Protocol
1. Поддержание самообновления клеток в ППМН
- Подготовка ИМОП питательных сред: DMEM / F12, 1X B27 дополнения, 25 мкг / мл carbenecillin и 20 нг / мл оФРФ. Сделайте 50 мл культуральной среды ИМОП используя стерильные реагенты. Разминка 49 мл DMEM / F12 в 50 мл конической в водяной бане при 37 °.
- Оттепели 50X В27 добавки и стерилизованным фильтрацией 100 мг / мл аликвоты carbenecillin в течение 5 мин на водяной бане при 37 ° C. Оттаять 100 мкг / мл аликвоты оФРФ при комнатной температуре. Добавить 1 мл 50Х В27, 10 мкл 100 мкг / мл и 12,5 оФРФ мкл 100 мг / мл carbenecillin в DMEM / F12.
- Используйте 3 мл СМИ в 60 мм блюдо культуры ткани для культивирования клеток ИМОП. Добавить свежие средства массовой информации культур каждый день, удвоив объем средств массовой информации. Убедитесь, что концентрация оФРФ не опускается ниже 5 нг / мл.
- Культура ИМОП клетки при 37 ° C с 5% CO 2. Прохождение клеток через 5 - 7 дней в культуре, перечисленных ниже в шагах. Передача культуры в 15мл коническую помощью пипетки на 10 мл.
- Сделать 1 мМ ЭДТА в HBSS при разбавлении 0,1 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0 в 50 мл HBSS. Предварительно теплой 1 мМ ЭДТА в HBSS сделал в С на водяной бане 37 °.
- Урожай клетки под действием силы тяжести седиментации или центрифугирования при 200 мкг в течение 5 мин. при комнатной температуре. Для осаждения тяжести, поместите конический 15 мл, содержащий культуру в 37 ° C инкубаторе в течение 5 - 10 мин. По истечении этого времени, необходимо соблюдать otospheres собирают в нижней части 15 мл коническую.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное центробежная сила может привести к повреждению клеток. - Тщательно аспирата провел носитель с помощью 2 мл аспирационных пипетки, не нарушая клеточный осадок. Добавить 0,5 мл подогретого раствора 1 мМ ЭДТА HBSS в осадок клеток. Использование P1000 пипетки, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза. Поместите коническую при 37 ° С и выдержать в течение 5 мин <облегчения диссоциации на отдельные клетки.
- Аккуратно водоворот решение клеток, чтобы определить, otospheres диссоциируют. Если нет OTOСферы осадок на дно конической клетки диссоциируют. Время инкубации может изменяться.
Примечание: длительной инкубации с ЭДТА приведет к чрезмерному гибели клеток. - Удалить из клетки 37 ° C, добавить 2 мл среды для нейтрализации и разбавления ЭДТА. Собирают клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирацию из разбавляют ЭДТА с использованием 2 мл аспирационной пипетки и добавить мыть клетки 5 мл 1X PBS.
- Спин клетки вниз на 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирата из 1X PBS с использованием 2 мл аспирационной пипетки. Ресуспендируют клеток с использованием пипетки P1000 в 0,5 мл культуральной среды ИМОП осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза.
- Граф клеток с использованием микрожидкостных счетчика частиц с соответствующими кассет 28. Конфлюэнтную пластина ИМОП клеток будет содержать ~~~HEAD=iobj 6 x10 6 клеток. Развести клеток 1: 100 в среде и добавляют 75 мкл раствора клеточной в кассету для подсчета. Пластина 1 х 10 6 клеток в 6 см блюдо в ИМОП cultuRe сред (~ 1: 10 разбавление). Прохождение iMOPs каждые 5 - 7 дней.
Примечание: Клетки, которые формируют большое otospheres или прикрепить к нижней части блюдо культуры ткани будет дифференцироваться. Клетки также умереть, если Культуры над сливной.
2. замораживание и оттаивание ППМН Клетки
- Подготовьте синтетическая среда замерзания оттаиванием и уравновешивания раствора до 4 ° С перед клеток замораживанию.
- Сбор клеток из сливной 6 см блюдо ИМОП клеток. Использование пипетки 10 мл и передачи ячейки (~ 6 - 8 × 10 6 клеток) в 15 мл коническую.
- Урожай клетки под действием силы тяжести седиментации или центрифугирования при 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Если otospheres малы, клетки не будет урегулировать под действием силы тяжести седиментации. Дополнительно: Граф клеток с использованием шаг 1,9, чтобы определить общее число клеток.
- Аспирируйте провел СМИ, используя 2 мл пипетку аспирационной оставляя свободную осадок клеток позади.
