Protocol
1. Første installasjon
- Innstilling Gass og temperatur Konsentrasjoner
- Ved hjelp av programvaren, klikk på "Gjest" -fanen plassert i øverste venstre hjørne av det grafiske grensesnittet. Logge på systemet med en angitt brukernavn og passord. Sørg for at hver bruker har sin egen brukernavn og passord.
- Klikk på en modul for å justere (figur 1). Innenfor det nye vinduet som viser de gjeldende innstillingene, klikk på eksisterende O 2 børverdi under "Set point" og skriv inn den nødvendige O 2 konsentrasjonsnivå for denne modulen. Angi 5% O 2 hvis pluripotente stamceller blir dyrket eller manipulert på denne modulen, og 9% O 2 hvis neurale stamceller blir dyrket eller manipulert. Klikk på den grønne haken for å bekrefte settpunktet.
Merk: To moduler er ikke gass-justerbar: laminær hette, og mikroskop kammeret. Den gasskonsentrasjoner i laminær hette er atmosfærisk while de i mikroskopet kammeret passivt vedlikeholdes av gasskonsentrasjoner i prosesskammeret. - Gjenta dette trinnet for CO 2. Skriv inn et sett poenget med 5% CO 2 for alle moduler med unntak av bufferkamre, som bare er justerbar for O 2.
- Følg med på dagens gasskonsentrasjoner som er markert som "prosessverdier", for å sørge for at de når de nye settpunkter.
- Juster gasssett poeng av alle moduler til de riktige verdiene. Match CO 2 og O 2 nivåer av kamre som vil bli utsatt for en annen. For eksempel justere prosessen kammeret til 5% O 2 før du åpner en inkubator som vokser cellene ved 5% O 2. Også justere til 5% O 2 noen bufferkammer som brukes til å legge til elementer i prosessen kammeret i løpet av denne tiden.
- Sette temperaturen i prosesskammeret til 37 ° C ved anvendelse av den samme skjerm for gass justeringer. Også satt prosessen kammeret floor temperaturen til 37 ° C.
- Klikk på inkubasjon modul bankene under hver inkubator. Juster temperaturen av bankene til 37 ° C.
- Drift av Buffer Chambers
- Samle alle forsyningen som kreves for en gitt oppgave (foring, splitting, beising, etc.) i begynnelsen for å hindre at en forsinkelse i arbeidsflyten. Rikelig spray alle materialer med 70% etanol og la dem tørke i laminær panseret. Ikke spray flasker eller plater av celler - tørk dem forsiktig med en steril kompress svamp mettet med 70% etanol.
- Sørg for at både de ytre og indre dører av bufferkammeret er lukket og låst. Deretter åpne utenfor døren, og plassere elementene inne.
- Lukk ytterdøren. Innenfor programvaren, velger buffermodul, og klikk på fanen fortynningsfaktoren. Skriv inn en i loggen faktor boksen. Klikk på Start.
Merk: En "fortynningsfaktor" er definert til å bety at buffermodulen atmosfære vilevakueres og erstattet en gang med rent, HEPA-filtrert gass. - Når det grafiske grensesnittet har sluttet å blinke "fortynningsfaktoren", åpner bufferkammeret indre dør og bringe materialene inne i prosesskammeret.
Forsiktig: Ikke la de indre og ytre dører til stadig være åpne samtidig og ikke åpne den indre døren hvis bufferkammeret ikke har gjennomgått en fortynning faktor. - For å fjerne elementer fra prosesskammeret, først sørge for at bufferkammeret har gjennomgått en fortynning faktor. Deretter åpner den indre døren, plassere elementene som skal fjernes inne, og lukk det indre dekselet. Deretter åpner ytterdøren og fjerne elementene.
Merk: En fortynningsfaktoren ikke trenger å bli kjørt før du åpner ytterdøren.
2. Innføring og Feeding Cells
- inkubator Setup
- Plasser 3 petriskåler i vannpannen ved bunnen av hver inkubator. Fyll disse rettene med sterile vann. Ikke direkte fylle vannpannen. Opprettholde vann-nivået i disse rettene, som de er kritisk for å opprettholde den relative fuktighet (RH) innstillingspunkt i inkubatorer.
- Innenfor det grafiske grensesnittet, klikk på inkubatoren. Klikk på den eksisterende verdien for relativ fuktighet (RH) under settpunktet og angi 85%. Klikk på den grønne haken for å akseptere denne verdien.
