Protocol
1. Ersteinrichtung
- Einstellen Gas- und Temperatur Konzentrationen
- Mit Hilfe der Software finden Sie im "Gast" Reiter auf der oberen linken Ecke der grafischen Oberfläche. Melden Sie sich bei dem System einen bestimmten Benutzernamen und Passwort. Stellen Sie sicher, dass jeder Benutzer ihre eigenen Benutzernamen und ein Passwort hat.
- Klicken Sie auf ein Modul einzustellen (Abbildung 1). Im neuen Fenster werden die aktuellen Einstellungen angezeigt wird , klicken Sie auf den vorhandenen O 2 Sollwert unter "Sollwert" und geben Sie die gewünschte O 2 -Konzentration Ebene für dieses Modul. Geben Sie 5% O 2 , wenn pluripotenten Stammzellen wird in diesem Modul angebaut oder manipuliert werden, und 9% O 2 , wenn neuralen Stammzellen aufgewachsen oder manipuliert werden. Klicken Sie auf das grüne Häkchen, um den Sollwert bestätigen.
Hinweis: Zwei Module sind nicht gas einstellbar: die laminare Haube, und das Mikroskop Kammer. Die Gaskonzentrationen in der Laminar-Flow-Haube sind atmosphärische while die in der Mikroskopkammer werden durch die Gaskonzentration in der Prozesskammer passiv gehalten. - Wiederholen Sie diesen Schritt für CO 2 einen Sollwert von 5% CO 2 für alle Module mit Ausnahme der Pufferkammern eingeben, die nur einstellbar sind O 2.
- Überwachen Sie die aktuellen Gaskonzentrationen, die als "Prozesswerte" bezeichnet werden, um sicherzustellen, dass sie die neuen Sollwerte erreichen.
- Stellen Sie die Gassollwerte aller Module auf die entsprechenden Werte. Ordnen Sie die CO 2 und O 2 Ebenen von Kammern, die miteinander ausgesetzt werden. Beispielsweise einstellen zu 5% O 2 vor dem Öffnen einen Inkubator , die Zellen mit 5% O 2 auch anpassen , um 5% O 2 jeder Pufferkammer , die verwendet wird zum Hinzufügen von Elementen zu der Prozesskammer während dieser Zeit wächst der Prozesskammer.
- Stellen Sie die Temperatur der Prozesskammer auf 37 ° C den gleichen Bildschirm für Gas Anpassungen verwenden. Auch stellen Sie die Prozesskammer floor Temperatur auf 37 ° C.
- Klicken Sie auf die Inkubation Modulbänke unter jedem Inkubator. Die Temperatur der Banken auf 37 ° C.
- Der Betrieb von Pufferkammern
- Sammeln Sie alle Lieferungen für die gegebene Aufgabe erforderlich (Fütterung, Splitting, Färbung, etc.) zu Beginn einer Verzögerung bei der Arbeitsablauf zu verhindern. Liberally sprühen alle Materialien mit 70% Ethanol und lassen sie in der laminaren Abzugshaube trocknen. Sprühen Sie keine Flaschen oder Platten von Zellen - wischen Sie sie vorsichtig mit einer sterilen Gaze Schwamm mit 70% Ethanol gesättigt.
- Achten Sie darauf, sowohl die äußeren und inneren Türen der Pufferkammer fest geschlossen sind. Dann öffnen Sie die Tür nach draußen, und legen Sie die inneren Elemente.
- Schließen Sie die äußere Tür. Innerhalb der Software, wählen Sie den Puffermodul, und klicken Sie auf den Verdünnungsfaktor Registerkarte. Geben Sie 1 in die Log-Faktor-Box. Klicken Sie auf Start.
Hinweis: Ein "Verdünnungsfaktor" ist so definiert, bedeuten, dass die Atmosphäre des Puffermodulevakuiert werden und ersetzt 1 Mal mit sauberem, HEPA-gefilterte Gas. - Sobald die grafische Oberfläche "Verdünnungsfaktor" zu blinken aufgehört, öffnen Sie die innere Tür der Pufferkammer und bringen die Materialien innerhalb der Prozesskammer.
Achtung: Nicht in die inneren und äußeren Türen zu immer zur gleichen Zeit geöffnet sein und öffnen Sie nicht die innere Tür, wenn die Pufferkammer einen Verdünnungsfaktor nicht unterzogen wurde. - Um Artikel aus der Prozesskammer zu entfernen, stellen Sie zunächst sicher, dass die Pufferkammer mit einem Verdünnungsfaktor unterzogen wurde. Dann öffnen Sie die innere Tür, legen Sie die Elemente im Inneren entfernt werden, und schließen Sie die innere Tür. Öffnen Sie dann die Außentür und die Elemente zu entfernen.
Hinweis: Ein Verdünnungsfaktor nicht vor dem Öffnen der Außentür ausgeführt werden muss.
2. Einführung und Füttern Zellen
- Incubator-Setup
- Platz 3 Petrischalen in der Wasserwanne an der Basis jedes Inkubator. Füllen Sie diese Gerichte mit Sterile Wasser. Nicht direkt die Wasserwanne zu füllen. Pflegen Sie den Wasserstand in diesen Gerichten, da sie die relative Feuchtigkeit (RH) Sollwert für die Aufrechterhaltung der in den Inkubatoren kritisch sind.