- Добавить 0,25 мл синтетических средах замораживания ресуспендировать CEзаполняет при плотности ~ 5 х 10 5 до 3 × 10 6 клеток / мл. Аккуратно пипетки клетки с P1000 пипетки. Передача клеточной суспензии до криогенных флаконах с использованием P1000 пипетки 1 мл отфильтрованных чаевые.
- Поместите флаконы в спиртовом контейнера свободный замерзания и поместить в контейнер замерзания при -80 ° С для снижения температуры на 1 ° C в минуту, пока температура не достигнет -80 ° С.
- Для длительного хранения клеток, передачи флаконов в паровой фазе жидкого азота резервуара. Для оттаять клетки культуры, равновесие криогенной флакона замороженных клеток при -80 ° С.
- Предварительно теплой ИМОП культура СМИ в С на водяной бане 37 °.
- Оттепель замороженных флакон быстро крутятся на дно флакона в С на водяной бане 37 °. Добавить 1 мл подогретого ИМОП культуры СМИ талых клеток, как только в прошлом кристаллов льда исчезает. Передача клеток в 15 мл коническую и добавить дополнительные 4 мл культуральной среды ИМОП
- Спин 15 мл сотрудничестваическая в течение 5 мин. при 200g и аспирации затраченные средства массовой информации. Ресуспендируют клеток в 2 мл ИМОП питательных сред и пластины клеток в чашку диаметром 6 см. Инкубируйте культур при 37 ° С с 5% СО 2 в течение расширения.
3. Дифференциация клеток в линии ППМН сенсорного эпителия
- Подготовьте 50 мл ИМОП сенсорного эпителия дифференцировки: DMEM / F12, 1X В27 дополнения, 25 мкг / мл carbenecillin. Сделайте 50 мл ИМОП сенсорного эпителия дифференцировки. Разминка 49 мл DMEM / F12 в 50 мл конической в водяной бане при 37 °. Оттепели 50X В27 добавки и 100 мг / мл аликвоты carbenecillin в течение 5 мин. в С на водяной бане 37 °. Добавить 1 мл 50X B27 и 12,5 мкл 100 мг / мл carbenecillin в DMEM / F12.
- Для сбора, диссоциируют, ресуспендируют и рассчитывать клетки повторить шаги 1.4-1.9
- Пластина 1 х 10 6 клеток в 6 см блюдо в день -3 помощью ИМОП культуральной среды. На день 0, культуры передачи с использованием 10 мл пипетки в 15 мл коническую. Соберите ОТОсферы по тяжести седиментации, как указано в шаге 1.6. Аспирацию из истощенных средах с помощью 2 мл аспирационных пипетки и оставить otospheres на дне конической.
- Аккуратно добавить в 2 мл сенсорного эпителия дифференцировки. Передача otospheres чтобы чашку диаметром 6 см, используя большое отверстие 10 мл пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Механическое сдвига от резкой пипетки может отделить клетки от otospheres. - Добавить 2 мл свежего сенсорного эпителия дифференциации средств массовой информации культур каждый день. При необходимости клетки могут быть собраны путем гравитационного осаждения и средств массовой информации заменен.
- Соберите otospheres на 10 день путем передачи в 15 мл конической и позволяя otospheres в осадок, как указано в шаге 1.6.Aspirate потраченные средства массовой информации, используя 2 мл пипетку аспирационные и оставить в покое otospheres.
- Исправление otospheres путем инкубации в 4% формальдегиде в 1X PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Удалить раствор формальдегида, мыть otospheres промывочным буфером (PBS 1X, содержащий 0,1% Тритон-100) перед инкубацией в блокирующем буфере (PBS, содержащий 1X 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100) в течение 1 ч.
- Замените буфер и инкубировать образцов в блокирующем буфере с разбавленной антитела. Инкубируйте при 4 ° С. Образцы промыть с 1X PBS, содержащий 0,1% в зависимости Тритон Х-100 в otosphere иммунным 27. Передача otospheres в 1X PBS и место otospheres в монтаже СМИ на стекло с помощью пипетки. P1000 Поместите покровное по образцу и позволяет монтировать носитель высохнуть при 4 ° С.
- Приобретение эпифлуоресцентной изображений с использованием инвертированного установки микроскопа, снабженного 16-битных ПЗС-камеры и либо 20X 0,75 воздухом или 40X 1,3 NA масло иммерсионный объектив. Сбор флуоресценции от различных цветовых каналов, используя перечисленные (возбуждение и излучение) длины волн: голубой (377 ± 25 нм / 447 ± 30 нм), зеленый (475 ± 25 нм / 540 ± 25 нм), красный (562 ± 20 нм / и 625 ± 20 нм) и инфракрасной (628 ± 20 нм / и 692 ± 20нм).
