Protocol
1. Manter a auto-renovação em células IMOP
- Prepare IMOP meios de cultura: DMEM / F12, suplemento B27 1X, 25 ug / ml e carbenecillin 20 ng / ml de bFGF. Adicione 50 ml de meio de cultura IMOP utilizando reagentes estéreis. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °.
- Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas, esterilizadas por filtração para 5 min num banho de água a 37 ° C. Descongelar a 100 ug / ml de bFGF aliquota à TA. Adicionar 1 ml de 50X B27, 10 ul de 100 ug / ml de bFGF e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12.
- Use 3 ml de mídia em uma placa de 60 mm de cultura de tecidos para as células de cultura IMOP. Adicionar meio fresco às culturas a cada dois dias, dobrando o volume de mídia. Certifique-se de que a concentração de bFGF não cai abaixo de 5 ng / ml.
- IMOP células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. Células Passage após 5 - 7 dias em cultura como listadas nas etapas abaixo. Transferência de cultura até uma 15ml cônico com uma ponta de pipeta 10 ml.
- Adicione 1 mM de EDTA em HBSS por diluição de 0,1 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0 em 50 ml de HBSS. Pré-quente EDTA 1 mM feita em HBSS em um banho de água a 37 ° C.
- Células colheita por sedimentação gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 minutos. à TA. Por sedimentação por gravidade, colocar o cónico de 15 ml contendo as culturas no incubador a 37 ° C durante 5 - 10 min. Após esse tempo, observar os otospheres se acumulem na parte inferior da cónico de 15 ml.
NOTA: força centrífuga excessivo pode causar danos às células. - Cuidadosamente aspirado gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração sem perturbar o sedimento celular. Adicionar 0,5 ml de solução de pré-aquecido a 1 mM EDTA HBSS para a célula sedimento. Com uma pipeta P1000, pipetar suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Coloque cónica a 37 ° C e incubar durante <5 minutos para facilitar a dissociação em células individuais.
- Agite suavemente a solução de células para determinar se otospheres são dissociados. Se nenhum otoesferas sedimentem no fundo do cone, as células são dissociadas. O tempo de incubação pode variar.
NOTA: prolongada incubação com EDTA pode resultar em morte excessiva de células. - Remover as células a partir de 37 ° C, adiciona-se 2 ml de meio para neutralizar e diluir o EDTA. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar diluída EDTA usando uma pipeta 2 ml de aspiração e adicionar 5 ml de 1X PBS para lavar as células.
- Girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar para fora 1X PBS utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração. Ressuspender as células utilizando uma pipeta P1000 em 0,5 ml de meio de cultura IMOP cuidado pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes.
- Contagem de células utilizando um contador de partículas microfluídico com as fitas apropriadas 28. Uma placa confluente de células IMOP conterá ~ 6 X10 6 células. Dilui-se as células de 1: 100 em meio e adicionar 75 ul de uma solução de células para a cassete para contagem. Placa 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no IMOP culture meios (~ 1: 10 de diluição). IMOPs passagem a cada 5 - 7 dias.
NOTA: As células que formam grandes otospheres ou se ligam à parte inferior do prato de cultura de tecidos irá diferenciar. As células também vão morrer se as culturas são mais confluentes.
2. congelamento e descongelamento IMOP Cells
- Preparar o meio de congelamento e descongelamento sintética por equilibrar a solução a 4 ° C antes de serem células de congelação.
- Recolher as células a partir de um disco de 6 cm confluente de células IMOP. Usar uma pipeta de 10 mL e de transferência de células (~ 6 - 8 x 10 6 células) num cónico de 15 ml.
- Células colheita por sedimentação por gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Se os otospheres são pequenas, as células não vai resolver por gravidade sedimentação. Opcional: Contagem de células usando passo 1,9 para determinar o número de células totais.
- Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml aspiração, deixando o sedimento de células solto para trás.
- Adicionar 0,25 ml de meio de congelamento sintéticos para voltar a suspender ceLLS a uma densidade de 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 células / ml. Pipeta suavemente as células com uma pipeta P1000. Transferir a suspensão de células para frascos criogénicos usando uma pipeta P1000 com 1 ml filtrados ponta.
- Colocar os tubos em um recipiente de congelamento de álcool livre e colocar o recipiente de congelação a -80 ° C para reduzir a temperatura de 1 ° C por minuto até a temperatura atingir -80 ° C.
- Para armazenamento a longo prazo de células, transferir os tubos de ensaio para a fase de vapor de um tanque de armazenamento de azoto líquido. Para descongelar células para a cultura, equilibrar criotubo contendo as células congelados a -80 ° C.
