى الأسفل ونحو الجزء الخلفي من الغرفة، حيث ثم فإنه يتم رسمها صعودا إلى تنفيس المدخول. على الرغم من أن هذه الشراكة هي بطبيعتها نظيفة جدا، وهذا نمط تدفق الهواء فريد من نوعه يعني أن الفنيين لديها لضبط قليلا تقنيتهم للحد من مخاطر التلوث. كما هو الحال مع ش.م.ب التقليدية، مختبر عامل الصورةhould معها تجنب وضع أيديهم المنبع لوحات ثقافة الخلية المفتوحة وزجاجات وسائل الإعلام. ومع ذلك، تم تغيير الاتجاه الذي هو المنبع في CPF
مرفق إنتاج خلايا المختبر نفسه هو المعيار إلى حد ما، وتأتي مجهزة الثلاجة -20 درجة مئوية، والمجمد -80 درجة مئوية، 4 ° C ثلاجة، جهاز للطرد المركزي، وحمام الماء. ويضم المختبر أيضا بالوعة مع الضوابط القدم للتشغيل حر اليدين مريحة. من أجل هذا المختبر لتصبح السريري منشأة لانتاج خلايا وظيفية، ومع ذلك، لا يزال يتعين إجراء عدة تعديلات إضافية. أولا، الجهاز نفسه يجب أن تتم ترقية لديك القدرة على رصد المركبات العضوية المتطايرة، والجسيمات، وتركيزات ثاني أكسيد الكلور الذي يستخدم لإزالة التلوث. ثانيا، وغرفة معالجة تحتوي على آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية قد يكون مقر وتوصيلها إلى بقية الجهاز عن طريق وحدة العازلة. وهذا سوف يسمح لفرز الخلايا وتنقية آرالسكان الخلية ansplantable تحت الظروف البيئية المناسبة. وأخيرا، يجب أن يضم الجهاز بأكمله داخل غرفة نظيفة الجدار لينة. وهذا يوفر المنظمة الدولية للتوحيد القياسي فئة (ISO) 8 البيئة للجهاز 5.
عقم عالية وطبيعة الكمبيوتر التي تسيطر عليها من CPF يجعل من نظام مثالي للتطبيقات المستقبلية مع العلاج القائم على الخلايا والعمليات التصنيعية الجيدة. والتخفيف من مخاطر التلوث إلى حد كبير، ولكن الأهم من ذلك أن شروط توسيع الخلية يتم تسجيلها تلقائيا، وتحفظ من قبل نظام الكمبيوتر. موثقة الانحرافات في تركيزات غازات، ودرجة الحرارة، والرطوبة، وجميع الأحداث من الوصول إلى نظام صارم. هذا يمكن أن يساعد كثيرا عند التحقيق في مشاكل جودة المنتج. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود. استخدام أي وجميع الكواشف واللوازم (على سبيل المثال، مكونات وسائل الإعلام، الماصات، لوحات) يجب أن تكون موثقة بشكل منفصل. إضافةitionally، هناك العديد من المشاكل المحتملة (بما في ذلك العديد من أشكال الخطأ البشري) التي يمكن أن تنشأ والتي لا علاقة لها تماما لمتغيرات موثقة من قبل نظام مراقبة هذه الشراكة ل. وهكذا، فإن الحاجة إلى الموظفين المدربين تدريبا عاليا وثائق اليدوية مفصلة من المهام لا يزال في مكانه.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف الموظفين في Biospherix لمساعدتهم في تعلم استخدام نظام زراعة الخلايا Xvivo المغلقة، خصوصا مات فريمان. موظفي الشركة مايلز آند كيلي البناء، وشركة لعملهم في إنشاء البنية الأساسية للمختبرات، وخاصة روس هيوز. موظفو مستشفى الأطفال في دائرة مقاطعة أورانج من المرافق والخدمات المساندة لعملهم في تنسيق إعادة تشكيلها مختبر، خصوصا آدم Lukhard وديفين Hugie. موظفو مستشفى الأطفال في دائرة مقاطعة أورانج نظم المعلومات لمساعدتهم في إنشاء البنية التحتية لإدارة البيانات والوصول عن بعد، وخاصة تران نام؛ مستشفى الأطفال في مقاطعة أورانج فريق الإدارة التنفيذية للحصول على دعم طويل الأمد على المشروع، وخاصة الدكتورة ماريا Minon وبرنت Dethlefs. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مستشفى الأطفال في مقاطعة أورانج، ومعهد كاليفورنيا للالتجدد الطبه من خلال TR3-05476 منحة لخدمات الصحة العمومية. وساهمت جميع المؤلفين بالتساوي على هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