4. Опробование EDU Включение
- В день -3, пластина 1 × 10 6 клеток в ИМОП чашку диаметром 6 см. Три дня спустя в день 0, урожай, отделить, ресуспендируют и рассчитывать клетки, повторяя шаги 1.4-1.9.
- Тарелка 2,5 х 10 5 клеток в ИМОП медиакультуры и 5 x10 5 клеток в сенсорном эпителии дифференцировки в разных скважинах блюдо 6 а.
- Определить процент клеток в S фазе путем включения ОБР на 3 день с помощью анализа инкорпорации ОБРАЗОВАНИЕ
- Добавить ОБРАЗОВАНИЕ запас непосредственно к ИМОП культур, чтобы получить конечную концентрацию 1 мкМ ОБР в культуральной среде.
- Выдержите EDU в ИМОП культур в течение 2 ч и инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2. Урожай, диссоциируют и собирать клетки повторите шаги 1.4-1.9. Добавить в 4% формальдегиде в 1X PBS в течение 15 мин. при комнатной температуре, чтобы исправить клеток. Урожай клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить раствор формальдегида и properlу распоряжаться.
- Этикетка ядер клеток с Hoechst и включены EDU с зеленым флуоресцентным красителем азида в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: Все Все типы сделаны с 1X PBS, 3% BSA и 0,1% Твин 20. промыть клетки с 1X PBS дважды. - Mount клетки на слайде с помощью реагента antifade и поместите 1,5 покровного стекла по образцу. Приобретение флуоресцентные изображения меченых клеток с использованием эпифлуоресцентной микроскопии.
5. Дифференциация по линии ППМН-Производные Нейроны
- Сделайте 50 мл дифференцировки нейронов СМИ: Neurobasal медиа, 1X В27 дополнения, 2 мм L-Глютамин. Оттепели бутылка 50X В27 и 200 мМ L-глутамина в 37 ° C водяной бане в течение 5 мин. Добавить 1 мл 50X B27 и 0,5 мл 200 мм L-глютамин до 48,5 мл Neurobasal СМИ.
- Пальто покровного стекла путем размещения 12 мм круглые покровные стекла 1,5 в стерильной 10 см тарелку и добавить 70% этанола к пластине, чтобы стерилизовать и убрать покровные.
- Аккуратно агитировать бухтуrslips, чтобы они покрыты в этаноле. Оставьте пластину в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть покровные 3 раза стерильной 1X PBS, чтобы смыть оставшийся этанол. Промойте покровное раз стерильной H 2 0, чтобы смыть оставшийся 1X PBS.
- Аспирируйте H 2 0 с помощью 2 мл аспирационных пипетки и пусть покровные сухой. Expose покровные в УФ-свете в капюшоне культуры ткани в течение 15 мин. Магазин покровные в стерильной среде, если он не используется сразу.
- Поместите один 12 мм круглый покровное в каждую лунку блюдо 24 а. Встряхнуть тарелку аккуратно, чтобы обеспечить, что покровные лежать на дне колодца.
- Оттепели 2 мг / мл поли-D-лизина раствор при комнатной температуре и разбавляют до 10 мкг / мл поли-D-лизина в концентрации 1X PBS. Добавить 0,25 мл 10 мкг / мл поли-D-лизином в лунки. Оставьте пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
- Вымойте лунки 3 раза стерильной 1X PBS. Оттепели 10 мг / мл маточного раствора ламинин при комнатной температуре и разбавляют до 10 мкг / мл в 1X PBS. Добавить 0,25 мл 10 мкг / мл ламинина рабочего раствора в одну лунку 24 блюдо нескольких скважин. Инкубируйте планшет при 37 ° С инкубатор. Аспирата из ламинин решение, используя 2 мл аспирационной пипетки.
- Промыть покровное 3 раза 1X PBS, добавив в 1 мл PBS 1X с P1000 пипетки и удаление 1X PBS путем аспирации с 2 мл аспирационных пипетки. Оставить 1X PBS от последней промывки в скважине, пока клетки готовы быть покрыты. Инициирование дифференцировку нейронов посредством сбора диссоциации и подсчета клеток с шагом 1.4-1.9.Plate 1 х 10 6 клеток в чашку диаметром 6 см в день -3.
- На день 0, урожая, отделить и посчитать клетки, повторяя 1,4-1,9. Семена 1 х 10 5 - 1,5 · 10 5 клеток в ИМОП 0,5 мл предварительно нагретой среде для дифференцировки нейронов на лунку в 24-луночный нескольких блюдо. Аспирируйте и добавить подогретого дифференцировки нейронов средства массовой информации культур каждый день.