- Pré-quente meios de cultura IMOP em um banho de água a 37 ° C.
- Descongelar o frasco congelado rapidamente por agitação na parte inferior do frasco num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 mL de meios de cultura pré-aquecido a IMOP células descongeladas uma vez que o último cristal de gelo desaparece. Transferência de células para a 15 ml cônico e adicionar um adicional de 4 ml de meio de cultura IMOP
- Gire a 15 ml conica durante 5 min. a 200 xg e aspirar o meio gasto. Ressuspender as células em 2 ml de meio de cultura de células e IMOP placa num prato de 6 cm. Incubar as culturas a 37 ° C com 5% de CO 2 para a expansão.
3. diferenciação de células IMOP em Sensorial Epithelia
- Prepare 50 ml de IMOP media diferenciação epitélio sensorial: DMEM / F12, suplemento 1X B27, 25 ug / ml carbenecillin. Faça 50 ml de IMOP sensorial media diferenciação do epitélio. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °. Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas para 5 min. num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12.
- Para a colheita, se dissociam, ressuspender e contagem de células repetir os passos 1,4-1,9
- Placa 1 X 10 6 células num prato de 6 cm no dia -3 IMOP utilizando meios de cultura. No Dia 0, as culturas de transferência utilizando uma pipeta de 10 ml para uma cónico de 15 ml. Recolher o otoesferas por gravidade sedimentação como indicado na etapa 1.6. Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres na parte inferior do cone.
- Delicadamente adicionar em 2 ml de diferenciação do epitélio sensorial mídia. Transferência otospheres para um prato de 6 cm, usando um grande furo pipeta de 10 mL.
NOTA: corte mecânica de pipetagem dura pode dissociar as células dos otospheres. - Adicionar 2 ml de meios sensoriais diferenciação epitelial fresco às culturas a cada dois dias. Se necessário, as células podem ser coletadas por sedimentação gravidade e mídia substituído.
- Recolha otospheres no dia 10, transferindo para a 15 ml cônico e permitindo que os otospheres para sedimentar como indicado na etapa 1.6.Aspirate os meios gastos usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres imperturbável.
- Fix otospheres por incubação em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min à TA. Remover solução de formaldeído, lavar otospheres com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h.
- Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com 1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100 sujeita a otosphere para imunocoloração 27. Transferência otospheres em 1X PBS e colocar otospheres em meio de montagem numa lâmina de vidro usando uma pipeta P1000. Coloque uma lamela sobre a amostra e permitir a montagem de meios para secar a 4 ° C.
- Adquirir imagens de epifluorescência, utilizando uma configuração de microscópio invertido equipado com uma câmera CCD de 16 bits e quer um ar 20X 0,75 ou um NA objetivo de imersão em óleo de 40X 1.3. Recolha de fluorescência de diferentes canais de cores usando a comprimentos de onda listado (excitação e emissão): azul (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), vermelho (562 ± 20nm / e 625 ± 20 nm) e infravermelhos (628 ± 20nm / e 692 ± 20nm).
4. Assaying EdU Incorporação
- No Dia -3, placa 1 x 10 6 células IMOP em um disco de 6 cm. Três dias mais tarde, no dia 0, colheita, dissociar, ressuspender e contar as células, repetindo os passos 1,4-1,9.
- Placa de 2,5 x 10 5 células em meio de cultura e IMOP 5 x10 5 células em diferenciação epitélio sensorial meios diferentes em poços de uma placa de 6 poços.
- Determinar a percentagem de células em fase S por EdU incorporação no dia 3 utilizando um ensaio de incorporação de EdU
- Adicionar estoque EdU directamente às culturas IMOP para se obter uma concentração final de 1 uM EdU no meio de cultura.
- Incubar EdU em culturas IMOP durante 2 horas e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Colheita, dissociam e coletar células repetir os passos 1,4-1,9. Adicionar em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min. à TA para fixar as células. Células colheita por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remoção da solução de formaldeído e properly dispor.
- Núcleos do rótulo de células com Hoechst e incorporada EdU com verde fluorescente dye-azida de acordo com o protocolo do fabricante.
NOTA: Todas as lavagens são feitas com 1X PBS, BSA a 3% e 0,1% de células Tween 20. Lavar com 1X PBS duas vezes. - Células de montagem em um slide usando antifade reagente e coloque um copo 1,5 tampa sobre a amostra. Adquirir imagens fluorescentes de células marcadas utilizando um microscópio de epifluorescência.
