Protocol
1. Grundinställn
- Ställa Gas och temperatur koncentrationer
- Med hjälp av programvaran, klicka på "Gäst" fliken på det övre vänstra hörnet av det grafiska gränssnittet. Logga in i systemet med hjälp av en utsedd användarnamn och lösenord. Se till att varje användare har sin egen användarnamn och lösenord.
- Klicka på en modul för att justera (Figur 1). Inom det nya fönstret som visar de aktuella inställningarna genom att klicka på den befintliga O2 börvärde under "Set point" och ange önskad O2 koncentrationsnivå för denna modul. Ange 5% O2 om pluripotenta stamceller kommer att odlas eller manipuleras i denna modul, och 9% O2 om neurala stamceller kommer att odlas eller manipuleras. Klicka på den gröna bocken för att bekräfta den inställda punkten.
Obs: Två moduler är inte gas-justerbar: den laminära huva, och mikroskopet kammaren. De gaskoncentrationer i laminärt flöde huva är atmosfär while de i mikroskop kammaren passivt upprätthålls av gaskoncentrationer i processkammaren. - Upprepa detta steg för CO 2. Skriv in ett börvärde av 5% CO2 för alla moduler utom för buffertkammare, som är endast justeras för O2.
- Övervaka nuvarande gaskoncentrationer, som är märkta som "processvärden", för att se till att de når nya börvärden.
- Justera gas börvärden alla moduler till lämpliga värden. Matcha CO 2 och O 2 nivåer av kammare som kommer att exponeras för varandra. Till exempel, justera processkammaren till 5% O 2 innan du öppnar en inkubator som växer celler vid 5% O 2. Också anpassa sig till 5% O2 någon buffertkammare som används för att lägga till objekt till processkammaren under denna tid.
- Ställ in temperaturen hos processkammaren till 37 ° C med användning av samma skärm för justeringar gaser. Också ställa in processkammaren floor temperaturen till 37 ° C.
- Klicka på inkubation modul banker under varje inkubator. Justera temperaturen av bankerna till 37 ° C.
- Driften av buffert Chambers
- Samla alla leveranser som krävs för given uppgift (matning, delning, färgning, etc.) i början för att förhindra en fördröjning i arbetsflödet. Frikostigt spraya alla material med 70% etanol och låt dem torka i laminärt huva. Spraya inte flaskor eller plattor av celler - torka dem försiktigt med en steril gasbinda svamp mättad med 70% etanol.
- Se till att både de yttre och inre dörrarna till buffertkammaren är ordentligt stängda. Öppna sedan ytterdörren, och placera objekt inuti.
- Stänga den yttre dörren. Inom programmet väljer buffertmodulen och klicka på fliken utspädningsfaktorn. Ange en i loggfaktorn rutan. Klicka på Start.
Anmärkning: En "utspädningsfaktor" definieras för att betyda att buffertmodulen atmosfär kommerevakueras och ersättas en gång med ren, HEPA-filtrerad gas. - När det grafiska gränssnittet har slutat blinka "utspädningsfaktor", öppna buffertkammarens innerdörr och föra material inuti processkammaren.
Varning: Låt inte de inre och yttre dörrar till någonsin vara öppna samtidigt och inte öppna den inre dörren om buffertkammaren inte har genomgått en utspädningsfaktor. - För att ta bort objekt från processkammaren, först se till att buffertkammaren har genomgått en utspädningsfaktor. Öppna sedan den inre dörren, placera objekt som ska tas bort i och stäng innerdörren. Öppna sedan ytterdörren och ta bort poster.
Notera: En utspädningsfaktor inte behöver köras innan man öppnar ytterdörren.
2. Introduktion och utfodring celler
- inkubator Setup
- Placera 3 petriskålar i vattenpannan vid basen av varje inkubator. Fyll dessa rätter med sterile vatten. Inte direkt fylla vattenpannan. Upprätthålla vattennivån i dessa disk, eftersom de är kritiska för att bibehålla den relativa fuktigheten (RH) börvärde i inkubatorerna.
- Inom det grafiska gränssnittet, klicka på inkubatorn. Klicka på det befintliga värdet för relativ fuktighet (RH) under börvärdet och ange 85%. Klicka på den gröna bocken att acceptera detta värde.