- Исправление ИМОП-производные нейроны в 4% формальдегиде в течение 15 мин.т РТ в День 7. Удалите раствора формальдегида, мыть ИМОП-производные нейроны промывочным буфером (PBS 1X, содержащим 0,1% Тритон Х-100) перед инкубацией в блокирующем буфере (PBS, содержащий 1X 10% нормальной козьей сыворотки и 0,1% Тритон Х-100) в течение 1 часа.
- Замените буфер и инкубировать образцов в блокирующем буфере с разбавленной антитела. Инкубируйте при 4 ° С. Образцы промыть с 1X PBS, содержащем 0,1% Triton X-100 при условии клетки иммунной метки 27. Вымойте покровного стекла с 1X PBS до размещения на монтажных средствах массовой информации. Разрешить монтажные средства массовой высохнуть при 4 ° С до приобретения эпифлуоресцентной изображения, как указано в шаге 3.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
оФРФ Снятие Уменьшает распространение в ППМН клеток
Для уменьшения пролиферативной способности клеток ИМОП и инициировать дифференцировку клеток ИМОП, оФРФ был снят из культур. Чтобы подтвердить, что фактор роста вывод уменьшается пролиферацию, EDU инкорпорация используется в качестве анализа пролиферации. Процент клеток, которые включены EDU с otospheres культивируемых с ИМОП культуральной среде (содержащей оФРФ) и otospheres, культивируемых в сенсорном эпителии СМИ (без оФРФ) сравнивали. Otosphere культуры импульсно с аналога нуклеотида EDU, заготовленной и фиксированной. Объединенный EDU нуклеотиды флуоресцентно помечены Alexafluor 488 азид с помощью щелчка химию. Клетки из otospheres выращенных в отсутствие оФРФ показали уменьшилось включение ОБРАЗОВАНИЕ относительно клеток, культивированных с оФРФ (1А-F). Как размер Oе otosphere увеличивается, это было более трудно представить себе все клетки из otosphere с эпифлуоресцентной микроскопом. Для решения этой проблемы, клетки диссоциируют и установлен таким образом, что они могут быть однозначно визуализируются в массе. Даже после диссоциации и фиксации, клетки вновь объединяются. Для поддержания клеток в состоянии диссоциированного, моющие средства, которые помешали клетки от повторной агрегации были испытаны. Твин 20 был одним из моющих средств, которые не позволили повторного агрегацию клеток. Разъединенные клетки промывали 0,1% Твин 20 и установлен на слайды. ОБРАЗОВАНИЕ меченые клетки затем визуализировали путем эпифлуоресцентной микроскопии (рис 1G, Н). Типичные результаты отдельных экспериментах (N = 5) показали значительное снижение в процентах от ОБР меченых клеток с 48% до 19% через 3 суток после оФРФ вывода (р <0,005). Эти результаты подтверждают резкое падение в процентах от S фазы клетки и пролиферативный потенциал клеток после ИМОПоФРФ вывод.
ИМОП полученных сенсорного эпителия Экспресс Cdkn1b и морфологических изменений Показать
График времени ИМОП сенсорной протокола эпителий дифференциации показано (рис 2а). Otospheres из пролиферативных культур диссоциируют на отдельные клетки и дают восстановиться в течение 3 дней в культуральной среде ИМОП. Этот метод помогает обогащения пролиферирующих клеток и выбирает против пост-митотических клеток в этих культурах, начиная. После 3-х дней, вновь образованные otospheres высевали в сенсорном эпителии среде для дифференцировки и позволили пройти неуправляемый дифференциации в течение 10 дней. Поле изображения Яркие типичных культур, содержащих otospheres в различные моменты времени после посева показали первоначальное снижение размера перед otospheres начать увеличиваются в размерах (2В-E).