- Innerhalb der grafischen Benutzeroberfläche, klicken Sie auf den Inkubator. Klicken Sie auf den vorhandenen Wert für die relative Feuchte (RH) unter Sollwert und 85% eingeben. Klicken Sie auf das grüne Häkchen, um diesen Wert zu übernehmen.
- Herstellung der Zellproduktionsanlage für Zellen
- Wenn nicht bereits geschehen, stellen Sie die Pufferkammern, die Prozesskammer und einen Inkubator zu den Punkten Gassatz für die Art der Zelle erforderlich eingeführt werden.
- Reinigen Sie die Oberfläche der Prozesskammer mit steriler Gaze und einem nicht brennbaren Desinfektionsmittel. Verwenden Sie keine Peressigsäure-Desinfektionsmittel zu verwenden, wie in einem geschlossenen System die Starken, sind verweilenden Dämpfe giftig für Säugerzellen. Verwenden Sie stattdessen Benzalkoniumchlorid-basierten Produkten.
- Weiter zu desinfizieren. Reinigen Sie die Handschuhe und Oberflächen, die Commo sindnly berührt, wie Türgriffe. Verwenden Sie das Desinfektionsmittel gründlich, aber sparsam, da die überschüssige Flüssigkeit in der Prozesskammer Feuchtigkeit, Kondensation und mögliche mikrobielle Wachstum beitragen wird.
- Reinigen Sie die Oberfläche des Laminarströmungsabzug und Pufferkammer mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Der Kolben oder Platte von Zellen (in unserem Fall, PSCs oder NSCs) in der Haube, und kurz wischen seiner Außenfläche mit einem sterilen Gazeschwamm mit Ethanol gesättigt.
- Setzen Sie den Kolben oder die Platte in der Pufferkammer und ein Verdünnungsfaktor ausgeführt (Schritt 1.2.3).
- Nach Abschluss des Verdünnungsfaktors, sofort den Kolben zu bewegen oder in die entsprechende Inkubator plattieren. Da die Inkubatoren auf der Rückseite der Bearbeitungskammer sind, ein Regal in die Prozesskammer für Zellplazierungs ziehen. Vermeiden Sie die Inkubator Türen unnötig oder für längere Zeit geöffnet wird, wie die Luft, die Prozesskammer sehr trocken ist im Vergleich zu derjenigen der Inkubatoren, und führt zu einer erheblichenVerlust von Feuchtigkeit in den Inkubator.
- Füttern Zellkulturen
- Sammeln Mittelkomponenten, serologischen Pipetten, eine elektronische Pipette, Gaze und Desinfektionsmittel. Auch sammeln für verbrauchte Zellkulturmedium einen Abfallbehälter, aber füllen Sie es nicht mit Bleichmittel. Bringen Sie die Materialien in den Prozessraum durch eine Pufferkammer, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. Bereiten Zellkulturmedium in der Prozesskammer, wie zuvor beschrieben , 9,10 (siehe auch Tabelle Materials)
- Anordnen Materialien in einer solchen Weise eine optimale Arbeitsraum zu ermöglichen. Vermeiden Sie Gegenstände nicht in der Mitte der Prozesskammer verwendet wird.
- Lassen Sie das Medium mit den CO 2 und O 2 Ebenen , die innerhalb des Systems , indem man den Medienbehälter leicht uncapped äquilibrieren. Einige PSC Medium Hersteller geben nicht Medien zu erwärmen bei 37 ° C; Wenn dies der Fall ist, verwenden, um eine Pufferkammer, das Medium zu äquilibrieren. Lassen Sie die mirdium für 20 Minuten zu äquilibrieren.
- Entfernen Sie das alte Medium aus Brunnen eine geeignete stereo Pipette und eine elektronische Pipette verwenden. Für PSCs, entfernen alle außer einer kleinen Restmenge des alten Mediums, genug Desikkation während der Fütterungsprozeß zu verhindern. Für NSCs, die Hälfte des alten Mediums zu entfernen. Pipettieren der Abfall in den Abfallbehälter.
- Legen Sie die verbrauchte Pipette wieder in der Originalverpackung auf und verschieben Sie sie auf der Seite der Prozesskammer oder in eine Pufferkammer für Abfallbeseitigung bezeichnet. Mit einem frischen sterilen serologischen Pipette, fügen Sie frisches Medium Kulturplatten zur Zelle und die Platten wieder in den dafür vorgesehenen Inkubator stellen.
- Am Ende der Fütterung, sprühen Gaze mit Desinfektionsmittel und reinigen Sie die Boden und Türgriffe der Prozesskammer gründlich. Wenn mehrere Zelllinien sind in das System angebaut ist, in sterilisieren zwischen jeder Zelllinie speist. Dies hilft, das Risiko einer Kreuzkontamination zu minimieren.
- Nach der Fertigstellung entfernen Abfalloder andere nicht benötigte Elemente durch eine der Pufferkammern.
3. Splitting Zellkulturen
- Die enzymatische Passagierung von PSCs oder NSCs
- Sammeln Sie alle Gegenstände für Passagierbarkeit benötigt. Dazu gehören Medien, Enzym oder nichtenzymatische Zelldissoziationspuffer (letzterer ist NSC only), DPBS, Platten oder Flaschen, extrazelluläre Matrix (ECM), konische Röhrchen und serologische Pipetten. Bringt sie in das System einen Pufferkammer mit.