- Klargjøring av Cell produksjonsanlegg for Cells
- Hvis det ikke allerede har gjort det, justere bufferkamrene, i prosesskammeret, og en inkubator til gasssettpunkter som kreves for den type celle som blir innført.
- Rengjøre overflaten på prosesskammeret med sterilt gasbind og en ikke-brennbar desinfeksjonsmiddel. Ikke bruk pereddiksyre basert desinfeksjonsmiddel, som i et lukket system sterk, dvelende damp er giftig for pattedyrceller. I stedet bruker benzalkoniumklorid-baserte produkter.
- Fortsett desinfisering. Rengjør hansker og overflater som er commoare berørt, for eksempel dørhåndtak. Bruk desinfeksjonsmiddel grundig, men med måte, som overflødig væske i prosessen kammeret vil bidra til fuktighet, kondens og mulig mikrobiell vekst.
- Rengjør overflaten av laminær hette og bufferkammer med 70% etanol, og la det tørke. Plasser kolbe eller plate av celler (i vårt tilfelle, PSC avtaler eller NSC) i panseret, og kort tørk den ytre overflaten med en steril kompress svamp mettet med etanol.
- Sett flasken eller plate i bufferkammeret, og kjøre en fortynning faktor (trinn 1.2.3).
- Ved fullføring av fortynningsfaktoren, umiddelbart gå kolben eller plate til den aktuelle inkubatoren. Som inkubatorer er på baksiden av prosesskammeret, trekker en hylle ut i prosesskammeret for celleplassering. Unngå å åpne inkubator dørene unødvendig eller for lengre tidsperioder, som i prosesskammeret luft er meget tørr i forhold til den av inkubatorer, og vil resultere i en betydeligtap av fuktighet i kuvøsen.
- Fôring cellekulturer
- Samle mellom komponenter, serologiske pipetter, en elektronisk pipette, gasbind og desinfeksjonsmiddel. samle også en avfallsbeholder for brukte cellekulturmedium, men ikke fylle det med blekemiddel. Bringe materialet inn i prosesskammeret gjennom et bufferkammer som beskrevet i avsnitt 1.2. Fremstille cellekulturmedium i prosesskammeret, som tidligere beskrevet 9,10 (se også tabell Materials)
- Ordne materialer på en slik måte at det muliggjør en optimal arbeidsrommet. Unngå å plassere elementer som ikke er i bruk i midten av prosessen kammeret.
- Tillat for middels til likevekt med CO 2 og O 2 nivåer stede i systemet ved å la media beholder litt uncapped. Noen PSC mellom produsenter tyder ikke å varme media ved 37 ºC; Hvis dette er tilfelle, kan du bruke en bufferkammer til likevekt mediet. Tillat megdium til stabilisering i 20 min.
- Fjern det gamle mediet fra brønner ved hjelp av en passende stereological pipette og en elektronisk pipette. For PSC avtaler, fjerne alle unntatt en liten resterende beløpet av gamle medium, nok til å hindre uttørking under fôring prosessen. For NSCs, fjerne halvparten av det gamle mediet. Pipet avfall i avfallsbeholder.
- Legg den brukte pipetten tilbake til sin opprinnelige pakkeren og bevege det til den siden av prosesskammeret, eller inn i et bufferkammer som er angitt for fjerning av avfall. Med en frisk steril serologisk pipette, tilsett frisk medium til cellekulturplater og legg platene tilbake til deres utpekte kuvøse.
- På slutten av fôring, spray gasbind med desinfeksjonsmiddel og rengjør gulvet og dørhåndtak i prosessen kammeret grundig. Hvis det er flere cellelinjer som dyrkes i systemet, sterilisere mellom mater hver cellelinje. Dette bidrar til å redusere risikoen for smitteoverføring.
- Ved ferdigstillelse, fjerne avfalleller andre unødvendige elementer gjennom en av bufferkamrene.
3. Splitting cellekulturer
- Enzymatisk aging av PSC avtaler eller NSCs
- Samle alle elementer som trengs for aging. Dette inkluderer media, enzym eller ikke-enzymatisk celledissosiasjon buffer (sistnevnte er for NSCs bare), dPBS, plater eller kolber, ekstracellulære matrix (ECM), koniske rør, og serologiske pipetter. Bringe dem inn i systemet ved hjelp av en bufferkammer.