- Framställning av cell produktionsanläggning för celler
- Om det inte redan gjort det, justera buffertkammare, processkammaren, och en inkubator till gas börvärden som krävs för den typ av cell införs.
- Rengöra ytan av processkammaren med steril gasbinda och en icke-brandfarlig desinfektionsmedel. Använd inte någon perättiksyra baserat desinfektionsmedel, som i ett slutet system den starka, kvardröjande ångor är giftiga för däggdjursceller. Istället använder bensalkoniumklorid baserade produkter.
- Fortsätta desinficering. Rengör handskar och ytor som är commoNLY rörd, såsom dörrhandtag. Använd desinfektionsmedel ordentligt men sparsamt, eftersom överskottsvätska i processkammaren kommer att bidra till fukt, kondens och eventuell mikrobiell tillväxt.
- Rengöra ytan av huv med laminärt flöde och buffertkammare med 70% etanol, och låt det torka. Placera kolven eller plattan av celler (i vårt fall, PSC eller NSCs) i huven, och kortfattat torka dess yttre yta med en steril gasbinda svamp mättad med etanol.
- Sätt kolven eller plattan i buffertkammaren, och kör en utspädningsfaktor (steg 1.2.3).
- Efter slutförandet av utspädningsfaktorn, omedelbart flytta kolven eller platt till lämplig inkubator. Som inkubatorerna är på baksidan av processkammaren, dra en hylla ut in i processkammaren för cellplacering. Undvik att öppna inkubator dörrar i onödan eller under längre tidsperioder, eftersom processkammaren luft är mycket torr jämfört med de inkubatorer, och kommer att resultera i en betydandeförlust av fukt i inkubatorn.
- Matning Cellkulturer
- Samla mediumkomponenter, serologiska pipetter, en elektronisk pipett, gasväv och desinfektionsmedel. samlar också en avfallsbehållare för använt cellodlingsmedium, men inte fylla den med blekmedel. Föra de material in i processkammaren genom en buffertkammare, såsom beskrivs i avsnitt 1.2. Förbereda cellodlingsmediet i processkammaren, såsom tidigare beskrivits 9,10 (se även Material tabell)
- Ordna material på ett sådant sätt för att möjliggöra en optimal arbetsutrymme. Undvik att placera objekt som inte används i mitten av processkammaren.
- Låt på medellång till jämvikt med CO 2 och O 2 nivåer som finns i systemet genom att lämna mediabehållaren något oskyddad. Vissa PSC medel tillverkare anger inte att värma media vid 37 ° C; Om detta är fallet, använd en buffertkammare till jämvikt mediet. Tillåta migDIUM inta jämvikt under 20 min.
- Ta bort det gamla mediet från brunnarna med en lämplig stereologisk pipett och en elektronisk pipett. För PSC, ta bort alla utom en liten återstående beloppet av gamla mediet, tillräckligt för att förhindra uttorkning under matningsprocessen. För NSCs, ta bort hälften av det gamla mediet. Pipett avfallet i avfallsbehållaren.
- Placera den använda pipetten tillbaka till sin originalförpackning och flytta den till sidan av processkammaren, eller i en buffertkammare som utsetts för sophämtning. Med en ny steril serologisk pipett, tillsätt färskt medium till cellodlingsplattor och placera plattorna tillbaka till deras utsedda inkubator.
- I slutet av utfodring, spraya gasväv med desinfektionsmedel och rengör golvet och dörrhandtag av processkammaren noggrant. Om det finns flera cellinjer odlas i systemet, sterilisera däremellan mata varje cellinje. Detta hjälper till att minimera risken för korskontaminering.
- Efter avslutad, ta bort avfalleller andra onödiga objekt genom en av buffertkamrarna.
3. Dela upp cellkulturer
- Enzymatisk Passaging av PSC eller NSCs
- Samla alla saker som behövs för passage. Detta inkluderar media, enzym eller icke-enzymatisk cell dissociation buffert (den senare är för NSCs endast), DPBS, plattor eller flaskor, extracellulära matrix (ECM), koniska rör och serologiska pipetter. Sätta dem i systemet med hjälp av en buffertkammare.