- Mantel frische Platten oder Flaschen mit ECM, wie zuvor beschrieben , 9,10. Einige ECMs -such wie jene, die von Maus-Sarkom-Zelllinien - sind nur Flüssigkeit zwischen 4 und 15 ° C, so verwenden Sie einen sterilisierten kalten Block oder Gel Eisbeutel das ECM kalt zu halten, während Sie im beheizten Prozesskammer arbeiten.
- Pipettieren aus dem verbrauchten Medium aus der Kultur und entsorgen Sie es in den Abfallbehälter.
- Spülen Sie das gut oder Flaschenoberfläche unter Verwendung von 1 ml DPBS / Vertiefung und entsorgen Sie die DPBS.
- In 1 bis 2ml warmem Enzyms in jede Kammer. Nur sehr dichte Kulturen erfordern 2 ml.
- bewegen Sie sofort die Kulturschale oder Kolben mit dem Mikroskop Kammer und sorgfältig beobachten, um die Kultur. Achten Sie auf Anzeichen von einzelnen Zellen beginnen, die Schale zu lösen ab. Warten Sie nicht, bis die Zellen in Suspension schwimmen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Bringen Sie die Zellen an die Hauptverfahrenskammer. Unter Verwendung einer 5 ml serologische Pipette 4 ml DPBS für jeweils 1 ml Enzym und dann pipettieren bis kräftig und unten um die Zellen von der Bohrlochoberfläche zu entfernen. Wenn mehrere Brunnen in einem mehrwandigen Platte Passagierung, fügen Sie die DPBS in jede Vertiefung, bevor die Zellen aus den einzelnen Vertiefungen Verdrängen.
- Übertragen Sie das Enzym und PBS Zellsuspension auf eine ausreichend große konische Röhrchen.
- Wenn eine Zentrifuge in der Zelle Produktionsanlage nicht verfügbar ist, luftdicht verschließen die konische Röhrchen, legen Sie sie in einer Pufferkammer und versiegeln die Tür geschlossen.
- Entfernen Sie die konische Röhrchen aus dem buffer Kammer von der Seite laminare Strömung und spin die Zellen bei 100 · g für 5 min bei RT.
- Sprühen der konischen Röhrchen mit 70% Ethanol, und bringen sie in die Prozesskammer eine Pufferkammer und Verdünnungsfaktor verwendet.
- Pipette aus dem Überstand und die Zellen in 2 ml PSC oder NSC Medium resuspendieren. Wenn PSCs Passagierung, stellen Sie sicher , ROCK - Inhibitor in dem Medium bei einer Konzentration von 10 & mgr; M zu umfassen, wie zuvor beschrieben 9,10.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bestimmen die Anzahl von Vertiefungen oder Platten erforderlich. Platte PSCs bei 5 x 04 bis 1 Oktober x 10 5 Zellen / cm 2. Spalten die NSC bei einem 1: 2-Verhältnis.
Hinweis: NSCs oft verklumpen und genaue Zählung in einem Hämocytometer widerstehen. - Wenn die Kryokonservierung der Zellen erforderlich ist, folgen Sie das entsprechende Protokoll 9,10, aber dafür sorgen , dass alle Lieferungen und gefrierenden Medien werden im Voraus vorbereitet und innerhalb der Prozesskammer angeordnet. DMSO ist sehr giftig für Zellen bei 376; C, so sehr schnell arbeiten. Halten Sie das Isopropanol-ummantelten Gefrierbehälter bei RT in der Laminar-Flow-Haube. Sobald die Kryokonservierung Fläschchen gefüllt und versiegelt werden, entfernen Sie sofort die Fläschchen aus der Prozesskammer, indem sie durch eine Pufferkammer vorbei.
- Manuelle Passagierung von PSCs
- Bestätigen , dass die Kultur passagiert werden muss, wie dies zuvor 8 beschrieben. Wenn ja, bereiten frische Platten oder mit extrazellulären Matrix beschichtet Kolben. Dann ganz das Medium ändern.
- Reinigen Sie das Mikroskop Kammer mit steriler Gaze angefeuchtet mit einer geringe Menge nicht brennbares Desinfektionsmittel - zu viel wird über das Beschlagen in der Kammer zur Folge haben. Reinigen Sie nur die Handschuhe, Bodenfläche und Bühne. Bringen Sie mehrere 200 & mgr; l oder 1000 ul einzeln verpackt Pipettenspitzen in die Kammer.
- Bringen Sie die Platte von PSCs in den Mikroskopkammer, entfernen Sie den Deckel und legen Sie es auf der frisch gereinigten Boden nach unten zeigen. den Deckel nach oben verlassen macht die Unterseite direkt zu Luftströmungen und zur potentiellen Verschmutzung.
- Packen Sie eine Pipettenspitze, und mit dem Mikroskop, um die Kultur zu visualisieren, zu Kolonien auseinander nehmen, die gute Morphologie haben die Spitze der Pipette.
Hinweis: Die Pipettenspitze an einer Pipette angebracht werden kann, wenn die einzelnen Benutzer diese bequemer findet. - Setzen Sie den Deckel auf die Platte, und bewegen Sie die Platte zurück in die Prozesskammer.