5. Diferenciar neurônios derivados-IMOP
- Adicione 50 ml de meio de diferenciação neuronal: meios Neurobasal, 1X suplemento B27, 2 mM de L-Glutamina. Descongelar garrafa de 50X B27 e 200 mM de L-glutamina em 37 ° C num banho de água durante 5 min. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 0,5 ml de 200 mM de L-glutamina, para 48,5 ml de meio neurobasal.
- Brasão lamela, colocando 12 mm redondas 1,5 lamelas de vidro em um estéril placa de 10 cm e adicionar 70% EtOH a placa para esterilizar e limpar as lamelas.
- Agite suavemente a enseadarslips para garantir que eles estão cobertos de etanol. Deixar a placa durante 10 minutos à TA. Lavar as lamelas 3 vezes com estéril 1X PBS para lavar o etanol remanescente. Lavar as lamelas uma vez com H 2 0 estéril para lavar restante 1X PBS.
- Aspirar o H 2 0 usando a 2 ml de aspiração pipeta e deixar as lamelas seco. Expor as lamelas a luz UV na capa de tecido de cultura durante 15 min. Loja lamelas em um ambiente estéril se não for usado imediatamente.
- Coloque uma lamela 12 milímetros rodada em cada poço de um prato de 24 poços. Agitar placa suavemente para assegurar que as lamelas ficar na posição horizontal na parte inferior do poço.
- Descongelar 2 mg / ml de poli-D-lisina da solução à TA e diluir para uma concentração de 10 ug de poli-D-lisina / ml em 1X PBS. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de poli-D-lisina para os poços. Deixar a placa na incubadora a 37 ° C durante 1 h.
- Lavar os poços 3 vezes com PBS estéril 1X. Descongelar / solução de estoque de 10 mg mL laminina à RT e dilui-se a 10 ug / ml em PBS 1X. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de laminina solução de trabalho em um único poço de uma 24 multi-poços prato. Incubar a placa a 37 ° C incubadora. Aspirar a solução laminina utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração.
- Lava-se a lamela 3 vezes com PBS 1X, adicionando em 1 ml de PBS 1X com uma pipeta P1000 e remover o PBS 1X por aspiração com uma pipeta de 2 ml de aspiração. Deixar 1X PBS a partir última lavagem no poço até que as células estão prontas a ser revestida. Iniciado diferenciação neuronal pela colheita, dissociando e contagem de células em passos 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no Dia -3.
- No Dia 0, colheita, dissociar e contar as células repetindo 1,4-1,9. Semente de 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 células em 0,5 ml IMOP media diferenciação neuronal pré-aquecido por cavidade em um 24 multi-poços prato. Aspirar e adicionar meios diferenciação neuronal pré-aquecido para culturas em dias alternados.
- Corrigir neurônios IMOP derivados em formaldeído 4% por 15 min. umat RT no dia 7. Remover solução de formaldeído, lavar neurónios IMOP derivados com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h.
- Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS 1X contendo 0,1% de Triton X-100 As células sujeitas a imunocoloração 27. Lavar a lamela com 1X PBS, antes de colocar em suportes de montagem. Permitir que os meios de montagem para secar a 4 ° C antes de adquirir imagens de epifluorescência como listado no passo 3.8.
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Representative Results
bFGF retirada diminui a proliferação em células IMOP
Para diminuir a capacidade proliferativa de células IMOP e iniciar a diferenciação de células IMOP, bFGF foi retirado das culturas. Para confirmar que o fator de crescimento retirada diminui a proliferação, EdU incorporação foi empregado como um ensaio de proliferação. Foi comparada com a percentagem de células que incorporaram EdU de otospheres cultivadas com meio de cultura IMOP (contendo bFGF) e cultivadas em meios otospheres epitélio sensorial (sem bFGF). Otosphere culturas foram pulsadas com o análogo de nucleótido EdU, colhidas e fixo. Nucleotídeos Incorporated Edu foram fluorescente etiquetado com AlexaFluor 488 azida utilizando click-química. As células de otospheres crescidas na ausência de bFGF mostrou diminuição da incorporação de EdU relativamente a células cultivadas com bFGF (Figura 1A-F). À medida que o tamanho óf o otosphere aumentada, que era cada vez mais difíceis de visualizar a partir de todas as células do otosphere com um microscópio de epifluorescência. Para resolver esta questão, células foram dissociadas e montado de modo a que possam ser visualizados sem ambiguidades em massa. Mesmo após a dissociação e a fixação, as células re-agregados. Para manter as células num estado dissociado, detergentes que impediram que as células a partir de re-agregação foram testados. Tween 20 foi um dos detergentes que impediram re-agregação das células. As células dissociadas foram lavadas com 0,1% de Tween 20 e montadas em lâminas. Edu células marcadas foram então visualizadas por microscopia de epifluorescência (Figura 1G, H). Os resultados representativos das experiências individuais (n = 5) mostraram um decréscimo significativo na percentagem de células marcadas EdU de 48% para 19% após 3 dias após a retirada do bFGF (p <0,005). Estes resultados confirmam uma queda dramática na percentagem de células em fase S e potencial proliferativo de células após IMOPretirada bFGF.