- Coat färska plattor eller flaskor med ECM, som tidigare beskrivits 9,10. Vissa ECM såsom personal de som härrör från mus sarkomcellinjer - är bara vätska mellan 4 och 15 ° C, så använd en steriliserad kalla blocket eller gel kylpåse att hålla ECM kallt medan du arbetar i den uppvärmda processkammaren.
- Pipett av det förbrukade mediet från kultur och kasta den i avfallsbehållaren.
- Skölj brunnen eller flaskan yta med hjälp av 1 ml DPBS / brunn och avyttra DPBS.
- Lägg 1 - 2ml varm enzym till varje brunn. Endast mycket täta kulturer kräver 2 ml.
- Omedelbart flytta odlingsskål eller kolven till mikroskop kammaren och observera kultur noggrant. Uppmärksam på tecken på enskilda celler börjar lossna skålen. Vänta inte tills cellerna flyter i suspension innan du fortsätter till nästa steg.
- Återgå cellerna till huvudprocesskammaren. Med hjälp av en 5 ml serologisk pipett, tillsätt 4 ml DPBS för varje 1 ml av enzym, och sedan kraftfullt pipettera upp och ned för att lossa cellerna från brunnens yta. Om passage flera brunnar i en flerskikts plattan, tillsätt DPBS till varje brunn innan rubba cellerna från de individuella brunnarna.
- Överföra enzymet och PBS cellsuspensionen till en lämplig storlek koniska rör.
- Om en centrifug är inte tillgängligt i cellproduktionsanläggningen, tätt täta koniska röret, placera den i en buffertkammare och täta dörren stängd.
- Ta bort den koniska röret från BUFfer kammaren från laminärt flöde sidan och snurra cellerna vid 100 xg under 5 min vid RT.
- Spraya det koniska röret med 70% etanol, och föra den in i processkammaren med användning av en buffertkammare och utspädningsfaktorn.
- Pipett bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 ml PSC eller NSC-medium. Om passage PSC, se till att inkludera ROCK-hämmare i mediet vid en koncentration av 10 ^ M, som tidigare beskrivits 9,10.
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer, och bestämma antalet brunnar eller plattor som krävs. Platt PSC vid 5 x 04-01 Oktober x 10 5 celler / cm 2. Dela upp NSCs vid en 1: 2-förhållande.
Obs: NSCs ofta klumpar och motstå noggrann räkning i en hemocytometer. - Önskas kryokonservering av cellerna, följa lämpligt protokoll 9,10, men se till att alla leveranser och frysa media bereds i förväg och placeras inuti processkammaren. DMSO är mycket giftigt för celler vid 376; C, så arbeta mycket snabbt. Håll isopropanol-mantel frysning behållare vid RT i laminärt flöde huva. När frysförvaring flaskor fylls och förseglas, omedelbart ta bort flaskorna från processkammaren genom att de genom en buffertkammare.
- Manuell Passaging av PSC
- Bekräfta att kulturen måste passe, såsom tidigare beskrivits 8. Om så är fallet, förbereda färska plattor eller flaskor belagda med extracellulär matris. sedan ändra mediet helt.
- Rengöra mikroskop kammaren med steril gasbinda fuktad med en sparsam mängd ej antändbar desinfektionsmedel - för mycket kommer att medföra alltför kraftig dimbildning i kammaren. Rengör endast handskar, golvyta, och scenen. Ta flera 200 pl eller 1000 il individuellt förpackade pipettspetsar i kammaren.
- Ta plattan PSC i mikroskop kammaren, ta bort locket och placera den nedåt på nyligen rengjorda golvet. Lämnar locket upp exponerar undersidan dirrekt till luftströmmar, och eventuella föroreningar.
- Packa en pipettspetsen, och med hjälp av mikroskop för att visualisera den kultur, plocka isär kolonier som har god morfologi med användning av spetsen på pipett.
Obs! Pipettspetsen kan fästas på en pipett om den enskilde användaren finner det mer bekvämt. - Sätt tillbaka locket på plattan, och flytta plattan tillbaka till processkammaren.
- Pipett bort överflödigt ECM från den nya plattan, och överföra media från den gamla plåten (innehållande koloni bitar i suspension) till den nya plattan. Om den gamla plåten innehåller fortfarande kolonier som inte är redo att plockas, mata det också.