- Pipettieren Sie überschüssiges ECM von der neuen Platte, und übertragen Sie die Medien von der alten Platte auf die neue Platte (die Kolonie Stücke in Suspension enthält). Wenn die alte Platte Kolonien noch enthält, die nicht bereit sind, ausgewählt werden, füttern sie auch.
4. Fachkulturtechniken
- Sendai Transduction von Fibroblasten in PSCs
- Innerhalb der Zelle Produktionsanlage, erweitern menschlichen Hautfibroblasten 1 in Fibroblasten - Medium , enthaltend DMEM / F12, 10% FBS und 20 ng / ml FGF2, bei 5% O 2. Verwenden Sie 6-Well-Kultur dishes mit 0,1% Gelatine beschichtet.
- Bereiten Sie die Zellen durch Dissoziieren sie mit 1 ml 0,25% Trypsin transduziert werden pro Vertiefung. Inactivate um das Trypsin mit 1 ml Fibroblasten-Medium. Spin bei 200 · g, Resuspendieren der Zellen in 1 ml Fibroblasten-Medium, und zähle sie eine Zählkammer.
- Resuspendieren 2,0 x 10 5 Zellen in 2 ml Fibroblasten - Medium, und in den 1 und einer Gelatine beschichteten 6 - Well - Platte (2,1 x 10 4 Zellen / cm 2) , um die Zellsuspension. Legen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
- Erlauben Sie 24 h für die Zellen an der Unterseite der Platte zu befestigen.
- Platzieren frisches Medium Fibroblasten innerhalb der Prozesskammer (1 ml Medium pro Vertiefung von Zellen transduziert werden), und ermöglichen es den Gasen zu äquilibrieren.
- Sterilisieren einer vorgekühlten Kühlblock mit 70% Ethanol und legen Sie sie in einer Pufferkammer. Verwenden Sie ein Gel Eisbeutel mit Löchern darin schneiden, wenn eine kommerzielle Kälte Block nicht vorhanden ist.
Hinweis: Es gibt 3 bis 4 getrennte SendaiViren (abhängig von der Version der Transduktion kit), der schnell aufgetaut werden müssen, sondern in dem kalten Block einmal aufgetaut gehalten. - Tauchen Sie die untere Hälfte der Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 sec (Versenken Sie die Rohre), dann sofort reinigen Sie die Rohraußen mit 70% Ethanol. Die Röhrchen auf dem sterilisierten kalten Block in der Pufferkammer und einen Verdünnungsfaktor ausgeführt werden.
- Schnell arbeiten, fügen Sie das notwendige Volumen jedes Sendai Umprogrammierung Virus auf das ins Gleichgewicht gebracht Medium 2. Dieses Volumen wird durch drei Variablen bestimmt - die Anzahl der Zellen, der Titer jedes Virus, und die gewünschte Multiplizität der Infektion für jeden Virus. Lesen Sie die Kit-Handbuch empfohlen MOI. Die Formel lautet:
[(Anzahl der Zellen transfiziert werden) (Multiplizität der Infektion) (1000)] / (Virustiter) = erforderliche ul Virus - Entfernen Sie den Überstand aus der Wanne (n) von Zellen reprogrammiert werden. Für jede Vertiefung, 1 ml der medium mit den Viren. Schütteln Sie die Platte, wobei darauf geachtet , keine Medien zu vergießen, und legen Sie die Platte wieder in den 5% O 2 Inkubator.
- Nach 2 Stunden Rock sanft die Platte wieder und wiederholen Sie nach weiteren 2 Stunden.
- Nach 24 Stunden (Tag 1 nach der Transduktion), füttern die gut mit 1 ml pluripotente Stammzellmedium. Wiederholen Sie am Tag 2, aber nicht entfernen Medium aus dem Brunnen.
- An den Tagen 3 und 4, die Hälfte des Mediums verändern.
- Am Tag 5 und darüber hinaus das gesamte Medium ändern.
- Wenn Kolonien erscheinen, färben die Kultur steril unter Verwendung von Antikörpern , um zu bestätigen , dass die Kolonien tatsächlich pluripotent sind, wie zuvor beschrieben 2. Wie bei Fütterung Zellen, sicherzustellen, dass die PSC Medien, die Antikörper enthält, wurde auf die Gase in der Zellproduktionsanlage ins Gleichgewicht gebracht worden.
Hinweis: In einer erfolgreichen Reprogrammierung iPSC Kolonien sollten alle etwa zwei Wochen nach der Transduktion 1 sein. - Wann haben die Kolonien groß gewordengenug, verwenden Sie das Mikroskop und mechanisch Passage sie auf einem ECM-beschichtete Platte zu markieren, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben.
- Erweitern Sie die Kolonien entweder manuell oder enzymatisch, wie zuvor beschrieben 9,10.
5. Aufräumen nach den täglichen Gebrauch
- Legen Sie alle Abfälle, einschließlich der flüssigen Abfallflasche, in eine sterile Pufferkammer. Wischen der Oberfläche der Prozesskammer nach unten und alle Bereiche, die durch Lieferungen mit steriler Gaze und nicht brennbaren Desinfektionsmittel in Kontakt gekommen sind.
- Entfernen Sie alle festen Abfallmaterialien aus der Pufferkammer und entsorgen Sie in den entsprechenden Abfallbehälter.
