Protocol
1. Opprettholde selvfornyelse i IMOP Cells
- Forbered IMOP kultur media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 mikrogram / ml carbenecillin og 20 ng / ml bFGF. Gjør 50 ml IMOP kultur medier med sterile reagenser. Varm opp 49 ml DMEM / F12 i et 50 ml konisk i et 37 ° C vannbad.
- Tine 50X B27 supplement og filtersterilisert 100 mg / ml carbenecillin alikvoter i 5 min i et 37 ° C vannbad. Tine opp 100 mikrogram / ml bFGF delmengde ved RT. Tilsett 1 ml 50X B27, 10 ul av 100 ug / ml bFGF og 12,5 pl 100 mg / ml carbenecillin i DMEM / F12.
- Bruk 3 ml media i en 60 mm vevskulturskål for dyrking IMOP celler. Legg friske media til kulturer annenhver dag ved å doble volumet av media. Sikre at konsentrasjonen av bFGF ikke faller under 5 ng / ml.
- Kultur IMOP celler ved 37 ° C med 5% CO 2. Passage celler etter 5 - 7 dager i kultur som er nevnt i punktene nedenfor. Overføring kultur til en 15ml konisk ved hjelp av en 10 ml pipette.
- Lag 1 mM EDTA i HBSS ved fortynning av 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 i 50 ml HBSS. Pre-varm 1 mM EDTA laget i HBSS i et 37 ° C vannbad.
- Høste cellene ved tyngdekraften sedimentering eller sentrifugering ved 200 xg i 5 min. ved RT. For gravitasjon sedimentering, plasserer 15 ml konisk inneholder kulturer i 37 ° C inkubator i 5 - 10 min. Etter den tid, observere otospheres samle seg på bunnen av 15 ml konisk.
MERK: Overdreven sentrifugalkraften kan forårsake celleskader. - Nøye aspirer brukte media bruker en 2 ml suger pipette uten å forstyrre cellen pellet. Tilsett 0,5 ml forvarmet 1 mM EDTA HBSS løsning cellepelleten. Ved hjelp av en P1000 pipette, forsiktig pipettér opp og ned 2 - 3 ganger. Plasser konisk ved 37 ° C og inkuberes i <5 min for å lette dissosiasjon inn i enkeltceller.
- Virvle cellen løsning for å avgjøre om otospheres er dissosiert. Hvis ingen otokuler sedimentere til bunnen av den koniske, blir cellene dissosiert. Inkubasjonstiden kan variere.
MERK: Langvarig inkubasjon med EDTA vil føre til unormal celledød. - Fjerne celler fra 37 ° C, tilsett 2 ml av media for å nøytralisere og fortynne EDTA. Samle cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Sug ut fortynnet EDTA ved hjelp av en 2 ml aspirere pipette og tilsett 5 ml 1X PBS å vaske cellene.
- Spinn-celler ned ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur, og å suge ut 1 x PBS ved anvendelse av en 2 ml pipette aspirering. Suspender cellene ved hjelp av en P1000 pipette i 0,5 ml IMOP dyrkningsmedier ved forsiktig pipettering opp og ned 2 - 3 ganger.
- Telle celler ved hjelp av en mikrofluid partikkel teller med korrekte kassetter 28. En konfluent plate av IMOP cellene vil inneholde ~ 6 X10 6 celler. Fortynne celler 1: 100 i media og legge 75 ul av celleløsning inn i kassetten for telling. Plate 1 x 10 6 celler i en 6 cm rett i IMOP Culture media (~ 1: 10 fortynning). Passage iMOPs hvert 5 - 7 dager.
MERK: Celler som danner store otospheres eller festes til bunnen av vevskulturskål vil skille. Cellene vil også dø hvis de kulturene er over konfluent.
2. frysing og tining IMOP Cells
- Forbered syntetisk medium frysing av tining og ekvilibrering av løsningen til 4 ° C før fryseceller.
- Samle celler fra en konfluent 6 cm rett av IMOP celler. Bruker en 10 ml pipette og overført celler (~ 6 - 8 x 10 6 celler) i et 15 ml konisk.
- Høste cellene ved tyngdekraften sedimentering eller sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved RT. Dersom otospheres er små, vil cellene ikke bosette av tyngdekraft sedimentering. Valgfritt: Telle celler ved hjelp av trinn 1.9 for å fastslå samlede celle tall.
- Aspirer brukt media ved hjelp av en 2 ml aspirere pipette og samtidig la den løse cellepellet bak.
- Legg 0,25 ml av syntetiske frysing media å suspendere cells ved en tetthet på 5 x 10 ~ 5 til 3 x 10 6 celler / ml. Forsiktig pipette celler med en P1000 pipette. Overfør cellesuspensjonen til kryogene hetteglass ved hjelp av en pipette P1000 med 1 ml filtrert spiss.