4. Specialiserade odlingstekniker
- Sendai Transduktion av fibroblaster i PSC
- Inom cellen produktionsanläggning, expandera humana hudfibroblaster 1 i fibroblast-medium innehållande DMEM / F12, 10% FBS, och 20 ng / ml FGF2, vid 5% O2. Använda 6-brunnars odlings dishes belagda med 0,1% gelatin.
- Förbered celler som skall omvandlas genom att dissociera dem med 1 ml 0,25% trypsin per brunn. Inaktivera trypsin med 1 ml fibroblast medium. Centrifugering vid 200 xg, resuspendera cellerna i 1 ml fibroblast-medium, och räkna dem med hjälp av en hemocytometer.
- Resuspendera 2,0 x 10 5 celler i 2 ml fibroblast medium och lägga cellsuspensionen till en brunn i en gelatinbelagd 6 brunnar (2,1 x 10 4 celler / cm 2). Sätt tillbaka i inkubatorn cellerna.
- Tillåt 24 h för cellerna att fästa till botten av plattan.
- Placera färskt fibroblast-medium inne i processkammaren (1 ml medium per brunn av celler som skall transducerade), och låt det utjämna till gaserna.
- Sterilisera en förkyld kalla blocket med 70% etanol och placera den i en buffertkammare. Använd en gel kylpåse med hål utskurna i det om en kommersiell kalla blocket är inte tillgänglig.
Obs: Det finns 3-4 separata Sendaivirus (beroende på vilken version av transduktion kit), som måste tinas snabbt, men höll i det kalla blocket en gång tinats. - Doppa den nedre halvan av rören i ett 37 ° C vattenbad i 15 sek (sänk inte ner rören), sedan omedelbart rengöra röret exteriörer med 70% etanol. Placera rören på den steriliserade kalla blocket i buffertkammaren och köra en utspädningsfaktor.
- Arbeta snabbt, lägger den nödvändiga volymen av varje Sendai omprogrammering viruset till jämviktad mediet 2. Denna volym bestäms av tre variabler - antalet celler, titern av varje virus, och den önskade infektionsmultiplicitet för varje virus. Konsultera kit manual för rekommenderade MOI. Formeln är:
[(Antal celler som transfekteras) (infektionsmultiplicitet) (1000)] / (virustiter) = krävs xl av virus - Avlägsna supernatanten från brunnen (er) av celler som skall omprogrammeras. För varje brunn, tillsätt 1 ml av medium innehåller virus. Skaka plattan, och vara noga med att inte spilla media, och placera plattan tillbaka i 5% O 2 inkubator.
- Efter två timmar försiktigt gunga plattan igen och upprepa igen efter ytterligare två timmar.
- Efter 24 h (dag 1 efter transduktion), mata brunnen med 1 ml av pluripotenta stamceller medium. Upprepa på dag 2, men ta inte bort mediet från brunnen.
- På dagarna 3 och 4, ändra halv av mediet.
- På dag 5 och därefter ändra hela mediet.
- När kolonier visas färga kultur med sterila antikroppar för att bekräfta att kolonierna faktiskt pluripotenta, som beskrivits tidigare två. Som med utfodring celler, se till att PSC media som innehåller antikroppar har jämvikt till gaserna i cellproduktionsanläggningen.
Obs: I en framgångsrik omprogrammering, bör IPSC kolonier vara närvarande cirka två veckor efter transduktion 1. - När kolonierna har vuxit stortnog använda mikroskop för att markera och mekaniskt passage dem på en ECM-belagd platta, som beskrivs i avsnitt 3.2.
- Expandera kolonierna antingen manuellt eller enzymatiskt, såsom tidigare beskrivits 9,10.
5. att städa upp efter dagligt bruk
- Placera alla avfall, inklusive kolven flytande avfall, i en steril buffertkammare. Torka av ytan av behandlingskammaren och alla de områden som har kommit i kontakt med leveranser med steril gasbinda och icke brännbart desinfektionsmedel.
- Ta bort alla avfall fasta från buffertkammaren och kassera i lämplig avfallsbehållare.
- Kasta flytande avfall i en lämplig avfallsbehållare, eller helt enkelt blandas med blekmedel och häll ner i avloppet. Rengör avfallsbehållaren med tvål och en borste. Sterilisera behållare med 70% etanol och flytta den tillbaka till processkammaren via en buffertkammare.