- Belegge friske plater eller kolber med ECM, som tidligere beskrevet 9,10. Noen ECM'er -f.eks som de som er avledet fra mus sarkom cellelinjer - er bare væske på mellom 4 og 15 ° C, så bruker en sterilisert kald blokk eller gel is pakningen for å holde ECM kaldt mens arbeider i det oppvarmede prosesskammeret.
- Pipet av brukt medium fra kulturen og kast den i avfallsbeholderen.
- Skyll godt eller kolbe overflaten med 1 ml DPBS / brønn og kast av DPBS.
- Legg 1-2ml varm enzym til hver brønn. Bare svært tette kulturer krever 2 ml.
- Umiddelbart flytte kultur parabol eller kolbe til mikroskopet kammeret, og observere kulturen nøye. Se etter tegn på individuelle celler begynner å løsne av parabolen. Ikke vent til cellene flyte inn i suspensjon før du går videre til neste trinn.
- Returner cellene til hovedprosesskammeret. Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette, tilsett 4 ml DPBS for hver 1 ml enzym, og deretter kraftig pipettér opp og ned for å løsne cellene fra brønnoverflaten. Hvis aging flere brønner i en multiwall plate, tilsett DPBS til hver brønn før løsner cellene fra de enkelte brønnene.
- Overfør enzymet og PBS cellesuspensjon til en passende størrelse konisk rør.
- Hvis en sentrifuge er ikke tilgjengelig i cellen produksjonsanlegg, tett forsegle konisk rør, legg den i en bufferkammer og forsegle døren lukket.
- Fjern den koniske røret fra buffer kammeret fra laminær strømning side og spinne cellene ved 100 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Spray konisk rør med 70% etanol, og bringe det inn i prosesskammeret ved hjelp av en bufferkammer og fortynning faktor.
- Pipette av supernatant og resuspender cellene i 2 ml PSC eller NSC medium. Hvis aging PSC avtaler, sørg for å inkludere ROCK hemmer i mediet ved en konsentrasjon på 10 mikrometer, som tidligere beskrevet 9,10.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer, og bestemme antall brønner eller plater som kreves. Plate PSC avtaler på 5 x 4 til 1 oktober x 10 5 celler / cm 2. Dele NSCs på et 1: 2 forhold.
Merk: NSCs ofte klumpe seg og motstå nøyaktig telling i en hemocytometer. - Hvis nedfrysing av cellene er nødvendig, følger den aktuelle protokollen 9,10, men sørge for at alle forsyninger og frysing media er forberedt på forhånd og plassert inne i prosesskammeret. DMSO er svært giftig for cellene ved 376 C, så fungerer veldig raskt. Hold isopropanol-kappe frysing container ved RT i laminær hette. Når nedfrysing ampullene er fylt og forseglet, umiddelbart fjerne ampullene fra prosesskammeret ved å føre dem gjennom en bufferkammeret.
- Manuell aging av PSC avtaler
- Bekrefte at kulturen må passeres, som tidligere beskrevet 8. I så fall forberede ferske plater eller kolber belagt med ekstracellulære matrise. Deretter endrer mediet helt.
- Rens mikroskop kammer med sterilt gasbind fuktet med en sparsom mengde ikke-brennbar desinfeksjonsmiddel - for mye vil resultere i overkant fogging i kammeret. Bare rengjøre hansker, gulvareal, og scenen. Ta med flere 200 mL eller 1000 mL individuelt pakket pipettespisser inn i kammeret.
- Ta med plate av PSC avtalene mikroskopet kammeret, ta av lokket, og plasser den med forsiden ned på fersk rengjort gulvet. Leaving lokket opp eksponerer under directly for luftstrømmer, og til mulig forurensning.
- Pakke en pipettespiss, og ved hjelp av mikroskop for å visualisere kulturen, plukke fra hverandre kolonier som har god morfologi ved hjelp av tuppen av en pipette.
Merk: pipettespiss kan være festet til en pipette hvis den enkelte brukeren finner det mer behagelig. - Sett lokket på plate, og flytte platen tilbake til prosesskammeret.
- Pipet av overflødig ECM fra den nye platen, og overføre media fra den gamle plate (som inneholder koloni brikker i suspensjon) til den nye platen. Dersom den gamle platen fremdeles inneholder kolonier som ikke er klare til å bli plukket, mate det også.