Derivados de IMOP Sensorial Epithelia Expresso Cdkn1b e Show Alterações Morfológicas
Um cronograma de IMOP protocolo de diferenciação epitélio sensorial é mostrado (Figura 2A). Otospheres de culturas proliferativas foram dissociadas em células isoladas e deixadas recuperar durante 3 dias em meio de cultura IMOP. Este método ajuda a enriquecer a proliferação de células e seleciona contra células pós-mitóticas nestas culturas de partida. Após 3 dias, otospheres recentemente formadas foram semeadas em meios de diferenciação do epitélio sensorial e deixada a sofrer diferenciação não-dirigida para 10 dias. As imagens de campo claro de culturas típicas que contêm otospheres em diferentes pontos de tempo após a sementeira mostrou uma diminuição inicial no tamanho antes de começar a aumentar otospheres em tamanho (Figura 2B-E).
27. Para determinar se a expressão de Cdkn1b (p27 KIP) pode ser usado como um marcador para a diferenciação, otospheres de culturas epiteliais diferenciadas IMOP proliferativas ou sensoriais foram comparados. Marcadores fluorescentes foram visualizados e capturado por microscopia de epifluorescência. Imagens representativas de otospheres de culturas proliferativas mostrou baixa expressão de Cdkn1b fora dos núcleos com quase nenhuma coloração faloidina (Figura 3 AD). Otospheres cultivadas em meios diferenciação epitélios sensoriais mostraram aumento da expressão concomitante de Cdkn1b nuclear com a aparência de rotulagem faloidina nas arestas periféricas de células (Figura 3 EH). Em proliferam otospheres IMOP, CDH1 (E-cadherin) e são fracamente faloidina marcada (Figura 3 IL). Em otospheres IMOP diferenciadas, faloidina pronunciada e rotulagem CDH1 destacar as alterações morfológicas nos filamentos de actina e regiões de adesão célula-célula (Figura 3 MP), semelhante aos resultados anteriores 27. Durante a diferenciação epitélio sensorial, as alterações morfológicas nos filamentos de actina paralela a aparência de expressão CDH1 em locais de adesão entre as células. Neste protocolo, o aumento da expressão Cdkn1b juntamente com as mudanças na phalloidin e CDH1 servir como indicadores precoces de diferenciação em células de epitélio sensorial IMOP.
Neurônios Expresso Cdkn1b e Tubb3 derivados de IMOP
Um esquema do protocolo IMOP diferenciação neuronal é mostrado (Figura 4A). Semelhante ao protocolo acima referido, as células foram dissociadas IMOP e allowed para recuperação durante 3 dias em meio de cultura IMOP. Otospheres foram colhidos, dissociados em células singulares e semearam-se sobre poli-D-lisina e laminina revestido lamelas. As células foram deixadas diferenciar durante 7 dias. Representativos imagens brilhantes de campo em pontos de tempo exibidos alterações morfológicas progressivas como eles diferenciadas em neurônios IMOP derivados (Figura 4B-E). Ao dia 7, neurites longas pode ser visto que se estende desde os corpos celulares (setas Figura 4E). Para determinar as mudanças nos níveis de Cdkn1b expressão durante a diferenciação neuronal, proliferação de células e neurônios IMOP IMOP derivados foram comparados. Otospheres foram marcadas com anticorpos Hoechst e Cdkn1b. IMOP células em proliferação de otospheres teve poucas células com baixa expressão Cdkn1b nuclear (Figura 4 FH). Além disso, os neurónios derivados de IMOP mostrou um aumento no número de células com expressão nuclear Cdkn1b 7 dias após a diferenciação neuronal (Figura 4IK). Para determinar se as células foram Cdkn1b adopção de uma linhagem neuronal, rotulagem dos neurónios IMOP derivados com o marcador neuronal Tubb3 foi feito. Imagens representativas de neurônios IMOP derivados mostraram co-rotulagem de Cdkn1b e Tubb3 (Figura 5 AD). Ampliação e quantificação de neuritos a partir destas células mostrou uma média de 1,5 neurites associados com cada célula Tubb3 marcado (n = 60) (Figura 5 EG). No nosso protocolo de diferenciação neuronal, a imunocoloração com Cdkn1b Tubb3 e pode ser usado como um indicador de diferenciação em neurónios derivados de IMOP bipolar ou pseudo-unipolares.