- Entsorgen flüssige Abfälle in einen geeigneten Abfallbehälter oder einfach mit Bleichmittel mischen und den Abfluss schütten. Reinigen Sie den Abfallbehälter mit Seife und einer Bürste. Sterilisieren Sie den Behälter mit 70% Ethanol und verschieben Sie es zurück in die Prozesskammer über eine Pufferkammer.
Hinweis: Es ist nicht zu bleichen empfohlen inder Abfallbehälter während es im Inneren des Systems, als Bleich Dämpfe umwälzen können und Zellkulturen schädigen. - Aus hygienischen Überlegungen, wischen Sie die vordere Kunststoffoberfläche der Behandlungskammer des Systems mit 70% Ethanol. Dies hilft, den Benutzer Stirn Schweiß und Hautöle zu reinigen.
- Wenn Kondensation innerhalb der Prozesskammer aufgebaut, ein Verdünnungsfaktor ausführen, um die Kondensation zu löschen. Lassen Sie mindestens 1 Stunde für diese zu vervollständigen.
6. Routinenicht täglichen Aufgaben
- Füllt die Wasserschalen in den Zellkulturzentren mit sterilem, destilliertem Wasser nach Bedarf. Top das Geschirr mindestens einmal in der Woche ab. Allerdings schwankt die Verdampfungsrate basiert darauf, wie oft die Inkubator Türen geöffnet werden, das Volumen der Flüssigkeit in den Kulturen und den Inkubator Einstellungen.
- Einmal im Monat, die O 2 und CO 2 Einstellungen in allen Kammern neu kalibriert werden . Dies erfordert die Verwendung von SPAN (Kalibrierung) Gas, die Fortsetzungains bekannten Konzentrationen Niveaus von O 2 und CO 2 als Referenzstandard. Stellen Sie sicher, dass es eine ausreichende SPAN Gasversorgung vor dem Start der Kalibrierung. Das System verwendet spezielle Gassensoren in jedem Modul befindet, Gaskonzentrationen zu erfassen; Somit gewährleistet die Verwendung von hochwertigen SPAN Gase, dass die Sensoren zuverlässig genaue Gaskonzentrationen ergeben.
- Ersetzen Sie die Handschuhe in der Prozesskammer und Mikroskopkammer auf einer regelmäßigen Basis. Ersetzen Sie die Handschuhe alle 2 Monate, unabhängig davon, wie oft das System genutzt wird. Vor der Installation sterilisieren die neuen Handschuhe mit Desinfektionsmittel. Führen Sie einen Verdünnungsfaktor auf der Prozesskammer, nachdem die Handschuhe ersetzt wurden.
Hinweis: Wenn Sie über die Manschetten des Systems ausgestreckt, Nitril Handschuhe haben eine Tendenz, Löcher in Bereichen zu entwickeln, um körperliche Belastung und Hitze ausgesetzt sind. Das ist normal und unvermeidbar Verschleiß. - Ändern Sie die Spritzenfilter in allen alle 6 Monate Kammern.
- Ersetzen oder waschen ter Vorfilter auf der Laminar-Flow-Haube, sobald es schmutzig erscheinen beginnt.
- Wenden Sie sich an den Dokumenten des Herstellers regelmäßig Informationen über den Austausch von großen Teilen.
7. Reinigung des Systems
- Im Falle eines Ereignisses starke Verunreinigungen, die Mehrheit der Zellkulturen zu schädigen, verschieben Sie alle überlebenden Zellkulturen aus dem System oder (falls möglich) in einem nicht betroffenen Inkubator.
- Drehen Sie die Gassteuerung für alle Kammern der Ausnahme, dass nicht betroffener Inkubatoren ab.
- Entfernen Sie die flexible Frontplatte des Geräts, und entfernen Sie die Edelstahlregale aus dem betroffenen Zellkultur-Inkubator. Entfernen Sie auch die Wasserwanne.
- Autoclave den Inkubator Regale und Wasserwanne und legte sie wieder in den Inkubator. Wischen der Innenflächen des Inkubators mit 70% Ethanol. Lassen Sie das Ethanol zu verdampfen, und schließen Sie die Tür des Inkubators.
- Wischen Sie die Oberflächen des Prozesses und Mikroskop Kammer mit 70% etHANOL. Setzen Sie die Frontplatte des Geräts.
- Wischen der Innenflächen der Vorrichtung, einschließlich des betroffenen Inkubator mit nicht brennbaren Desinfektionsmittel. Lassen Sie die Tür des betroffenen Inkubator geöffnet, und ein Verdünnungsfaktor auf der Prozesskammer laufen. Stellen Sie sicher, dass die Mikroskopkammertüren sind ebenfalls geöffnet.
- Für die Routinereinigung der Kultur Inkubatoren Zelle, sicherzustellen, dass der Inkubator und Prozesskammer bei den gleichen atmosphärischen Einstellungen sind. Öffnen Sie die Tür des Inkubators, und legen Sie alle Zellkulturschalen auf der Oberfläche der Prozesskammer.
- Wischen Sie die Inkubator Regale nach unten und Innenflächen mit nicht brennbaren Desinfektionsmittel. Lassen Sie das Desinfektionsmittel zu verdampfen, und bewegen Sie die Zellkulturen zurück in den Inkubator. Arbeiten so schnell wie möglich Austrocknung der Zellkulturen zu vermeiden.