4. Specialized Kultur Teknikker
- Sendai Transduksjon av fibroblaster i PSC avtaler
- Inne i cellen produksjonsanlegg, utvide menneskelig hud fibroblaster 1 i fibroblast medier som inneholder DMEM / F12, 10% FBS, og 20 ng / ml FGF2, ved 5% O 2. Bruk 6-brønnen kultur dishes belagt med 0,1% gelatin.
- Klargjør cellene som skal omformes ved å dissosiere dem med 1 ml av 0,25% trypsin per brønn. Inaktivere trypsin med 1 ml fibroblast medium. Sentrifugering ved 200 xg, resuspender cellene i 1 ml fibroblast medium, og telle dem ved hjelp av et hemocytometer.
- Resuspender 2,0 x 10 5 celler i 2 ml fibroblast medium, og legge til cellesuspensjonen til en brønn i en gelatin-belagt seks brønn plate (2,1 x 10 4 celler / cm2). Sett cellene tilbake i kuvøse.
- Tillat 24 timer for cellene å feste til bunnen av tallerkenen.
- Plasser frisk fibroblast medium inne i prosessen kammeret (1 ml medium per brønn av celler som skal omsatte), og la det oppnå å gassene.
- Sterilisere en pre-avkjølt kald blokk med 70% etanol og legg den i en bufferkammer. Bruk en gel ispose med hull skåret i den hvis kommersiell kjøling blokk er ikke tilgjengelig.
Merk: Det er 3-4 separate Sendaivirus (avhengig av hvilken versjon av transduksjon kit), som må tines raskt, men holdt i kulden blokken når tint. - Dypp den nederste halvdelen av rørene i en 37 ° C vannbad i 15 sek (ikke senk rørene), deretter umiddelbart rense røret utvendig med 70% etanol. Plasser rørene på den steriliserte kald blokk i bufferkammeret og kjøre en fortynningsfaktor.
- Arbeid raskt, legge det nødvendige volumet av hver Sendai omprogrammering viruset til likevekt medium to. Dette volum blir bestemt av tre variable - antall celler, titeren av hver virus, og den ønskede infeksjonsmultiplisitet for hvert virus. Rådfør settet manual for anbefalte MOI. Formelen er:
[(Antall celler blir transfektert) (multiplisitet av infeksjon) (1000)] / (viral titer) = kreves pl virus - Fjern supernatanten fra brønnen (e) av celler for å være nytt. For hver brønn, tilsett 1 ml av medium som inneholder virus. Rist forsiktig platen, være forsiktig så du ikke søler media, og plasser platen tilbake i 5% O 2 inkubator.
- Etter to timers forsiktig rocke platen igjen og gjenta igjen etter en to timer.
- Etter 24 timer (dag 1 post-transduksjon), mate den godt med 1 ml av pluripotent stamcelle medium. Gjenta på dag to, men ikke fjern medium fra brønnen.
- På dag 3 og 4, endrer halvparten av mediet.
- På dag 5 og utover, endre hele mediet.
- Når kolonier vises, beis kulturen ved hjelp av sterile antistoffer for å bekrefte at koloniene er faktisk pluripotent, som beskrevet tidligere to. Som med fôring celler, sikre at PSC medier som inneholder antistoffer har blitt likevekt til gassene i cellen produksjonsanlegg.
Merk: I en vellykket omprogrammering, bør IPSC kolonier være tilstede ca to uker etter transduksjon en. - Når koloniene har vokst seg storenok, kan du bruke mikroskop for å markere og mekanisk passasje dem på en ECM-belagt plate, som beskrevet i kapittel 3.2.
- Utvide koloniene enten manuelt eller enzymatisk, som tidligere beskrevet 9,10.
5. rydde opp etter daglig bruk
- Legg alle avfallsmaterialer, herunder flytende avfall kolbe, i en steril bufferkammeret. Tørk av overflaten av behandlingskammeret og alle de områdene som har kommet i kontakt med forsyninger med steril kompress og ikke-brennbar desinfeksjonsmiddel.
- Fjern alle faste avfall fra bufferkammeret og kast i riktig avfallsbeholder.
- Kast flytende avfall i en passende avfallsbeholder, eller bare bland med blekemiddel og hell i avløpet. Rengjør avfallsbeholderen med såpe og børste. Sterilisere beholderen med 70% etanol og bevege den tilbake til prosesskammeret via et bufferkammer.