Obs: Det är inte rekommenderat att använda blekmedel iavfallsbehållaren medan den är inne i systemet, som blekmedel rök kan återcirkulera och skada cellkulturer. - Av hygieniska skäl, torka front plastyta systemets behandlingskammaren med 70% etanol. Detta bidrar till att rensa bort svett och hudfett från användarens panna.
- Om kondens har byggts upp inne i processkammaren, köra en utspädningsfaktor för att rensa kondensation. Låt åtminstone en timme för detta att slutföra.
6. Rutin Icke dagliga uppgifter
- Fylla på vatten rätter i cellodlings inkubatorer med sterilt, destillerat vatten vid behov. Toppa disken minst en gång i veckan. Emellertid kommer avdunstningshastigheten variera utifrån hur ofta inkubator dörrarna öppnas, vätskevolymen i kulturer, och inkubatorinställningar.
- En gång i månaden, kalibrera O 2 och CO 2 inställningar i alla kammare. Detta kräver användning av SPÄN (kalibrerings-) gas, vilken fortsains kända koncentrationer nivåer av O2 och CO2 som en standard av referens. Se till att det finns tillräckligt SPAN gasförsörjning innan kalibrering. Systemet använder specifika gassensorer, som ligger i varje modul, för att upptäcka gaskoncentrationer; därmed användningen av högkvalitativa spänngaser säkerställer att sensorerna på ett tillförlitligt sätt ge exakta gaskoncentrationer.
- Byt handskarna i processkammaren och mikroskop kammare på en regelbunden basis. Byt handskarna var 2 månader, oavsett hur ofta systemet utnyttjas. Före installation, sterilisera de nya handskar med desinfektionsmedel. Köra en utspädningsfaktor på processkammaren efter handskarna har ersatts.
Obs: När sträckte sig över manschetterna i systemet, nitril har en tendens att utveckla hål i områden som utsätts för fysisk stress och värme. Detta är normalt och oundvikligt slitage. - Byt ut sprutfilter i alla kammare var 6 månader.
- Byt ut eller tvätta than Förfilter på huv med laminärt flöde så snart det börjar att synas smutsig.
- Se tillverkarens dokument regelbundet för information om utbyte av stora delar.
7. Rengöring av systemet
- I händelse av en större förorening händelse som påverkar en majoritet av cellkulturer, flytta eventuella överlevande cellkulturer ut ur systemet, eller (om möjligt) till ett opåverkat inkubator.
- Stänga av gasen kontroll för alla kammare utom opåverkade inkubatorer.
- Ta bort den flexibla frontpanelen hos apparaten, och ta bort hyllorna av rostfritt stål från det drabbade cellodlingsinkubator. Också ta bort vattenpannan.
- Autoklav inkubatorn hyllorna och vatten pan, och sätta dem tillbaka in i inkubatorn. Torka de inre ytorna av inkubatorn med 70% etanol. Tillåt etanolen avdunsta och stäng inkubatorn dörren.
- Torka av ytorna av processen och mikroskopkammare med 70% ethanol. Sätt tillbaka frontpanelen hos apparaten.
- Torka de inre ytorna av apparaten, inklusive den drabbade inkubatorn, med icke-brännbart desinfektionsmedel. Lämna dörren till drabbade inkubatorn öppen och kör en utspädningsfaktor på processkammaren. Se till att mikroskop kammardörrarna är också öppen.
- För rutinmässig rengöring av cellodlings inkubatorer, se till att inkubatorn och processkammaren är på samma atmosfär inställningar. Öppna inkubatorn dörren, och placera alla cellodlingsskålar på ytan av processkammaren.
- Torka inkubator hyllor och inre ytor med icke brännbart desinfektionsmedel. Låt desinfektionsmedel avdunsta, och flytta cellkulturer tillbaka till inkubatorn. Arbeta så snabbt som möjligt för att undvika uttorkning av de cellkulturer.