- Plasser hetteglassene i et alkoholfritt frysebeholderen og plassere frysebeholderen ved -80 ° C for å redusere temperaturen 1 ° C pr minutt til temperaturen når -80 ° C.
- For langtidslagring av celler, overføres ampullene til dampfasen av en flytende nitrogenlagringstank. For å tine opp celler for kultur, likevekt kryogeniske hetteglass med frosne celler ved -80 ° C.
- Pre-varm IMOP kulturmedium i et 37 ° C vannbad.
- Tine frossen ampulle raskt ved å svinge bunnen av hetteglasset i et 37 ° C vannbad. Tilsett 1 ml forvarmet IMOP kultur media til tinte celler når den siste iskrystall forsvinner. Overfør cellene inn i en 15 ml konisk og legge ytterligere 4 ml IMOP dyrkningsmedier
- Spinn 15 ml coisk for 5 min. 200 xg og aspirer brukt media. Resuspender cellene i 2 ml IMOP kulturmedier og plate-celler i en 6 cm plate. Inkuber kulturer ved 37 ° C med 5% CO2 for ekspansjon.
3. Skille IMOP Cells inn Sensory epitel
- Forbered 50 ml IMOP sensorisk epithelia differensiering media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 mikrogram / ml carbenecillin. Gjør 50 ml IMOP sensorisk epithelia differensiering media. Varm opp 49 ml DMEM / F12 i et 50 ml konisk i et 37 ° C vannbad. Tine 50X B27 supplement og 100 mg / ml carbenecillin porsjoner for 5 min. i et 37 ° C vannbad. Tilsett 1 ml 50X B27 og 12,5 pl 100 mg / ml carbenecillin i DMEM / F12.
- Å høste, dissosierer, resuspender og telle celler gjenta trinn 01.04 til 01.09
- Plate 1 x 10 6 celler i en 6 cm tallerken på dag -3 hjelp IMOP kultur media. På dag 0, overfører kulturer ved anvendelse av en 10 ml pipette til en 15 ml konisk. Samle otokuler av tyngdekraften sedimentering som beskrevet i trinn 1.6. Aspirer ut brukte mediet ved hjelp av en 2 ml pipette og suger la otospheres på bunnen av den koniske.
- Tilsett i 2 ml sensorisk epithelia differensiering media. Overføring otospheres til en 6 cm plate ved hjelp av en stor boring 10 ml pipette.
MERK: Mekanisk skjæring fra harde pipettering kan distansere celler fra otospheres. - Tilsett 2 ml fersk sensorisk epitel differensiering media til kulturer annenhver dag. Om nødvendig, kan cellene samles ved hjelp av tyngdekraft sedimentering og mediet erstattes.
- Samle otospheres på Dag 10 ved å overføre til en 15 ml konisk og lar otospheres til sediment som nevnt i trinn 1.6.Aspirate brukt media bruker en 2 ml suger pipette og la otospheres uforstyrret.
- Fix otospheres ved å inkubere i 4% formaldehyd i 1 x PBS i 15 min ved RT. Fjerne formaldehydoppløsning, vaskes otospheres med vaskebuffer (1 x PBS inneholdende 0,1% TritonX-100) før inkubasjon i blokkeringsbuffer (1 x PBS inneholdende 10% normalt geiteserum og 0,1% Triton X-100) i 1 time.
- Skift buffer og inkuberes prøver i blokkeringsbuffer med fortynnet antistoff. Inkuber ved 4 ° C. Vask prøver med 1 x PBS inneholdende 0,1% Triton X-100 lagt den otosphere til farging 27. Overfør otospheres til 1X PBS og sted otospheres til montering media på en glassplate ved hjelp av en P1000 pipette. Sett et dekkglass over prøven og tillate montering materiale tørke ved 4 ° C.
- Erverve epifluorescens bilder ved hjelp av en invertert mikroskop oppsett utstyrt med en 16 bit CCD kamera og enten en 20X 0,75 luft eller en 40X 1.3 NA oljeneddyppingsobjektivet. Samle fluorescens fra ulike fargekanaler som bruker det børsnoterte (eksitasjon og emisjon) bølgelengder: blå (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), grønn (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rød (562 ± 20nm / og 625 ± 20nm) og infrarødt (628 ± 20nm / og 692 ± 20nm).
4. Analyse Edu innlemmelse
- På dag -3, plate 1 x 10 6 IMOP celler i en 6 cm parabolen. Tre dager senere på dag 0, høste, distansere, resuspender og telle celler ved å gjenta trinn 1,4-1,9.
- Plate 2,5 x 10 5 celler i IMOP kulturmedier og 5 x10 5 celler i sensorisk epithelia differensiering media i forskjellige brønner på en 6 vel rett.
- Bestemme prosentandelen av celler i S-fasen etter EDU innlemmelse på dag 3 ved hjelp av et EDU-inkorpore-ringsanalyse
- Legg EDU lager direkte til IMOP kulturer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 uM EDU i kulturmediet.