Merk: Det anbefales ikke å bruke blekemiddel iavfallsbeholderen mens den er inne i systemet, som blekemiddel røyk kan resirkulere og skade cellekulturer. - Av hygieniske hensyn, tørke ned foran plast overflaten av systemets behandling kammer med 70% etanol. Dette bidrar til å vaske av svette og huden oljer fra brukerens panne.
- Hvis kondens har bygget seg opp inne i prosessen kammeret, kjøre en fortynning faktor for å fjerne kondens. La det være minst en time for å fullføre.
6. Rutine Non-daglige oppgaver
- Fylle vann retter i cellekultur inkubatorer med sterilt, destillert vann etter behov. Toppen av rettene minst en gang i uken. Imidlertid vil fordampningshastigheten variere basert på hvor ofte inkubator dørene åpnes, vil volumet av væske i kulturer, og inkubator innstillinger.
- En gang i måneden, rekalibrere O 2 og CO 2 innstillinger i alle kamrene. Dette krever bruk av SPAN (kalibrering) gass, som fortsains kjente konsentrasjoner nivåer av O 2 og CO 2 som en standard referanse. Sørg for at det er tilstrekkelig SPAN gasstilførselen før du starter kalibreringen. Systemet bruker bestemte gass-sensorer, som ligger i hver modul, for å oppdage gasskonsentrasjoner; således, ved bruk av høy kvalitet SPAN gasser sikrer at sensorene gir en pålitelig nøyaktig gasskonsentrasjoner.
- Skift hanskene i prosessen kammer og mikroskop kammer på en jevnlig basis. Skift hanskene hver 2. måned, uansett hvor ofte systemet blir utnyttet. Før installasjon, sterilisere nye hansker med desinfeksjonsmiddel. Kjør en fortynning faktor på prosessen kammeret etter at hanskene har blitt erstattet.
Merk: Når strukket over kantene på systemet, nitrilhansker har en tendens til å utvikle hull i områder utsatt for fysisk stress og varme. Dette er normalt og uunngåelig slitasje. - Endre ut sprøytefiltre i alle kamrene hver 6. måned.
- Erstatt eller vaske than forfilterovervåking på laminær hette så snart det begynner å dukke opp skitten.
- Se produsentens dokumenter jevnlig for informasjon om utskifting av store deler.
7. Rengjøring av systemet
- I tilfelle av en stor forurensning begivenhet som påvirker de fleste av cellekulturer, fjerne eventuelle overlevende cellekulturer ut av systemet, eller (hvis mulig) i en upåvirket inkubator.
- Slå av gasskontrollen for alle kamrene, bortsett fra at av upåvirket inkubatorer.
- Fjern den fleksible frontpanelet på apparatet, og ta ut hyller i rustfritt stål fra berørte cellekultur inkubator. fjerner også vannpannen.
- Autoklav inkubator hyller og vann pan, og legg dem tilbake i inkubatoren. Tørk de innvendige overflater av inkubator med 70% etanol. La etanol for å fordampe, og lukke døren inkubator.
- Tørk overflatene av prosessen og mikroskop kammer med et 70%Hanol. Sett frontpanelet på apparatet.
- Tørk de indre overflater av apparatet, herunder at av de berørte inkubator, med ikke-brennbart desinfeksjonsmiddel. La døren til berørte kuvøse åpne, og kjøre en fortynning faktor på prosessen kammeret. Pass på at mikroskop kammer dørene er også åpen.
- For rutinemessig rengjøring av cellekultur inkubatorer, sikre at inkubatoren og prosesskammeret er på samme atmosfæriske innstillinger. Åpne kuvøse døren, og plassere alle cellekulturskåler på overflaten av prosesskammeret.
- Tørk av inkubator hyller og innvendige overflater med ikke-brennbart desinfeksjonsmiddel. La desinfeksjonsmiddel for å fordampe, og flytte cellekulturer tilbake til inkubatoren. Arbeid så raskt som mulig for å unngå dessication av cellekulturer.