Cdkn1b Nuclear Aumentar os níveis de expressão após o início da Diferenciação
As alterações morfológicas nos otospheres mostram mudanças qualitativas em células IMOP como eles sofrem diferenciação. Para alcançar resultados quantitativos do IMMUnofluorescence imagens para indicar eventos diferenciação precoce, a intensidade de fluorescência nuclear de Cdkn1b a partir de células individuais em proliferação IMOP (n = 239 células) e submetidos a diferenciação IMOP epitélio sensorial (n = 246) foram medidos. Para normalizar os sinais de fluorescência de Cdkn1b experiências independentes, a razão entre Cdkn1b à Hoechst fluorescência a partir de células individuais foi determinada. Os histogramas da intensidade de fluorescência normalizada de Cdkn1b de células em proliferação IMOP (preto) e epitélios sensoriais diferenciam células IMOP (vermelho) foram representados graficamente (Figura 6A). Foi observado um aumento no número de células que expressam elevados Cdkn1b como uma mudança para a direita do histograma para a diferenciação do epitélio sensorial (vermelho) em relação ao histograma para células em proliferação IMOP (preto). Para determinar o aumento da percentagem de células que expressam Cdkn1b, um limiar de intensidade de fluorescência para as unidades normalizadas Cdkn1b (0,65) foi ajustado (ponta de seta) e a percentagem de células abo ve o limite foi determinado. Depois de diferenciação epitélio sensorial, as células IMOP apresentado um aumento de 25,3% para 67,1% de células que expressam Cdkn1b (Figura 6B). A mesma análise quantitativa foi aplicada aos neurónios IMOP derivados. Ao comparar as células IMOP proliferativa (n = 525) e neurônios derivados de IMOP 7 dia (n = 583) uma mudança para a direita no histograma associado com neurônios derivados de IMOP foi observada em relação ao histograma para células em proliferação IMOP (Figura 6C). A determinação da percentagem de células acima do limiar revelaram um aumento das células que expressam Cdkn1b de 23,5% para 85,5% (Figura 6D). Utilizando os protocolos descritos, a análise quantitativa da expressão Cdkn1b confirmou um aumento no número de células que regulam positivamente Cdkn1b durante epitélio sensorial e a diferenciação neuronal. Os números aumentados de células que expressam Cdkn1b pode ser usado para confirmar a diferenciação de células IMOP nesses protocolos.
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Figura 1. EdU Incorporação como um ensaio para determinar o estado proliferativo das Culturas IMOP. IMOP derivado otospheres cultivadas na presença de bFGF. Os núcleos das células foram marcadas com (A) e Hoechst (B) EdU AlexaFluor 488. (C) imagem mesclada de Hoechst e Edu fluorescência. Otospheres cultivadas 3 dias em meios carentes de bFGF. Células provenientes de culturas foram marcadas com (D) e Hoechst (E) EdU AlexaFluor 488. (F) imagens mesclada de Hoechst e Edu rotulagem. Imagens de fluorescência de Hoechst intercalados (magenta) e EdU (verde) células marcadas após dissociação otospheres e lavagem com 1X PBS contendo 0,1% de Tween 20. As células foram cultivadas a partir de otospheres (G) na presença de bFGF ou (H) ausência de bFGF. Comprimento de escalabarras são de 10 um, salvo indicação em (I) Percentagem de edu. células marcadas a partir de células IMOP cultivadas na presença ou ausência de bFGF. O número de células individuais analisados foi denotado dentro das barras do gráfico de barras de erro e foram descritos como erro padrão da média (SEM). As contagens de células foram a partir de n = 5 experiências independentes. O teste t de Student foi realizado para determinar a significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquema Geral da Sensorial Epithelia Diferenciação. (A) Timeline para diferenciar células IMOP em epitélio sensorial. O gráfico de linha indica o tempo de dissociação celular e alterações na mídia. (B) contraste de fase típicaimagens de otospheres No dia 0, (c) 3, (D) e 7 (E), 10 durante a diferenciação epitélio sensorial não guiado. Comprimento da barra de escala é de 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. expressão de marcadores indicativos de interrupção do ciclo celular e diferenciação em derivados de IMOP Sensorial Epithelia. Otosphere de células IMOP cultivadas em meios de cultura IMOP. Os núcleos das células foram marcados com (A) e Hoechst anticorpo (B) Cdkn1b. Actina filamentosa foi marcado com (C) faloidina. (D) A imagem mesclada de um otospheres típicas contendo células em proliferação IMOP. Otospheres de células foram cultivadas em IMOP epith sensorialElia