- Inkuber Edu i IMOP kulturer for 2 timer og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO 2. Innhøsting, dissosierer og samle celler gjenta trinn 1,4-1,9. Legg i 4% formaldehyd i 1 x PBS i 15 min. ved RT for å løse celler. Høste cellene ved sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved RT. Fjern formaldehyd løsning og properly kast.
- Merk kjerner av celler med Hoechst og innlemmet Edu med grønn fluorescens dye-azidet henhold til produsentens protokoll.
MERK: Alle vasker er ferdig med 1X PBS, 3% BSA og 0,1% Tween 20. Vask cellene med 1X PBS to ganger. - Mount celler på et lysbilde som bruker antifade reagent og plassere en 1,5 cover glass over prøven. Tilegne fluorescerende bilder av merkede celler ved hjelp av en epifluorescence mikroskopi.
5. Skille IMOP-Avledet Nevroner
- Gjør 50 ml neuronal differensiering media: Neurobasal medie, 1X B27 supplement, 2 mm L-Glutamin. Tine flaske 50X B27 og 200 mM L-glutamin i 37 ° C vannbad i 5 min. Legg 1ml 50X B27 og 0,5 ml 200 mM L-glutamin til 48,5 ml Neurobasal media.
- Coat dekkglass ved å plassere 12 mm runde 1,5 dekkglass i en steril 10 cm plate og legge 70% EtOH til plate å sterilisert og rengjør glassene.
- Beveg lett vikenrslips å sikre at de er dekket i etanol. La platen i 10 minutter ved RT. Skyll glassene 3 ganger med sterilt 1 x PBS for å vaske ut den resterende etanol. Skyll dekk gang med steril H 2 0 for å vaske ut rester 1X PBS.
- Aspirer H 2 0 bruker en 2 ml suger pipette og la Dekk tørr. Expose glassene til UV-lys i vevskultur panseret i 15 min. Lagres Dekk i et sterilt miljø om ikke umiddelbart benyttes.
- Plasser en 12 mm runde dekkglass i hver brønn av en 24 godt parabolen. Rist platen forsiktig for å sikre at dekk ligge flatt på bunnen av brønnen.
- Tine 2 mg / ml poly-D-lysin lageroppløsning ved romtemperatur og fortynn til en 10 ug / ml poly-D-lysin-konsentrasjon i 1X PBS. Legg 0,25 ml 10 ug / ml poly-D-lysin til brønnene. La platen i 37 ° C inkubator i 1 time.
- Vask brønnene 3 ganger med sterilt 1X PBS. Tine 10 mg / ml laminin stamløsning ved RT og fortynnet til 10 ug / ml i 1X PBS. Legg 0,25 ml 10 ug / ml laminin arbeidsløsning i en enkelt brønn av en 24 multi-brønners skål. Inkuber platen ved 37 ° C inkubator. Aspirer ut laminin løsning ved hjelp av en 2 ml aspirere pipette.
- Vask dekk 3 ganger med 1 x PBS ved tilsetning i 1 ml av 1 x PBS med en P1000 pipette og fjerning av 1 x PBS ved aspirering med en 2 ml pipette suger. La 1X PBS fra siste vask i brønnen inntil cellene er klare til å bli belagt. Initiere neuronal differensiering av høsting, dissociating og telle celler i trinn 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 celler i en 6 cm tallerken på dag -3.
- På dag 0, høste, distansere og telle celler ved å gjenta 01.04 til 01.09. Seed 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 IMOP celler i 0,5 ml forvarmet nevronale differensiering medie per brønn i en 24 multi-brønn fatet. Aspirer og legge forvarmet neuronal differensiering media til kulturer annenhver dag.
- Fix IMOP-avledet nevroner i 4% formaldehyd i 15 min. ent RT på dag 7. Fjern formaldehydløsning, vaske IMOP-avledet neuroner med vaskebuffer (1 x PBS inneholdende 0,1% TritonX-100) før inkubasjon i blokkeringsbuffer (1 x PBS inneholdende 10% normalt geiteserum og 0,1% Triton X-100) i 1 time.