Representative Results
Dette manuskriptet beskriver i detalj en celle produksjonsanlegg, og de unike aspektene ved dyrkning celler inne i et lukket system. Hovedtyngden av cellen produksjonsanlegg består av en skreddersydd, lukkede, cellekultur apparat som har en liten plass og kan enkelt plassert innenfor en 6 x 7,5 m 2 rom (figur 2). Ikke på noe tidspunkt er cellene i anordningen utsettes for laboratoriepersonalet eller miljø. Apparatet består av flere moduler: en prosesskammeret, en laminær strømningshette, 2 bufring luftslusen kamre mellom hetten og i prosesskammeret, to cellekultur inkubatorer, og et mikroskop kammer i tilknytning til prosesskammeret (figur 3). Systemet styres av programvare som tillater miljømessige variabler som skal styres og overvåkes (figur 1). Datamaskinen kjører denne programvaren er på en avbruddsfri strømforsyning. Gasser er matet inn the system ved et sett av manifolder for oksygen, nitrogen og karbondioksid (figur 4). Gasser for enheten er levert av manifold-systemer som har to sett med tanker hver - en aktiv sett og en reserve sett. Når det aktive settet blir trukket ned, slår manifold automatisk til reserve stille og ansatte bestille nye tanker. Strømmen er på en backup generator system.
Pluripotent og neurale stamceller kan dyrkes i hypoksiske betingelser i dette anlegget ved hjelp av tidligere utviklet protokoller 9, med den ekstra komplikasjoner som ligger til det nye utstyr. Pluripotente stamceller kan utledes ved hjelp av Sendai-virus, ved hjelp av pluripotency-spesifikke antistoffer for å identifisere fullt transfekterte kolonier, som deretter isolert og ekspandert. (Figur 5A og B), Fra disse iPSCs, neurale stamceller og nevroner kan utledes ved hjelp av to SMAD hemming, og deres fenotype verifisert usi ng NSC-spesifikke antistoffer (figur 5C og D).
Figur 1. Grafisk grensesnitt for Cell produksjonsanlegg. (A) Den grafiske fremstillingen av CPF er standardskjermen og samsvarer med CAD tegning vist i Figur 3. Et klikk på musen over Buffer Modul 1 (2F i figur 1) åpner sin kontrollskjerm (B) hvor O 2 verdier er satt til å samsvare med behandlingskammeret (3 i figur 3). Tilsvarende klikke på Process Chamber eller Inkubator en bringer opp sine respektive kontroll skjermer (C og D, henholdsvis), der verdiene kan endres eller overvåkes etter behov. rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Cell produksjonsanlegg. (A) Systemet sett fra en front rett syn. Legg merke til kraft- og gasstilkoblinger i taket og vogna med mikroskopet tilbehør og datamaskin til høyre. (B) Den laminær hette med tilgangs dørene til buffer modulene sett til høyre. (C) Fremgangsmåten kammer med de to inkubatorer (svarte dører) sett på baksiden. (D) En visning gjennom høyre side av systemet viser mikroskop og skjerm med dørene til bufferkamre sett i det fjerne. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. En CAD tegning av Cell produksjonsanlegg. Alle elementer som kommer inn i enheten først tørkes ned med alkohol og lufttørket i laminær hette (1). Elementer blir deretter overført til det passende atmosfære i frontbuffermodulen (2F) før de føres inn i UCPC modul, eller prosesskammeret (3). Celler dyrkes i de to inkubatorer (4, 5). Levende cellefarging, koloni plukking, vurdering av generell cellulær morfologi og migrasjonsanalyse finner sted i UPC modul, eller mikroskop kammer (6). Til slutt, avslutter avfall systemet gjennom den bakre buffer modul (2R). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. < / P>
Figur 4. Kilder til gasser og makt. (A) CO 2 manifold er en 4 x 4 oppsett som den leverer alle inkubatorer i laboratoriet. (B) O 2 manifold er en 2 x 2 oppsett og forsyninger bare cellen produksjonsanlegg. Nitrogen for systemet er generert i en fordamper (C, like nedenfor Markeingslys) festet til en flytende nitrogen manifold (til høyre) som også fyller automatisk cryofreezers (nederst til venstre). Manifolden er en 2 x 2-oppsett drives av to par 160 L flytende nitrogen stridsvogner. CO 2, O 2, og N-2 leveres fra taket gjennom shutoffs (D). Hus vakuum er også levert på dette stedet. Sett like bak levere gass shutoffs er et par strømkabler som leverer strøm til systemet.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Pluripotent stamceller Avledet i Hypoksi med Sendai-virus. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenklatur som finnes i Stover et al. 9), fasekontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs levende farget med AF-594-merket Tra-1-60, 1: 100 fortynning i media. Alle iPSCs ble omformet i cellen produksjonsanlegg i 5% O 2 med Sendai-virus. (C) Fase kontrasten SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 IPSC-avledet NSCs, vokst med 5% O 2 i kammer lysbilder. Celler ble deretter fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med anti-humant nestin primært antistoff, og Alex-488 sekundært antistoff. Alle skala barer er på 1001; m. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Celler dyrket innenfor CPF se noen endringer i oksygen eller karbondioksid konsentrasjoner som de beveger seg fra inkubatoren til behandling kammer mikroskop kammer og tilbake. Det er viktig at forholdene i hvert kammer er tilpasset til den spesielle kuvøse hvor cellene holdes før cellene blir fjernet fra inkubatoren. Atmosfæren i anordningen er kontinuerlig HEPA-filtrert og kan tilpasses med hensyn til oksygen og karbondioksid konsentrasjoner. Cellene kan dyrkes ved standard konsentrasjoner på pscs eller NSCs, 5% og 9%, henholdsvis; eller alternative konsentrasjoner kan velges for forskjellige celletyper eller spesifikke eksperimenter. Dermed er anordningen forsynt med konstante kilder til medisinsk kvalitet oksygen, karbondioksid og nitrogen (figur 4). Alle tre av disse gassene er levert av gass-spesifikke manifoldsystemer som sikrer konstant forsyninger. Apparatet er også forsynt med et kalibreringsgassblanding bestående av10% (± 0,01%) karbondioksyd i oksygen. De manifold-systemer er plassert utenfor cellen produksjonsanlegg og gassene føres inn i anlegget gjennom taket. Kalibrerings gass ligger innenfor innretningen. Apparatet er i tillegg forsynt med husvakuum, også gjennom taket. Ved hjelp av et elektronisk overvåkingssystem og trådløse senderenhetene, er utgangs presset fra alle manifolder konstant overvåket. I tilfelle at noen trykket faller utenfor rekkevidde, blir cellen produksjonsanlegg operatører automatisk ringte og varslet slik at nødvendige tiltak kan iverksettes.
Strømkravene til apparatet blir møtt av seks dedikerte 120 V kretser synkende fra taket og koblet til sykehusets back-up generatorer for å sikre en konstant tilførsel. Drift av apparatet styres via programvare på en PC-basert datamaskin drevet gjennom en avbruddsfri strømforsyning. Disse kraft og PC ordningersikre at systemet fungerer kontinuerlig selv i tilfelle av en offentlig makt systemsvikt. Programvaren styring av anordningen har et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (figur 1), som gir mulighet for kontroll av oksygen og karbondioksid konsentrasjoner, så vel som temperatur, fuktighet, og kammertrykk. Verdiene for alle disse parametrene blir kontinuerlig registrert for å tilveiebringe en løpende registrering av alle apparater parametere. Denne informasjonen er støttet opp på en ekstern server hver natt for å beskytte sin integritet. Datamaskinen og programvaren kan nås eksternt av administrative brukere til å vurdere og / eller endre noen parameter. I tillegg kan maskinen og programvaren hentes eksternt, slik interaktiv vurdering av apparater parametere og feilsøking med lokale brukere. En ytterligere alarmsendeenhet er koplet til anordningen, slik at celleproduksjonsanlegg operatører blir varslet om en hvilken som helst ute-av-rekkevidde tilstand av anordningen. Fjerntilgangs capabilities tillate logg inn og vurdering av detaljene i out-of-range tilstand.
Apparatet er utformet som et modulsystem både i makro- og mikro forstand. Individuelle cellekultur moduler, for eksempel kuvøser og behandlingskamre, kan tilpasses i forhold til sine dimensjoner og krav, samt i sin layout i forhold til hverandre. I tillegg er de fleste av de styrefunksjoner til de individuelle modulene er selv modulær slik at de enkelte atmosfæriske gassstyringer, for eksempel, kan lett skiftes ut uten vesentlig avbrudd i systemet.
Spesialisert behandling kamre, slik som en for mikroskopisk visualisering og manipulering av cellekulturer, kan lett tilpasses til systemet. Både fase-kontrast og fluorescens mikroskop er inne i systemet (figur 6), slik at cellene kan bli direkte farget, og kolonier kan dissekert under de samme atmosfæriske betingelser som inne than inkubatorer. Ruting av kabler gjennom forseglede maljene i sideveggene i behandlingskammeret gjør det mulig for utstyr som strømforsyning og datamaskiner å bli holdt utenfor anordningen, vanligvis på en vogn (figur 6).