meios de cultura durante 10 dias. As células de otopsheres foram marcados com (E) Hoechst, (F) e Cdkn1b (L) faloidina. (H) imagem mesclada de otospheres mostrando aumento Cdkn1b e rotulagem phalloidin. Otospheres proliferação foram marcadas com (I), Hoechst, (J) CDH1, (K) faloidina. (L) A imagem mesclada mostra fluorescência fraca de estes marcadores. Otospheres diferenciadas em epitélios sensoriais também foram marcados com (H) Hoechst, (N) CDH1, (S) faloidina. (P) A imagem mesclada mostra forte marcação típica CDH1 e phalloidin. Comprimento de barras de escala são 10 um a menos que indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Esquema Geral de Diferenciação Neuronal. (A) Timeline para diferenciar células IMOP em neurônios. Imagens de contraste de fase de células IMOP submetidos a diferenciação neuronal em (B) Dia 1, (C) 3, (D) 5 e (E) 7. pontas de seta apontam para as neurites. As imagens de fluorescência de células cultivadas como otospheres IMOP em meios de cultura IMOP marcadas com (F) e Hoechst (L) Cdkn1b. (H) imagem mesclada de células marcadas com Hoechst e Cdkn1b. As imagens de fluorescência de células IMOP após 7 dias de cultura em meio de diferenciação neuronal. Os núcleos das células foram marcadas com (I) e Hoechst (J) Cdkn1b. (K) imagem mesclada de células marcadas com Hoechst e Cdkn1b. Comprimento de barras de escala são 10 um a menos que indicado. om / files / ftp_upload / 53692 / "target =" _ blank 53692fig4large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A expressão de marcadores moleculares indicativo de saída do ciclo celular e diferenciação neuronal. IMOP células 7 dias após a diferenciação neuronal. Os núcleos foram rotuladas com (A) a Hoechst, (B) Tubb3 (β-tubulina neuronal) anticorpos para destacar a morfologia celular e anticorpos (C) Cdkn1b. (D) imagem mesclada com a rotulagem de Cdkn1b e Tubb3 em células individuais. Comprimento da barra de escala é de 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. Um único quantitativa da intensidade da fluorescência celular Análise de Cdkn1b. (A) da intensidade de fluorescência de expressão Normalizada Cdkn1b foi determinada calculando a proporção de Cdkn1b e Hoechst intensidade de fluorescência a partir de células individuais. A intensidade de fluorescência foi representado graficamente normalizada em relação ao número de células como um histograma. Normalizado de intensidade de fluorescência a partir de células em proliferação Cdkn1b IMOP cultivadas na presença de bFGF (preto) e otospheres IMOP diferenciadas em epitélio sensorial (SE) (vermelha) são mostrados. Um limite foi fixado em 0,65 unidades normalizadas intensidade de fluorescência (seta) (B) Percentagem de células que expressam IMOP Cdkn1b acima do valor limiar, a proliferação (preto) e epiteliais diferenciadas culturas sensoriais (vermelho). (C) Incorporada imagem fluorescente de células epiteliais diferenciadas IMOP sensoriais marcadas com anticorpos Hoechst e Myo6. (D (E) Percentagem de células que expressam IMOP Cdkn1b de proliferar (preto) e diferenciação neuronal culturas (vermelho). As células individuais foram utilizados para a análise indicado em cada gráfico de barras. Os resultados foram compilados a partir de diferentes experiências (n = 3) e as barras de erro representadas como SEM. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística. (F) Incorporada imagem fluorescente de bipolar ou neurônios derivados de IMOP pseudo-unipolar marcadas com Hoechst e Tubb3. Comprimento de barras de escala são 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Cultura Celular Vessel | Surface Área (cm 2) | Número de células semeadas para manutenção de rotina | Número de células semeadas para Sensorial Epithelia Diferenciação | Número de células semeadas para a diferenciação neuronal | Escala Relativa Fator e 60 mm Dish | Volume de mídia utilizada (ml) | |
| Placas Multwell | |||||||
| 96 | 0,3 | 10.000 | 20.000 | 10,000-50,000 | 0,015 | 0,1 | |
| 24 | 2 | 90.000 | 180000 | 100.000-150.000 | 0,100 | 0,5 | |
| 12 | 4 | 180000 | 360000 | 300,000 | 0,200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500000 | 1000000 | 500,000-750,000 | 0,500 | 2 | |
| Pratos | |||||||
| 35 mm | 10 | 500000 | 1000000 | 500000 | 0,500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1000000 | 2000000 | 1,000,000-1,500,000 | 1,000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2500000 | 5000000 | 2,500,000- 3000000 | 3,000 | 8 | |
Tabela 1. números de celular para a manutenção da diferenciação de células IMOP em VarTecido ious Formatos Cultura prato.