Representative Results
Detta manuskript beskriver i viss detalj en cell produktionsanläggning, och de unika aspekterna av att odla celler inuti ett slutet system. Huvuddelen av cellproduktionsanläggningen innefattar en skräddarsydd, sluten, anordning cellodling som har en liten plats och kan lätt inrymt i en 6 x 7,5 m 2 rum (Figur 2). Inte vid något tillfälle är cellerna i anordningen exponeras för laboratoriepersonal eller miljön. Anordningen består av flera moduler: en processkammare, ett laminärt flöde huva, 2 buffertslusskammare i mellan huven och processkammaren, två cellodlingsinkubatorer och ett mikroskop kammare intill processkammaren (Figur 3). Systemet styrs av programvara som möjliggör miljövariabler som skall styras och övervakas (Figur 1). Datorn kör detta program är på en avbrottsfri strömförsörjning. Gaser matas in the systemet genom en uppsättning av grenrör för syre, kväve och koldioxid (Figur 4). Gaser för enheten levereras av mångfaldiga system som har två uppsättningar av tankar vardera - en aktiv uppsättning och en reserv som. När den aktiva uppsättningen dras ner, växlar fördelaren automatiskt till den reserv som och personal för ersättning tankar. Strömmen är på en backup generatorsystem.
Pluripotent och neurala stamceller kan odlas i hypoxiska förhållanden i denna anläggning med hjälp av tidigare utvecklade protokoll 9, med den extra komplikationer inneboende den nya utrustningen. Pluripotenta stamceller kan härledas med användning av Sendai-virus, med användning av pluripotens-specifika antikroppar för att identifiera helt transfekterade kolonier, vilka sedan isoleras och expanderas. (Figur 5A och B), Från dessa iPSCs, neurala stamceller och nervceller kan härledas med hjälp av dubbla SMAD hämning, och deras fenotyp verifierade USI ng NSC-specifika antikroppar (figur 5C och D).
Figur 1. grafiskt gränssnitt för Cell Production Facility. (A) grafisk representation av CPF är standardskärmen och matchar CAD-ritning visas i figur 3. Ett klick på musen över buffert Modul 1 (2F i figur 1) öppnar sin kontrollskärmen (B) där O 2 värden är inställda för att matcha behandlingskammaren (3 i figur 3). På samma sätt, klicka på processkammaren eller Incubator en tar upp sina respektive kontrollskärmar (C och D, respektive), där värden kan ändras eller övervakas på lämpligt sätt. rFå = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cell Production Facility. (A) Systemet som sett från en främre höger vy. Observera ström- och gasanslutningar i taket och vagnen med mikroskop tillbehör och dator till höger. (B) Den laminärt flöde huva med dörrarna för tillträde till buffertmodulerna ses till höger. (C) Processkammaren med de två inkubatorer (svarta dörrar) sett på baksidan. (D) En vy genom den högra sidan av systemet visar mikroskopet och övervaka med dörrarna till buffertkamrarna ses i fjärran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. En CAD-ritning av Cell Production Facility. Alla objekt som kommer in i enheten först torkas av med alkohol och lufttorkas i dragskåp med laminärt flöde (1). Uppgifter infogas då över till den lämpliga atmosfären i den främre buffertmodul (2F) innan den leds in i UCPC modulen eller processkammaren (3). Celler odlas i de två inkubatorer (4, 5). Levande cell färgning, koloni plockning, bedömning av allmän cellulär morfologi och migration analys sker i UPC-modulen, eller mikroskop avdelningen (6). Slutligen lämnar systemet genom den bakre buffertmodulen (2R) avfall. Klicka här för att se en större version av denna siffra. < / P>