Foredlings kamrene i cellen produksjonsanlegg har et annet mønster enn konvensjonelle luftstrøm BSC. I konvensjonelle BSC, strømmer luftstrømmen ned fra en sentral utløpskanal og splittes i to separate strømmer, som deretter tas opp av to forskjellige inntaksåpningene i den fremre og aktre del av kabinettets gulvet. I motsetning til dette har den CPF en enkelt ventil i den forreste del av taket. Luft strømmer nedover og mot baksiden av kammeret, hvor det blir så trukket oppover inn i en luftinntaksåpningen. Selv om CPF er i seg selv meget ren, betyr dette unike luftstrøm mønster som teknikere må justere litt sin teknikk for å redusere risikoen for forurensning. Som ved en konvensjonell BSC, en lab arbeideren should Unngå å plassere hendene oppstrøms åpne cellekulturplater og medie flasker. Imidlertid har den retning som er oppstrøms blitt endret på den CPF
Cellen produksjonsanlegg laboratorium i seg selv er ganske standard og er utstyrt med en -20 ° C fryser, en -80 ° C fryser, en 4 ° C kjøleskap, en sentrifuge, og et vannbad. Laboratoriet har også en vask med fotkontroller for praktisk håndfri betjening. For at dette laboratorium for å bli en funksjonell klinisk celle produksjonsanlegg imidlertid flere ytterligere modifikasjoner må likevel bli gjort. For det første må innretningen i seg selv bli oppgradert for å ha kapasitet til å overvåke flyktige organiske forbindelser, partikler, og konsentrasjoner av klordioksyd som brukes til rensing. For det andre, kan et behandlingskammer som inneholder en FACS maskin være plassert og koblet til resten av apparaturen via en buffermodul. Dette vil muliggjøre cellesortering og rensing av transplantable celle populasjoner under riktige miljøforhold. Til slutt, må hele anordningen rommes i en myk vegg rent rom. Dette gir en International Organization for Standardization (ISO) klasse 8 miljø for apparatet fem.
Den høye sterilitet og datastyrt natur CPF gjør det til et ideelt system for fremtidige applikasjoner med cellebasert terapi og gode produksjonsprosesser. Risikoen for forurensning er sterkt dempet, men enda viktigere, er betingelsene for celle ekspansjon automatisk registrert og arkivert av datasystemet. Avvik i gasskonsentrasjoner, temperatur, fuktighet og alle arrangementer for tilgang til systemet er grundig dokumentert. Dette kan i stor grad hjelpe når undersøke produktkvalitet problemer. Det er imidlertid fremdeles begrensninger. Bruken av enhver og alle reagenser og forbruksmateriell (for eksempel mediekomponenter, pipetter, plater) må dokumenteres separat. Legg tilitionally, er det et mangfold av potensielle problemer (inkludert mange former for menneskelige feil) som kan oppstå som er fullstendig irrelevant for variablene dokumentert av CPF monitorsystem. Dermed blir behovet for høyt utdannet personell og detaljert manuell dokumentasjon av oppgaver er fortsatt på plass.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke de ansatte på Biospherix for deres hjelp i å lære å bruke Xvivo vedlagte cellekultur system, spesielt Matt Freeman; de ansatte i Miles & Kelley Construction Company, Inc. for sitt arbeid i å sette opp laboratorieinfrastruktur, spesielt Russ Hughes; de ansatte på Barnas Hospital of Orange County avdeling Fasiliteter og støttetjenester for sitt arbeid med å samordne laboratoriet oppussing, spesielt Adam Lukhard og Devin Hugie; de ansatte på Barnas Hospital of Orange County avdeling av informasjonssystemer for deres hjelp i å sette opp dataadministrasjon infrastruktur og fjerntilgang, spesielt Viet Tran; Barnas Hospital of Orange County ledergruppen for sin mangeårige støtte til prosjektet, spesielt Dr. Maria Minon og Brent Dethlefs. Dette arbeidet ble finansiert av Barnas Hospital of Orange County og California Institute for Regenerative Medicine gjennom tilskudd TR3-05476 til PHS. Alle forfattere bidratt likt til dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