- Skift buffer og inkuberes prøver i blokkeringsbuffer med fortynnet antistoff. Inkuber ved 4 ° C. Vask prøver med 1 x PBS inneholdende 0,1% Triton X-100-celler er utsatt for farging 27. Vask coverglass med 1X PBS før du legger inn monterings media. Tillat monterings materiale tørke ved 4 ° C før skaffe epifluorescens bilder som angitt i trinn 3,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
bFGF Tilbaketrekking Reduserer spredning i IMOP Cells
For å redusere den proliferative kapasiteten til IMOP celler og initiere differensiering av IMOP celler, ble bFGF trukket fra kulturene. For å bekrefte at vekstfaktor tilbaketrekking minsker spredning, ble Edu innlemmelse ansatt som proliferasjonsanalyse. Prosentandelen av celler som innlemmet Edu fra otospheres dyrket med IMOP kultur media (som inneholder bFGF) og otospheres dyrket i sensorisk epithelia media (uten bFGF) ble sammenlignet. Otosphere kulturer ble pulset med nucleotide analog Edu, høstet og fikset. Incorporated Edu nukleotider ble fluorescensmerkede med Alexafluor 488 azidet bruker klikk-kjemi. Celler fra otospheres dyrket i fravær av bFGF viste nedsatt inkorporering av edu i forhold til celler dyrket med bFGF (figur 1 A-F). Som størrelsen of otosphere økte, var det stadig vanskeligere å visualisere alle cellene fra otosphere med en epifluorescent mikroskop. For å løse dette, ble cellene dissosiert og montert slik at de kan utvetydig visualiseres en masse. Selv etter dissosiasjon og fiksering, cellene re-aggregert. For å opprettholde celler i en dissosiert tilstand, ble vaskemidler som forhindret cellene fra re-aggregerende testet. Tween 20 var en av de vaskemidler som hindret re-aggregering av cellene. Dissosierte celler ble vasket med 0,1% Tween 20, og montert på objektglass. EDU-merkede celler ble så visualisert ved epifluorescens mikroskopi (figur 1 G, H). Representative resultater fra individuelle eksperimenter (n = 5) viste en signifikant reduksjon i prosentandelen av EDU-merkede celler fra 48% til 19% etter 3 dager etter bFGF uttak (p <0,005). Disse resultatene bekrefter en dramatisk nedgang i andelen S fase celler og proliferativ potensialet IMOP celler etterbFGF trekning.
IMOP-avledet Sensory epitel Express Cdkn1b og Show morfologiske endringer
En tidslinje over IMOP sensorisk epithelia differensiering protokollen er vist (figur 2A). Otospheres fra proliferative kulturer ble dissosiert i enkeltceller og lov til å komme seg i 3 dager i IMOP kulturmedier. Denne metoden hjelper berike for voksende celler og velger mot post-mitotiske celler i disse utgangs kulturer. Etter 3 dager ble nydannede otospheres seedet i sensorisk epithelia differensiering media og lov til å gjennomgå unguided differensiering i 10 dager. Bright feltet bilder av typiske kulturer inneholdende otospheres ved forskjellige tidspunkter etter såing viste en innledende reduksjon i størrelse før otospheres begynne å øke i størrelse (figur 2B-E).
27. For å avgjøre om uttrykket av Cdkn1b (p27 KIP) kan brukes som en markør for differensiering, ble otospheres fra proliferative eller sensoriske epithelia differensiert IMOP kulturer sammenlignet. Fluorescent markører ble visualisert og tatt til fange av epifluorescence mikroskopi. Representative bilder av otospheres fra proliferative kulturer viste lav uttrykk for Cdkn1b utenfor kjernen med nesten ingen phalloidin farging (figur 3 AD). Otospheres dyrket i sensorisk epithelia differensiering mediene som vises økt uttrykk av atom Cdkn1b samtidig med utseendet på phalloidin merking i ytterkantene av celler (figur 3 EH). I prolifererende IMOP otospheres, Cdh1 (E-cadherin) og phalloidin er svakt merket (figur 3 IL). I differensierte IMOP otospheres, uttalt phalloidin og Cdh1 merking markere morfologiske endringer i aktin filamenter og regioner i celle-celle adhesjon (figur 3 MP), i likhet med tidligere resultater 27. Under sensoriske epithelia differensiering, morfologiske endringer i aktin filamenter parallelt utseendet Cdh1 ekspresjon i adhesjons områder mellom celler. I denne protokollen, økningen i Cdkn1b uttrykk sammen med endringene i phalloidin og Cdh1 tjene som tidlige indikatorer på sensoriske epithelia differensiering i IMOP celler.
IMOP-avledet Nevroner Express Cdkn1b og Tubb3
En skjematisk fremstilling av IMOP neuronal differensiering protokollen er vist (figur 4A). I likhet med den tidligere nevnte protokoll, ble cellene dissosiert IMOP og allowed til utvinning i 3 dager i IMOP kulturmedier. Otospheres ble høstet, dissosiert i enkeltceller og sådd på poly-D-lysin og laminin belagt Dekk. Cellene ble tillatt å skille i 7 dager. Representative lyse feltet bilder på tidspunkter vises progressive morfologiske endringer som de differensiert i IMOP-avledet nevroner (Figur 4B-E). Ved dag 7, kan lange neuritter sees som strekker seg fra cellelegemene (figur 4E pilspisser). For å bestemme endringer i uttrykk nivåer av Cdkn1b under neuronal differensiering, voksende IMOP celler og IMOP-avledet nevroner ble sammenlignet. Otospheres ble merket med Hoechst og Cdkn1b antistoffer. IMOP celler fra prolifererer otospheres hadde noen celler med lav atom Cdkn1b uttrykk (figur 4 FH). Videre viste IMOP-avledet nevroner en økning i antall celler med atom Cdkn1b ekspresjon 7 dager etter neuronal differensiering (Figur 4IK). For å finne ut om de Cdkn1b cellene var vedta en neuronal avstamning, ble merking av IMOP-avledet nevroner med nevronale markør Tubb3 gjort. Representative bilder av IMOP-avledet nevroner viste co-merking av Cdkn1b og Tubb3 (Figur 5 AD). Forstørrelse og kvantifisering av neuritter fra disse cellene viste en gjennomsnittlig 1,5 neuritter knyttet til hver Tubb3 merket celle (n = 60) (Figur 5 EG). I vår neuronal differensiering protokoll, farging med Cdkn1b og Tubb3 kan benyttes som en indikator for differensiering til bipolar eller pseudo-unipolare IMOP-avledet nerveceller.