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Discussion
Monitoramento culturas IMOP
Um protocolo para a manutenção de auto-renovação e promover a diferenciação de uma linhagem celular IMOP romance é descrito e formatos chapeamento adicionais são incluídos (Tabela 1). Vários passos críticos que ajudam com a expansão e diferenciação de células IMOP rotina são anotados. Semelhante a culturas de células estaminais pluripotentes, células IMOP tem, teoricamente, um tempo de vida indeterminado. Para garantir que as linhas celulares são devidamente mantidas, culturas IMOP são rotineiramente monitorados para a viabilidade celular, a auto-renovação e potencial de diferenciação. Para determinar a viabilidade celular após dissociação, que empregam coloração com azul de tripano. Em geral, mais de 70% das células são viáveis após a dissociação. Para monitorar a auto-renovação em células IMOP, imunocoloração com c-Myc e anticorpos Sox2 é feito. Sob condições de cultura de proliferação, as células IMOP têm um tempo de duplicação de ~ 18 horas. Alterações na expressão de marcadores de auto-renovação ou fazertempo ubling são potenciais indicadores de alteração auto-renovação. Para monitorizar o potencial de diferenciação das células, IMOP saída do ciclo celular e da expressão de marcadores da fase inicial para epitelial neurónios sensoriais ou são utilizados para avaliar o potencial de diferenciação das células. Se as células IMOP não passar qualquer um dos critérios acima descritos, seria aconselhável pôr termo às culturas.
Variáveis que afetam culturas IMOP
Um passo crítico na cultura de células IMOP é manter uma concentração activa de bFGF nas culturas para promover a auto-renovação. bFGF é supostamente altamente lábil a 37 ° C, quando a cultura das células 29,30. Crescimento de culturas pode ser significativamente afetada pela diferenciação espontânea devido a bFGF instabilidade. No protocolo actual, o meio fresco é continuamente fornecido às culturas a fim de manter níveis de bFGF superiores a 5 ng / ml. Estabilização do bFGF usando níveis de libertação controlada a partir deglicólico e microesferas de poliéster de ácido láctico pode reduzir a freqüência de alterações na mídia necessários para manter níveis estáveis de bFGF em media 31. A adição do bFGF de forma constante libertável irá reduzir a necessidade de adicionar frequentemente meios para manter os níveis de bFGF em culturas IMOP.
Outro passo crítico na manutenção da viabilidade das células IMOP é limitar a exposição a reagentes de dissociação e corte mecânico. No protocolo de corrente, a dissociação é realizada por incubação com 1 mM de EDTA. Limitar o tempo de incubação excessivos com EDTA, reduzindo corte mecânico excessivo causado por pipetagem vigorosa e limitando vários passos de centrifugação quando passaging células IMOP vai ajudar a aumentar a viabilidade celular. Atenção dada a estes passos pode efectivamente manter a viabilidade de um grande número de células durante a expansão de culturas.
Durante a cultura de rotina de células IMOP, vários métodos para dissociar as células foram testadas. Mechantosquia iCal a partir de pipetagem pode ser usado para dissociar otospheres, mas não de maneira uniforme ou consistentemente produzir células individuais. O uso de reagentes disponíveis comercialmente para a dissociação celular de células IMOP pode gerar eficazmente células isoladas a partir de otospheres, mas estes reagentes afectar as propriedades adesivas de células para reformar otospheres e a aderir a superfícies tratadas. A fim de utilizar os reagentes comerciais, várias lavagens foram necessários para remover os reagentes de dissociação antes de empregar protocolos de diferenciação.
Nos actuais protocolos de diferenciação, ambas as condições epitélios sensoriais e diferenciação neuronal resultaram em morte celular que foi observada na forma de células individuais ou aglomerados de células mortas. A morte celular apoptótica pode ser devido à falta de diferenciação ou a sobrevivência pistas adequadas durante a cultura in vitro prolongada. Ambas as condições de diferenciação contidos suplemento B27 para promover a sobrevivência de células. Embora B27 Supplement foi mostrado para promover a sobrevivência de neurónios do hipocampo primários 32, pode não ser suficiente para promover a sobrevivência de células IMOP. A adição de compostos, tais como o inibidor da rocha pode ajudar a manter e aumentar a sobrevivência das células durante a cultura de rotina IMOP e na diferenciação in vitro. Inibidor de rocha tem sido extensivamente utilizada em culturas de células estaminais pluripotentes para promover a sobrevivência das células em culturas isentas de soro, sem afectar a diferenciação 33. A adição de inibidor ROCHA para os meios de cultura pode ajudar a aumentar a sobrevivência das células durante protocolos de diferenciação longos sem afetar o potencial de diferenciação das células IMOP. O aumento da sobrevivência da célula vai permitir o desenvolvimento de protocolos para gerar de forma eficiente um grande número de células capilares maduros ou SGNs.