Representative Results
Dieses Manuskript beschreibt im Detail eine Zelle Produktionsstätte, und die einzigartigen Aspekte von Zellen in einem geschlossenen System kultiviert werden. Der Großteil der Zellproduktionsstätte umfasst eine maßgeschneiderte, beiliegend, Zellkulturvorrichtung , die eine kleine Stellfläche und lässt sich in 6 x 7,5 m 2 Zimmer (2) untergebracht werden. Zu keinem Zeitpunkt sind die Zellen innerhalb der Vorrichtung ausgesetzt Laborpersonal oder der Umgebung. Die Vorrichtung besteht aus mehreren Modulen: eine Prozesskammer, eine Laminarströmungshaube, 2 Pufferung Schleusenkammern zwischen der Haube und der Prozesskammer, zwei Zellkultur - Inkubatoren, und einem Mikroskopkammer benachbart zu der Prozesskammer (3). Das System wird durch Software gesteuert , so dass Umgebungsvariablen (Figur 1) gesteuert und überwacht werden. Der Computer mit dieser Software läuft auf einer unterbrechungsfreien Stromversorgung. Die Gase werden in th gefüttertE - System durch eine Reihe von Verteilern für Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid (Abbildung 4). Gase für das Gerät sind durch Verteilersysteme geliefert, die zwei Sätze von Tanks haben jeweils - ein aktives Set und ein Reservesatz. Wenn der aktive Satz wird nach unten gezogen, schaltet der Verteiler automatisch an die Reserve eingestellt und das Personal Tanks, um Ersatz. Die Leistung ist auf einem Backup-Generator-System.
Pluripotente und neurale Stammzellen können in hypoxischen Bedingungen in dieser Anlage unter Verwendung von zuvor entwickelten Protokolle 9, mit den zusätzlichen Komplikationen inhärenten dem neuen Gerät angebaut werden. Pluripotente Stammzellen können mit Sendai-Virus abgeleitet werden, Pluripotenz-spezifische Antikörper unter Verwendung von vollständig transfizierten Kolonien zu identifizieren, die dann isoliert und expandiert. (5A und B), Aus diesen iPSCs, neuralen Stammzellen und Neuronen kann mit dual SMAD Inhibierung abgeleitet werden, und deren Phänotyp prüft usi ng NSC-spezifischen Antikörpern (5C und D).
Abbildung 1. Grafische Oberfläche für die Zellproduktionsanlage. (A) Die graphische Darstellung des CPF ist der Standardbildschirm und stimmt mit der CAD - Zeichnung in Abbildung 3 dargestellt. Ein Klick der Maus über das Puffermodul 1 (2F in Abbildung 1) öffnet seine Kontrollbildschirm (B) , wobei O 2 Werte eingestellt werden , um die Bearbeitungskammer (3 in Abbildung 3) zu entsprechen. In ähnlicher Weise auf der Prozess klicken Kammer oder Incubator 1 bringt ihre jeweiligen Steuerbildschirme (C bzw. D), wo Werte geändert werden können , oder in angemessener Weise überwacht. rget = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Zellproduktionsanlage. (A) Das System , wie aus einer Ansicht von vorne rechts gesehen. Beachten Sie die Strom- und Gasanschlüsse in der Decke und den Wagen mit den Mikroskop-Zubehör und Computer auf der rechten Seite. (B) Die Laminarströmungshaube mit den Zugangstüren zu den Puffermodulen an der rechten Seite zu sehen. (C) Die Prozesskammer mit den beiden Inkubatoren (schwarze Türen) auf der Rückseite gesehen. (D) Ein Blick durch die rechte Seite des Systems , das Mikroskop zeigt und Monitor mit den Türen zu den Pufferkammern in der Ferne zu sehen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Ein CAD - Zeichnung der Zellproduktionsanlage. Alle Einzelteile in das Gerät gelangen zunächst mit Alkohol und luftgetrocknet , in der Laminar - Flow - Haube (1) abgewischt. Die Artikel werden dann auf die geeignete Atmosphäre im vorderen Puffermodul (2F) überführt, bevor sie in das UCPC Modul übergeben wird, oder Prozesskammer (3). Zellen werden in den beiden Inkubatoren (4, 5). Lebendzellfärbung, Kolonie Kommissionierung, die Beurteilung der allgemeinen Zellmorphologie und Migrationsanalyse erfolgt in der UPC - Modul oder Mikroskopkammer (6). Schließlich Abfall das System durch den hinteren Puffermodul (2R) austritt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. < / P>
Abbildung 4. Quellen von Gasen und Energie. (A) Die CO 2 Verteiler ist ein 4 x 4 - Setup , da es alle Inkubatoren des Labors liefert. (B) Der O 2 Verteiler ist ein 2 x 2 - Setup und liefert nur die Zellproduktionsanlage. Stickstoff für das System wird in einem Verdampfer erzeugt wird (C, knapp unterhalb des Ausgangszeichen) , die an einem flüssigen Stickstoffverteiler (nach rechts) , die auch cryofreezers (unten links) füllt automatisch. Der Verteiler ist ein 2 x 2-Setup durch zwei Paare von 160 L flüssigem Stickstoff Tanks zugeführt wird. CO 2, O 2 und N 2 werden von der Decke durch Absperrungen (D) zugeführt wird . Hausvakuum wird auch an dieser Stelle zugeführt wird. Gesehen direkt hinter den Versorgungsgasabschaltungen ein Paar von Stromkabeln, die Stromversorgung des Systems liefern.