Figur 4. Källor för gaser och makt. (A) CO 2 grenrör är en 4 x 4 inställningar som levererar alla inkubatorer i laboratoriet. (B) O 2 grenrör är en 2 x 2 installation och levererar endast kroppar anläggningen. Kväve för systemet alstras i en förångare (C, strax under Exit tecken) fäst till ett vätskegrenrör kväve (till höger) som också fyller automatiskt cryofreezers (nederst till vänster). Fördelaren är en 2 x 2 installationen levereras av två par 160 L flytande kväve tankar. CO 2, O 2, och N 2 matas från taket genom shutoffs (D). Husvakuum matas också på denna plats. Sett precis bakom matningsgaser shutoffs är ett par av kraftkablar som levererar ström till systemet.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. pluripotenta stamceller i hypoxi med Sendai-virus. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenklatur som finns i Stover et al. 9), faskontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs levande färgade med AF-594-märkt Tra-1-60, 1: 100 utspädning i media. Alla iPSCs transducerades i cellproduktionsanläggningen i 5% O2 med Sendai-virus. (C) Fas kontrast SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-härledda NSCs, vuxit med 5% O2 i kammaren diabilder. Cellerna fixerades sedan i 4% paraformaldehyd och färgades med anti-human-nestin primära antikroppen, och Alex-488 sekundär antikropp. Alla skal barer finns på 1001, m. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Celler odlade inom CPF ser inga förändringar i syre- eller koldioxidkoncentrationer när de flyttar från inkubatorn till behandlingskammaren till mikroskop kammare och tillbaka. Det är kritiskt att förhållandena i varje kammare är avstämda för den speciella inkubatorn i vilket cellerna hålls innan cellerna avlägsnas från inkubatorn. Atmosfären i apparaten kontinuerligt HEPA-filtreras och är anpassningsbar när det gäller syre och koldioxidkoncentrationer. Celler kan odlas vid standardkoncentrationer för PSC: er eller NSCs, 5% och 9%, respektive; eller alternativa koncentrationer kan väljas för olika celltyper eller för specifika experiment. Sålunda är anordningen matas med konstanta källor till syre med medicinsk renhet, koldioxid och kväve (Figur 4). Alla tre av dessa gaser med gas specifika grenrörssystem som garanterar konstant leveranser. Anordningen är också försedd med en kalibrerings gasblandning bestående av10% (± 0,01%) koldioxid i syre. De mångfaldiga system är inrymda utanför cellen produktionsanläggning och gaserna leds in i anläggningen genom taket. Kalibreringsgasen ligger inom anläggningen. Anordningen är dessutom matas med husvakuum, även genom taket. Med hjälp av ett elektroniskt system för övervakning och trådlös sändarenheterna, är utgångstryck alla grenrör övervakas kontinuerligt. I händelse av att något tryck faller utanför intervallet, är cellproduktionsanläggningen operatörer automatiskt ringde och medde så att lämpliga åtgärder kan vidtas.
Strömkraven för apparaten uppfylls av sex dedikerade 120 V kretsar ner från taket och kopplas till sjukhusets reservgeneratorer för att säkerställa en konstant tillförsel. Driften av apparaten styrs via mjukvara på en PC-baserad dator som drivs via en avbrottsfri strömförsörjning. Dessa effekter och datorarrangemangse till att systemet fungerar kontinuerligt även i händelse av en offentlig effekt systemfel. Mjukvaran som styr anordningen har ett användarvänligt grafiskt gränssnitt (Figur 1), som medger reglering av syre- och koldioxidkoncentrationer såväl som temperatur, fuktighet, och kammartryck. Värdena för alla dessa parametrar registreras kontinuerligt för att åstadkomma ett löpande register över alla anordningsparametrar. Dessa data säkerhetskopieras på en fjärrserver varje natt för att skydda sin integritet. Datorn och programvaran kan nås på distans genom administrativa användare att bedöma och / eller ändra någon parameter. Dessutom kan datorn och mjukvaran nås på distans, vilket möjliggör interaktiv bedömning av apparatparametrar och felsökning med lokala användare. En ytterligare larm sändande enheten är ansluten till apparaten så att cell produktionsanläggning aktörerna underrättas om något out-of-range tillstånd av apparaten. Fjärråtkomst capabilities tillåter logga in och bedömning av detaljerna i out-of-range tillstånd.
Anordningen är utformad som ett modulsystem både i ett makro och en mikro mening. Enskilda cellodlings moduler, exempelvis företagskuvöser och processkammare, kan anpassas med hänsyn till deras dimensioner och krav liksom i sin layout med avseende på varandra. Dessutom, de flesta av kontrollfunktionerna hos de olika modulerna själva modulär så att enskilda atmosfärisk gas styrenheter, till exempel, kan lätt bytas ut utan betydande störningar i systemet.