O aumento da expressão Cdkn1b como marcador precoce de IMOP Diferenciação
Durante o desenvolvimento coclear precoce, o evento inicial de celularsaída ciclo precede a diferenciação de células ciliadas, células de suporte e SGNs 34. Terminal mitose de células progenitoras neuronais se espalha em uma onda a partir da base e progredindo em direção ao ápice da cóclea 35. Em um gradiente adversária, mitose do terminal de progenitores prosensory que dão origem a células ciliadas e células de suporte progride a partir do ápice para a base da cóclea 34,36. Embora a expressão temporal de Cdkn1b se correlaciona bem com o estado pós-mitótico, é mais provável que não o único factor que promove a saída do ciclo celular na cóclea em desenvolvimento. Em apoio a esta, Cdkn1b animais mutantes ainda pode desenvolver células ciliadas pós-mitóticas 37. Em vez disso, Cdkn1b pode ser usado como um indicador precoce para marcar o início da diferenciação. Em desgovernados culturas diferenciação IMOP, um marcador precoce para a diferenciação irá auxiliar no desenvolvimento de protocolos para promover estágios iniciais de diferenciação antes características morfológicas óbvias podem ser observadas. </ p>
Semelhante ao desenvolvimento ótica, saída ciclo inicia diferenciação e resulta em níveis aumentados em células IMOP Cdkn1b. Nas células em proliferação IMOP, apenas o baixo nível de expressão Cdkn1b podem ser observados. Outros inibidores de quinases dependentes de ciclina, tais como CDKN1A CIP (p21) pode ser responsável pela progressão do ciclo celular normal em células IMOP. Durante epitélio sensorial e diferenciação neuronal de células IMOP, análise quantitativa revelou uma única célula de um subconjunto de células com expressão de Cdkn1b aumento na diferenciação IMOP culturas (Figura 6A, C). Expressão de Cdkn1b nestas células é um indicador de células IMOP submetidos a diferenciação terminal.
Células IMOP como uma plataforma de celular para celular Estudar Destino Determinação
Uma vez que as células IMOP pode fazer a transição de um estado para diferentes linhagens progenitoras otic in vitro, que pode ser utilizada para estudar o destino celular óticadeterminação. Actualmente, o protocolo descrito utilizados procedimentos de diferenciação não guiados para gerar diferentes tipos de células óticas. O sistema IMOP permite adição de moléculas bioativas, compostos e genes definidos que orientam as células IMOP para o celular do cabelo maduro, célula de apoio e linhagens SGN. Um uso de IMOP plataforma celular é para testar transcrições candidatos fatores (TF) que promovem a diferenciação. Expressão de TF-chave pode ser utilizada para dirigir células do cabelo ou a diferenciação neuronal. Expressão de Cdkn1b juntamente com marcadores estabelecidos ou características morfológicas de células ciliadas e SGNs pode ser usado para determinar a contribuição de TFs candidatos para linhagens distintas otic 38,39.
TFs candidatos, como Atoh1 são essenciais para o desenvolvimento das células ciliadas e foram redirecionados para promover a diferenciação de células ciliadas na cóclea 40,41 danificado. Introdução de Atoh1 em células IMOP pode ajudar a promover a diferenciação de células ciliadas. No developing cóclea, tanto Ngn1 NeuroD1 e são necessárias para a diferenciação in vivo SGN adequada 42-44. Expressão de Ngn1 ou NeuroD1 em células IMOP pode promover a diferenciação SGN. Estas experiências são semelhantes a geração de células neuronais induzidas (In), onde a expressão do TFs individualmente ou em combinação podem converter os fibroblastos ou células estaminais pluripotentes em neurónios 45-48. Introdução de TFs que são normalmente expressos durante o desenvolvimento das células ciliadas ou SGNs é uma boa estratégia para orientar células IMOP para a célula de cabelo ou SGN linhagem.
Condições que promovem a diferenciação de um grande número de células e SGNs cabelo derivados de IMOP irá fornecer uma plataforma celular robusto para a modelagem de doença, pequena triagem molécula e testes de toxicologia que pode ser feito rapidamente e de forma rentável antes dos testes de trabalho intensivo em roedores são iniciadas . O protocolo descrito apresenta um sistema simples e versátil, que pode ser utilizado para studying diferenciação progenitor ótica e é passível de experimentos de grande escala.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
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