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. pluripotenten Stammzellen in Hypoxie mit Sendai - Virus stammt. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (Nomenklatur in Stover gefunden et al. 9), Phasenkontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs Live-gefärbt mit AF-594-markiertem Tra-1-60, 1: 100 Verdünnung in Medien. Alle iPSCs wurden in der Zellproduktion in 5% O 2 mit Sendai - Virus transduziert. (C) Phasenkontrast-SC68.1 UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC abgeleitetes NSC, bei 5% O 2 in chamber slides gezüchtet. Die Zellen wurden dann in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit anti-human Nestin primären Antikörper und Alex-488 sekundärem Antikörper gefärbt. Alle Maßstabsbalken sind bei 100. 1, m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Zellen innerhalb der CPF gewachsen sehen keine Veränderungen in Sauerstoff oder Kohlendioxid-Konzentrationen, wie sie von Inkubator bewegen Kammer zu Behandlungskammer zu Mikroskop und zurück. Es ist wichtig, dass die Bedingungen in jeder Kammer an den jeweiligen Inkubator abgestimmt sind, in dem die Zellen gehalten werden, bevor die Zellen aus dem Inkubator entfernt werden. Die Atmosphäre innerhalb der Vorrichtung kontinuierlich HEPA-gefilterten und ist anpassbar in bezug auf Sauerstoff und Kohlendioxid-Konzentrationen. Zellen können in Standardkonzentrationen für PSCs oder NSC, 5% und 9%, jeweils aufgewachsen werden; oder alternative Konzentrationen können für verschiedene Zelltypen oder für bestimmte Experimente ausgewählt werden. Somit ist die Vorrichtung mit konstantem Quellen medizinischer Qualität Sauerstoff, Kohlendioxid und Stickstoff (Figur 4) zugeführt wird . Alle drei dieser Gase werden durch gasspezifische Verteilersysteme geliefert, die die konstante Versorgung gewährleisten. Die Vorrichtung ist außerdem mit einem Kalibriergas zugeführt Mischung, bestehend aus10% (± 0,01%) Kohlendioxid in Sauerstoff. Die Verteilersysteme sind außerhalb der Zelle Produktionsanlage untergebracht ist und die Gase in die Anlage durch die Decke geleitet. Das Kalibrierungsgas wird innerhalb der Anlage untergebracht. Das Gerät ist zusätzlich mit Hausvakuum, auch durch die Decke geliefert. Mit einem elektronischen Überwachungssystem und drahtlose Sendeeinheiten werden die Ausgangsdrücke aller Sammelleitungen ständig überwacht. Im Falle, dass jeder Druck außerhalb des Bereichs fällt, werden die Zellproduktionsanlagenbetreiber automatisch angerufen und mitgeteilt, so dass entsprechende Maßnahmen ergriffen werden können.
Der Energiebedarf der Vorrichtung werden durch sechs dedizierte 120 V-Stromkreise erfüllt die von der Decke herabfahren und des Krankenhauses Back-up-Generatoren verbunden, um eine konstante Versorgung zu gewährleisten. Der Betrieb der Vorrichtung wird über die Software auf einem PC-basierten Computer über eine unterbrechungsfreie Stromversorgung mit Strom versorgt gesteuert. Diese Macht und Computeranordnungensicherzustellen, dass die Systemfunktionen kontinuierlich auch im Falle eines öffentlichen Netzsystemausfall. Die Software die Steuervorrichtung hat eine benutzerfreundliche graphische Schnittstelle (Abbildung 1) , die ebenso wie Temperatur, Feuchtigkeit, und die Kammer ermöglicht Drücke für die Kontrolle von Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen. Die Werte aller dieser Parameter werden kontinuierlich eine laufende Aufzeichnung aller Geräteparameter zur Verfügung zu stellen aufgezeichnet. Diese Daten werden jede Nacht auf einem Remote-Server gesichert, um ihre Integrität zu schützen. Der Computer und die Software kann von Administratoren Remote-Zugriff zu bewerten und / oder jeden Parameter ändern. Darüber hinaus kann der Computer und Software aus der Ferne zugegriffen werden kann, interaktive Beurteilung von Geräteparametern ermöglicht und mit lokalen Benutzern zur Fehlerbehebung. Eine zusätzliche Alarm-Sendeeinheit ist mit dem Gerät verbunden, so dass die Zellproduktion Anlagenbetreiber jeglicher Out-of-Range-Zustand des Gerätes informiert werden. Der RAS-capabilities lassen sich einloggen und Beurteilung der Besonderheiten des Out-of-Range-Zustand.
Die Vorrichtung ist als modulares System entwickelt, um sowohl in einer Makro- und einer Mikro Sinn. Einzelnen Zellkulturmodule wie Inkubatoren und Behandlungskammern können in Bezug auf ihre Abmessungen und Anforderungen sowie in deren Anordnung in Bezug zueinander angepasst werden. Darüber hinaus sind die meisten der Steuerfunktionen der einzelnen Module selbst modular, so daß einzelne atmosphärische Gasregler, beispielsweise kann leicht ohne wesentliche Störung des Systems ausgetauscht werden.