Nuclear Cdkn1b Expression nivåene øker etter Initiere Differensiering
De morfologiske endringer i otospheres viser kvalitative endringer i IMOP celler som de gjennomgår differensiering. For å oppnå kvantitative resultater fra immunofluorescensnofluorescence bilder å betegne tidlig differensiering hendelser, kjerne fluorescens intensitet Cdkn1b fra individuelle prolifererende IMOP celler (n = 239) og IMOP celler gjennomgår sensorisk epithelia differensiering (n = 246) ble målt. Å normal Cdkn1b fluorescenssignaler fra uavhengige forsøk, ble forholdet mellom Cdkn1b til Hoechst fluorescens fra individuelle celler bestemt. Histogrammer av den norm fluorescens intensitet Cdkn1b fra prolifererende IMOP celler (svart) og sensoriske epithelia differensierende IMOP celler (røde) ble plottet (Figur 6A). En økning i antall av høye Cdkn1b uttrykkende celler ble observert som en høyrerettet forskyvning av histogrammet for sensoriske epithelia differensiering (rød) i forhold til histogrammet for prolifererende IMOP celler (sort). Å bestemme økningen i andelen av celler som uttrykker Cdkn1b, en terskel for normalisert Cdkn1b fluorescens intensitet enheter (0,65) ble satt (pilspiss) og andelen av celler abo ve terskelen ble bestemt. Etter sensoriske epithelia differensiering, vises IMOP celler en økning fra 25,3% til 67,1% av celler som uttrykker Cdkn1b (figur 6B). Den samme kvantitativ analyse ble påført IMOP-avledet nerveceller. Når man sammenligner proliferative IMOP celler (n = 525) og 7 dagers IMOP-avledet nevroner (n = 583) en mot høyre skifte i histogrammet forbundet med IMOP-avledet nevroner ble observert i forhold til histogrammet for voksende IMOP celler (figur 6C). Å bestemme prosentandelen av celler over terskelen avslørte en økning i Cdkn1b uttrykkende celler fra 23,5% til 85,5% (figur 6D). Ved hjelp av de beskrevne protokoller, kvantitativ analyse av Cdkn1b ekspresjon bekreftet en økning i antall celler som oppregulerer Cdkn1b under sensorisk epithelia og neuronal differensiering. Det økte antall Cdkn1b uttrykkende celler kan brukes for å bekrefte differensiering av IMOP cellene i disse protokollene.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Edu Stiftelse som en analyse for å bestemme Proliferativ State of IMOP kulturer. IMOP-avledet otospheres dyrket i nærvær av bFGF. Atomkjerner av celler ble merket med (A) Hoechst og (B) Edu Alexafluor 488. (C) sammenslåtte bildet av Hoechst og Edu fluorescens. Otospheres dyrket 3 dager i media mangler bFGF. Celler fra kulturer ble merket med (D) Hoechst og (E) Edu Alexafluor 488. (F) fusjonerte bilder av Hoechst og Edu merking. Sammenslåtte fluorescens bilder av Hoechst (magenta) og EDU (grønn) merkede celler etter dissosiering otospheres og vasking med 1 x PBS inneholdende 0,1% Tween 20. Cellene var fra otospheres dyrkede (G) i nærvær av bFGF eller (H) fravær av bFGF. Lengde på skalaenstolpene er 10 um, med mindre angitt. (I) Prosent av edu merkede celler fra IMOP celler dyrket i nærvær eller fravær av bFGF. Antallet av individuelle celler som ble analysert ble betegnet innenfor stavdiagram og feilstolper ble fremstilt som standard feil av gjennomsnittet (SEM). Celletellinger var fra n = 5 uavhengige forsøk. Den t-test ble gjort for å bestemme statistisk signifikans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Generell Skjematisk av Sensory epithelia Differensiering. (A) Tidslinje for å differensiere IMOP celler i sensorisk epithelia. Linjen grafen betegner tidspunktet for celledissosiasjon og medie endringer. (B) Typisk fasekontrastbilder av otospheres på dag 0, (C) 3, (D) 7 og (E) 10 under unguided sensorisk epithelia differensiering. Lengde på skalaen bar er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Uttrykk for Markers Veiledende av cellesyklus arrest og Differensiering i IMOP-avledet Sensory epithelia. Otosphere av IMOP celler dyrket i IMOP kulturmedier. Kjerner av celler ble merket med (A) Hoechst, og (B) Cdkn1b antistoff. Trådformede aktin ble merket med (C) phalloidin. (D) Den sammenslåtte bildet av en typisk otospheres inneholder prolifererende IMOP celler. Otospheres fra IMOP celler ble dyrket i sensorisk epithelia kultur media i 10 dager. Celler fra otopsheres ble merket med (E) Hoechst, (F) Cdkn1b og (G) phalloidin. (H) sammenslåtte bildet av otospheres som viser økt Cdkn1b og phalloidin merking. Prolifererende