Specialiserade behandlingskammare, såsom en för mikroskopisk visualisering och manipulering av cellkulturer, kan lätt anpassas till systemet. Både fas-kontrast och fluorescensmikroskop är inne i systemet (figur 6), så att celler kan leva färgas, och kolonier kan dissekeras i samma atmosfäriska förhållanden som i than inkubatorer. Kabeldragning genom förseglade genomföringar i sidoväggarna hos behandlingskammaren tillåter utrustning såsom nätaggregat och datorer för att hållas utanför apparaten, vanligen på en vagn (Figur 6).
De behandlingskammare i cellen produktionsanläggningen har en annan luftflödesmönster än konventionella BSC. I konventionella BSC strömmar luftflödet ner från en central luftutsläppen och delas upp i två separata strömmar, som sedan tas upp av två olika luftintagen i den främre och bakre delen av skåpets golv. Däremot har CPF ett enda utlopp i den främre delen av taket. Luft strömmar nedåt och mot baksidan av kammaren, där den dras sedan uppåt till en luftintag. Även CPF är till sin natur mycket ren, innebär detta unika luftflödesmönster som tekniker har till svagt anpassa sin teknik för att minska risken för kontaminering. Som med en konventionell BSC, ett labb arbetare should undvika att placera sina händer uppströms öppna cellodlingsplattor och medieflaskor. Däremot har den riktning, som är uppströms ändrats på CPF
Cell produktionsanläggning laboratorium själv är ganska standard och är utrustad med en -20 ° C frys, -80 ° C frys, en 4 ° C kylskåp, en centrifug, och ett vattenbad. Laboratoriet har också en diskbänk med fot kontroller för bekväm handsfree-användning. För att detta laboratorium för att bli en funktionell klinisk cell produktionsanläggning dock flera ytterligare modifieringar måste ändå göras. För det första måste själva apparaten att uppgraderas för att ha kapacitet att övervaka flyktiga organiska föreningar, partiklar, och koncentrationer av klordioxid som används för dekontaminering. För det andra kan en behandlingskammare som innehåller en FACS maskin inrymmas och ansluten till resten av apparaten via en buffert modul. Detta gör det möjligt för cellsortering och rening av transplantable cellpopulationer under lämpliga miljöförhållanden. Slutligen måste hela anordningen inrymd i en mjuk vägg renrum. Detta ger en International Organization for Standardization (ISO) klass 8 miljö för apparaten 5.
Den höga sterilitet och datorstyrd karaktär CPF gör det till ett idealiskt system för framtida applikationer med cellbaserad behandling och god tillverkningsprocesser. Risken för kontaminering i hög grad mildras, men ännu viktigare, är villkoren för cellexpansion automatiskt registreras och arkiveras av datorsystemet. Avvikelser i gaskoncentrationer, temperatur, luftfuktighet och alla händelser att komma in i systemet är noggrant dokumenterade. Detta kan vara till stor hjälp när man utreder problem produktkvalitet. Det finns dock fortfarande begränsningar. Användningen av alla eventuella reagenser och förnödenheter (t.ex. mediakomponenter, pipetter, plattor) ska dokumenteras separat. Lägg tillitionally finns en mängd potentiella problem (inklusive många former av mänskliga fel) som kan uppstå som är helt orelaterade till de variabler som dokumenteras av CPF övervakningssystem. Således kvarstår behovet av välutbildad personal och utförlig manuell dokumentation av uppgifter på plats.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för personalen på Biospherix för deras hjälp att lära sig att använda Xvivo medföljande cellodlingssystem, särskilt Matt Freeman; personal Miles & Kelley Construction Company, Inc. för deras arbete med att inrätta laboratorieinfrastrukturen, särskilt Russ Hughes; personalen på barnsjukhuset i Orange County departementet faciliteter och stödtjänster för sitt arbete med att samordna laboratorieombyggnads, särskilt Adam Lukhard och Devin Hugie; personalen på barnsjukhuset i Orange County Institutionen för informationssystem för deras hjälp med att installera infrastruktur datahantering och fjärråtkomst, särskilt Viet Tran; barnsjukhuset i Orange County ledningsgrupp för sitt långvariga stöd för projektet, särskilt Dr Maria Minon och Brent Dethlefs. Detta arbete har finansierats av barnsjukhuset i Orange County och California Institute för regenerativ Medicine genom bidrags TR3-05476 till PHS. Alla författare har bidragit lika för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