Spezialisierten Verarbeitungskammern, beispielsweise eine für die mikroskopische Visualisierung und Manipulation von Zellkulturen, an das System leicht angepasst werden. Sowohl Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskop sind innerhalb des Systems (Figur 6) , so daß Zellen können lebende gefärbt werden, und Kolonien können in den gleichen atmosphärischen Bedingungen wie im Inneren t zerlegt werdener Inkubatoren. Verlegen von Kabeln durch abgedichtete Durchführungen in den Seitenwänden der Behandlungskammer ermöglicht Geräten wie Stromversorgungen und Computer außerhalb der Vorrichtung gehalten werden, in der Regel auf einem Wagen (6).
Die Behandlungskammern in der Zellproduktionsanlage haben einen anderen Luftstrom Muster als herkömmliche BSCs. Bei herkömmlichen BSCs fließt Luftstrom von einem zentralen Abluftöffnung nach unten und spaltet sich in zwei getrennte Ströme, die dann durch zwei verschiedene Belüftungsöffnungen im vorderen und hinteren Teil des Kabinetts des Boden aufgenommen. Im Gegensatz dazu hat das CPF eine einzige Entlüftungsöffnung in dem vorderen Teil der Decke. Luft strömt nach unten und in Richtung der Rückseite der Kammer, wo sie dann nach oben in eine Lufteinlassöffnung gesaugt wird. Obwohl die CPF von Natur aus sehr sauber ist, ist dieser einzigartige Luftstrom Muster bedeutet, dass Techniker müssen leicht ihre Technik anpassen das Risiko einer Kontamination zu reduzieren. Wie bei einem herkömmlichen BSC, ein Laborant should vermeiden, dass ihre Hände vor offenen Zellkulturplatten und Medien Flaschen platzieren. Jedoch, die die Richtung stromaufwärts wurde in dem CPF verändert
Die Zellproduktionsstätte Labor selbst ist ziemlich Standard und ist mit einem -20 ° C Gefrierschrank ausgestattet, einem -80 ° C Gefrierschrank, 4 ° C Kühlschrank, eine Zentrifuge und ein Wasserbad. Das Labor hat auch ein Waschbecken mit Fußschalter für die bequeme Freisprechbetrieb. Um diesem Labor eine funktionelle klinischen Zellproduktionsstätte zu werden, müssen jedoch einige zusätzliche Modifikationen noch vorgenommen werden. Erstens muss die Vorrichtung selbst aufgerüstet werden, um die Fähigkeit zu haben, flüchtige organische Verbindungen, Partikel zu überwachen, und die Konzentrationen an Chlordioxid, die zur Dekontamination eingesetzt wird. Zweitens wird eine Verarbeitungskammer mit einer FACS-Maschine enthält, kann über einen Puffermodul mit dem Rest der Vorrichtung untergebracht und angeschlossen werden. Dies wird für die Zellsortierung und Reinigung von tr ermöglichenansplantable Zellpopulationen unter den entsprechenden Umgebungsbedingungen. Schließlich muss die gesamte Vorrichtung innerhalb einer weichen Wand Reinraum untergebracht werden. Dies sorgt für eine Internationale Organisation für Normung (ISO) Klasse 8 - Umgebung für die Vorrichtung 5.
Die hohe Sterilität und computergesteuerten Charakter des CPF macht es zum idealen System für zukünftige Anwendungen mit zellbasierten Therapie und gute Herstellungsverfahren. Das Risiko einer Kontamination stark abgeschwächt, aber noch wichtiger, sind die Bedingungen für die Zellexpansion automatisch erfasst und durch das Computersystem archiviert. Abweichungen in Gaskonzentrationen, Temperatur, Feuchtigkeit und allen Ereignissen des Zugangs in das System werden rigoros dokumentiert. Dies kann erheblich dazu beitragen, wenn das Produkt Qualitätsprobleme zu untersuchen. Jedoch gibt es immer noch Beschränkungen auf. Die Verwendung von irgendwelchen und allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (zB Medienkomponenten, Pipetten, Platten) sind separat zu dokumentieren. Hinzufügenitionally, gibt es eine Vielzahl von möglichen Problemen (einschließlich vieler Formen menschlicher Fehler), die durch das Überwachungssystem entstehen können, welche die CPF dokumentiert den Variablen völlig unabhängig sind. Somit bleibt der Bedarf an hoch qualifiziertes Personal und ausführliches Handbuch Dokumentation von Aufgaben an Ort und Stelle.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Biospherix für ihre Hilfe anzuerkennen, beim Erlernen der Xvivo geschlossenen Zellkultursystem zu verwenden, insbesondere Matt Freeman; das Personal von Miles & Kelley Construction Company, Inc. für ihre Arbeit in der Labor-Infrastruktur, insbesondere Russ Hughes Einrichtung; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung von Einrichtungen und Support Services für ihre Arbeit im Labor umbauen zu koordinieren, vor allem Adam Lukhard und Devin Hugie; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung für Informationssysteme für ihre Hilfe bei der Datenmanagement-Infrastruktur und Remote-Zugriff, insbesondere Viet Tran Einrichtung; Kinderkrankenhaus von Orange County Executive Management Team für ihre langjährige Unterstützung des Projekts, vor allem Dr. Maria Minon und Brent Dethlefs. Diese Arbeit wurde von Kinderkrankenhaus von Orange County und dem California Institute for Regenerative Medicin finanzierte durch Gewährung TR3-05476 zu PHS. Alle Autoren trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
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