otospheres ble merket med (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K) phalloidin. (L) Den sammenslåtte bildet viser svak fluorescens fra disse markørene. Otospheres differensierte inn sensoriske epithelia ble også merket med (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) phalloidin. (P) Den sammenslåtte bildet viser typisk sterk Cdh1 og phalloidin merking. Lengde på skala barer er 10 mikrometer med mindre angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Generell Skjematisk av neuronal Differensiering. (A) Tidslinje for å differensiere IMOP celler i nerveceller. Fasekontrastbilder av IMOP celler som gjennomgår neuronal differensiering i (B) Dag 1, (C) 3, (D) 5 og (E) 7. Pilhoder peker på neuritter. Fluorescens bilder av IMOP celler dyrket som otospheres i IMOP kulturmedier merket med (F) Hoechst og (G) Cdkn1b. (H) Sammenslåtte bilde av celler merket med Hoechst og Cdkn1b. Fluorescens bilder av IMOP celler etter 7 dager med kultur i neuronal differensiering media. Kjerner av celler ble merket med (I) og Hoechst (J) Cdkn1b. (K) fusjonerte bildet av celler merket med Hoechst og Cdkn1b. Lengde på skala barer er 10 mikrometer hvis ingenting. om / filer / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Expression of Molecular Markers Omtrentlig of Cell Cycle Exit og neuronal differensiering. IMOP celler 7 dager etter neuronal differensiering. Kjerner ble merket med (A) Hoechst, (B) Tubb3 (neuronal β-tubulin) antistoff for å fremheve cellulær morfologi, og (C) Cdkn1b antistoffer. (D) Sammenslåtte bilde med merking av Cdkn1b og Tubb3 i enkeltceller. Lengde på skalaen bar er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
oad / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
Figur 6. enkelt celle Kvantitativ fluorescensintensitet Analyse av Cdkn1b. (A) Normalisert fluorescensintensiteten av Cdkn1b ekspresjon ble bestemt ved å beregne forholdet mellom Cdkn1b og Hoechst fluorescensintensitet fra individuelle celler. Den normaliserte fluorescensintensitet ble plottet i forhold til antall celler som et histogram. Normalisert fluorescensintensiteten av Cdkn1b fra IMOP prolifererende celler dyrket i nærvær av bFGF (svart) og IMOP otospheres differensiert i sensorisk epithelia (SE) (rødt) er vist. En terskel ble satt til 0,65 normaliserte fluorescens intensitet enheter (pilspiss) (B) Prosentandel celler som uttrykker Cdkn1b IMOP over terskelverdien, fra prolifererende (svart) og sensoriske epitel differensiert kulturer (røde). (C) Sammenslåtte fluorescerende bilde av sensoriske epithelia differensiert IMOP celler merket med Hoechst og Myo6 antistoffer. (D (E) Prosent av IMOP celler som uttrykker Cdkn1b fra formerer (svart) og nevrale differensiering kulturer (rød). Individuelle celler som brukes til analyse ble betegnet i hver søylediagram. Resultater ble samlet fra forskjellige eksperimenter (n = 3), og feilstolper avbildet som SEM. Student t-test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans. (F) Sammenslåtte fluorescerende bilde av bipolar eller pseudo-unipolar IMOP-avledet nevroner merket med Hoechst og Tubb3. Lengde på skala barer er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cell Culture Vessel | Surface Area (cm 2) | Antall Celler Seeded for regelmessig vedlikehold | Antall Celler Seeded for Sensory epitel Differensiering | Antall Celler Seeded for Neuronal Differensiering | Skalering Factor I forhold til 60 mm Dish | Volum av Media brukt (ml) | |
| Multwell Plates | |||||||
| 96 | 0.3 | 10000 | 20000 | 10,000-50,000 | 0,015 | 0.1 | |
| 24 | 2 | 90000 | 180000 | 100.000-150.000 | 0.100 | 0.5 | |
| 12 | 4 | 180000 | 360,000 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500.000 | 1000000 | 500,000-750,000 | 0.500 | 2 | |
| Servise | |||||||
| 35 mm | 10 | 500.000 | 1000000 | 500.000 | 0.500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1000000 | 2000000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2500000 | 5000000 | 2,500,000- 3000000 | 3.000 | 8 | |
Tabell 1. Cell Numbers for vedlikehold av Differensiering av IMOP Cells i Various vevkulturplate formater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overvåking IMOP kulturer
En protokoll for å opprettholde selvfornyelse og fremmer differensiering av en ny IMOP cellelinje er beskrevet og ytterligere pletteringsformater er inkludert (tabell 1). Flere kritiske trinn som bidrar med rutine ekspansjon og differensiering av IMOP celler er notert. I likhet med pluripotente stamcellekulturer, IMOP celler i teorien ha ubestemt levetid. For å sikre at cellelinjer er riktig vedlikeholdt, er IMOP kulturer rutinemessig overvåket for celle levedyktighet, selvfornyelse og differensiering potensial. For å bestemme celleviabilitet etter dissosiasjon, ansetter vi trypanblått farging. Generelt er over 70% av cellene er levedyktige etter dissosiasjon. For å overvåke selvfornyelse i IMOP celler, farging med c-myc og Sox2 antistoffer er gjort. Under proliferative dyrkningsbetingelser, IMOP celler har en doblingstid på ~ 18 timer. Endringer i uttrykk for selvfornyelse markører eller gjøreubling tid er potensielle indikatorer av endret selvfornyelse. Å overvåke differensiering potensialet IMOP celler, cellesyklus exit og uttrykk for tidlig stadium markører for sensorisk epitel eller nevroner blir brukt til å vurdere differensiering potensialet i cellene. Dersom IMOP celler ikke passerer noen av de kriterier som er beskrevet ovenfor, vil det være tilrådelig å avslutte kulturer.
Variabler som påvirker IMOP kulturer
Et kritisk trinn i dyrking av celler IMOP er å opprettholde en aktiv konsentrasjon av bFGF i kulturene for å fremme selvfornyelse. bFGF er visstnok meget labil ved 37 ° C ved dyrkning av celler 29,30. Vekst av kulturer kan bli betydelig påvirket av spontan differensiering grunn bFGF ustabilitet. I den aktuelle protokoll, blir kontinuerlig tilført friskt medium til kulturene for å opprettholde bFGF-nivåer over 5 ng / ml. Stabilisering av bFGF nivåer med kontrollert frigjøring fraglykol og melkesyre polyester-mikrokuler kan redusere hyppigheten av medie endringer som trengs for å opprettholde stabile nivåer av bFGF i 31 media. Tilsetting av den stadig frigjør bFGF vil redusere behovet for å ofte legge media for å opprettholde bFGF nivåer i IMOP kulturer.
Et annet kritisk punkt i å opprettholde levedyktigheten til IMOP celler er å begrense eksponering for dissosiasjon reagenser og mekanisk klipping. I den aktuelle protokoll, er dissosiasjon oppnådd ved inkubasjon med 1 mM EDTA. Dempe overdreven inkubasjonstid med EDTA, redusere overdreven mekanisk klipping forårsaket av kraftig pipettering og begrense flere sentrifugeringstrinn ved passering IMOP cellene vil bidra til å øke celle levedyktighet. Oppmerksomhet gitt til denne fremgangsmåten effektivt kan opprettholde levedyktigheten til et stort antall celler under ekspansjon av kulturer.
Under rutinemessig kultur av IMOP celler, ble flere metoder for dissosiering av cellene testet. Mechanical klipping fra pipettering kan brukes til å distansere otospheres, men ikke jevnt eller konsekvent produsere enkeltceller. Bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser for cellulær dissosiasjon av IMOP celler effektivt kan generere enkeltceller fra otospheres, men disse reagenser påvirke klebende egenskaper celler å reformere otospheres og å følge behandlede overflater. For å bruke kommersielle reagenser, ble flere vasker pålagt å fjerne dissosiasjon reagenser før ansette differensierings protokoller.
I dagens differensierings protokollene, både sensoriske epitel og neuronal differensiering betingelser resulterte i celledød som ble observert i form av enkle celler eller klumper av døde celler. Apoptotisk celledød kan være på grunn av mangel på egnede differensiering eller overlevelse signaler under den langvarige kultur in vitro. Begge differensiering betingelsene B27 supplement for å fremme overlevelse av celler. Selv B27 kompletteresent har blitt vist å fremme overlevelse av primære hippocampale neuroner 32, kan det ikke være tilstrekkelig for å fremme overlevelse av IMOP celler. Tilsetning av forbindelser som ROCK-inhibitoren kan bidra til å opprettholde og øke overlevelse av IMOP celler under rutinemessig kultur og in vitro differensiering. ROCK-inhibitor har vært mye brukt i pluripotente stamceller kulturer for å fremme overlevelse av cellene i serumfritt kulturer uten å påvirke differensieringen 33. Tilsetting av ROCK inhibitor til kultur media kan bidra til å øke celle overlevelse under lange differensiering protokoller uten å påvirke differensiering potensialet IMOP celler. Økt celleoverlevelse vil tillate utvikling av protokoller til effektivt å generere et stort antall modne hårcellene eller SGNs.
Økt Cdkn1b Expression som en tidlig markør for IMOP Differensiering
Under tidlig cochlea utvikling, den første hendelsen av cellesyklus exit forut differensiering for hårceller, støtte celler og SGNs 34. Terminal mitose av nevrale stamceller sprer seg i en bølge fra basen og progresjon mot toppen av cochlea 35. I en motsatt gradient, terminal mitose av prosensory stamfedre som gir opphav til hårcellene og støtte celler utvikler seg fra toppen til bunnen av cochlea 34,36. Selv om timelige uttrykk for Cdkn1b korrelerer godt til etter mitotisk staten, er det mest sannsynlig ikke den eneste faktoren som fremmer cellesyklus exit i utviklings cochlea. Til støtte for dette, kan Cdkn1b muterte dyr fortsatt utvikle post-mitotiske hårcellene 37. I stedet kan Cdkn1b brukes som en tidlig indikator for å markere begynnelsen av differensiering. I unguided IMOP differensierings kulturer, vil en tidlig markør for differensiering bidra til å utvikle protokoller for å fremme tidlige stadier av differensiering før åpenbare morfologiske trekk kan observeres. </ p>
I likhet med otic utvikling, starter syklusen exit differensiering og resulterer i økt Cdkn1b nivåer i IMOP celler. I prolifererende IMOP celler, kan bare lavt nivå uttrykk for Cdkn1b holdes. Andre cyklinavhengige kinase hemmere som Cdkn1a (CIP p21) kan være ansvarlig for normal cellesyklusprogresjon i IMOP celler. Under sensoriske epithelia og neuronal differensiering av IMOP celler, enkelt celle kvantitativ analyse viste et undersett av celler med økt ekspresjon av Cdkn1b i differensiere IMOP kulturer (figur 6A, C). Uttrykk for Cdkn1b i disse cellene er en indikasjon på IMOP celler gjennomgår terminal differensiering.
IMOP Celler som Cellular Plattform for Studerer Cell Fate Bestemmelse
Siden IMOP celler kan overgangen fra en tilstand til forskjellige progenitor otiske linjene in vitro, kan de bli anvendt for å studere otisk celle skjebnebesluttsomhet. Foreløpig den beskrevne protokollen som brukes unguided differensiering prosedyrer for å generere ulike otiske celletyper. Den IMOP systemet tillater for tillegg av bioaktive molekyler, forbindelser og definerte gener som styrer IMOP celler mot modne hårcelle, støtter celle og SGN linjene. En bruk av IMOP mobilplattform er å teste for kandidat transkripsjoner faktorer (TF) som fremmer differensiering. Ekspresjon av TF nøkkel kan benyttes for å drive hårcelle eller neuronal differensiering. Uttrykk for Cdkn1b sammen med etablerte markører eller morfologiske funksjoner i hårcellene og SGNs kan brukes til å bestemme bidraget av kandidat TFS til forskjellige otiske linjene 38,39.
Kandidat TFS som Atoh1 er avgjørende for håret celle utvikling og har vært på nytt for å fremme hår celledifferensiering i det skadede cochlea 40,41. Innføring av Atoh1 inn IMOP celler kan bidra til å fremme hår celledifferensiering. I developing cochlea, er begge Ngn1 og NeuroD1 nødvendig for riktig SGN differensiering in vivo 42-44. Uttrykk for Ngn1 eller NeuroD1 i IMOP celler kan fremme SGN differensiering. Disse eksperimentene er lik generere induserte neuronale celler (IN), hvor ekspresjon av det TFS individuelt eller i kombinasjon kan konvertere fibroblaster eller pluripotente stamceller til neuroner 45-48. Innføring av TFS som normalt uttrykt under utviklingen av hårceller eller SGNs er en god strategi for å lede IMOP celler mot håret celle eller SGN avstamning.
Forhold som fremmer differensiering av et stort antall IMOP-avledet hårcellene og SGNs vil gi en robust mobilplattform for sykdom modellering, lite molekyl screening og toksikologi testing som kan gjennomføres raskt og kostnadseffektivt før arbeidskrevende tester hos gnagere er initiert . Protokollen er beskrevet presenterer en enkel og allsidig system som kan utnyttes for studying otic stamfar differensiering og er mottagelig for storskalaforsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
- Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
- Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
- Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
- Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
- Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
- Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
- Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
- Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
- Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314 (2013).
- Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
- Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
- Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
- Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
- Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
- Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
- Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289 (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
- Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
- Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
- Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
- Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
- Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).