27. Чтобы определить, выражение Cdkn1b (р27 KIP) может быть использован в качестве маркера для дифференциации, были сопоставлены с otospheres пролиферативных или сенсорного эпителия дифференцирован ИМОП культур. Флуоресцентные маркеры были визуализированы и захвачен эпифлуоресцентной микроскопии. Типичные изображения otospheres из пролиферативных культур показали низкую экспрессию Cdkn1b вне ядер почти без фаллоидином окрашивания (рис 3 н.э.). Otospheres, культивируемые в сенсорном эпителии дифференцировки отображается увеличенная экспрессия ядерного Cdkn1b одновременно с появлением фаллоидином маркировки в периферийных краев клеток (рис 3 ГБ). В пролиферирующих ИМОП otospheres, CDH1 (Е-cadheriп) и фаллоидином слабо помечены (фиг.3 Иллинойс). В дифференцированных ИМОП otospheres, выраженный фаллоидином и CDH1 маркировки выделить морфологические изменения в нитей актина и регионов межклеточной адгезии (рис 3 МП), аналогично предыдущим результатам 27. Во время сенсорной дифференциации эпителия, морфологические изменения в актина нитей, параллельных появление выражения CDH1 в адгезии между клетками сайтов. В этом протоколе, увеличение экспрессии Cdkn1b вместе с изменениями в фаллоидином и CDH1 служить ранние показатели сенсорной дифференциации эпителия в ИМОП клеток.
ИМОП полученных нейронов Экспресс Cdkn1b и Tubb3
Схема ИМОП протокола дифференцировки нейронов показано (рис 4а). Похожие вышеупомянутого Протокола, ИМОП клетки диссоциируют и дрмычали к восстановлению в течение 3 дней в культуральной среде ИМОП. Otospheres собирали, диссоциируют на отдельные клетки и высевают на поли-D-лизином и ламинин покрытием покровные. Клетки позволил дифференцировать в течение 7 дней. Типичные изображения яркие поля на временных точках отображается прогрессивные морфологические изменения, как они дифференцируются в ИМОП полученных из нейронов (рис 4B-E). Ко Дню 7, длинные невриты можно увидеть проходящую от клеточных тел (рис 4E наконечники стрел). Для определения изменений в уровнях экспрессии Cdkn1b во дифференцировки нейронов, пролиферирующих клеток и ИМОП ИМОП-производные нейроны были сопоставлены. Otospheres были помечены Hoechst и Cdkn1b антител. ИМОП клетки пролиферирующих otospheres было несколько клеток с низкой экспрессией ядерного Cdkn1b (рис 4 FH). Кроме того, ИМОП-производные нейроны показали увеличение числа клеток с выражением атомной Cdkn1b 7 дней после дифференцировки нейронов (рис 4И.К.). Чтобы определить, если клетки были Cdkn1b принятия нейронов происхождение, маркировка ИМОП полученных из нейронов с нейронной маркера Tubb3 было сделано. Типичные изображения ИМОП полученных из нейронов показали сотрудничество маркировку Cdkn1b и Tubb3 (Рисунок 5 AD). Увеличение и количественное определение нейритов из этих клеток показало среднее 1,5 невриты, связанные с каждым Tubb3 меченых клеток (N = 60) (рис 5 ЭГ). В нашем нейронов протокола дифференцировки, иммунным окрашиванием с Cdkn1b и Tubb3 может быть использован в качестве индикатора дифференцировки в биполярный или псевдо-однополярной ИМОП полученных нейронов.
Ядерная Cdkn1b Уровни экспрессии Увеличение после начала Дифференциация
Морфологические изменения в otospheres показать качественные изменения в ИМОП клеток, происходит их дифференциация. Для достижения количественных результатов от IMMUnofluorescence изображения для обозначения ранних событий дифференцировки, интенсивность флуоресценции ядерной Cdkn1b из отдельных пролиферирующих клеток ИМОП (N = 239) и ИМОП клеток, подвергающихся сенсорную дифференциации эпителия (п = 246) были измерены. Для нормализации Cdkn1b сигналов флуоресценции из независимых экспериментов, отношение Cdkn1b чтобы Hoechst флуоресценции от отдельных клеток определяли. Гистограммы нормированной интенсивности флуоресценции Cdkn1b из пролиферирующих клеток ИМОП (черный) и сенсорных эпителиев дифференциации клеток ИМОП (красный) были построены (рис 6а). Увеличение количества высоких Cdkn1b экспрессирующих клеток наблюдалось как сдвига вправо гистограммы для сенсорных дифференцировки эпителия (красный) по отношению к гистограмме пролиферирующих клеток ИМОП (черный). Чтобы определить увеличение доли клеток, экспрессирующих Cdkn1b, порог для нормализованных единицах интенсивности флуоресценции (0,65 Cdkn1b) был установлен (стрелка) и процент клеток о воспитании ве порог был определен. После сенсорной дифференциации эпителия, клетки ИМОП отображается увеличение с 25,3% до 67,1% клеток, экспрессирующих Cdkn1b (рис 6В). То же количественный анализ был применен к ИМОП-производных нейронов. При сравнении пролиферативные клетки ИМОП (п = 525) и 7 день ИМОП полученных нейроны (п = 583) а сдвиг вправо на гистограмме, связанной с ИМОП полученных нейронов наблюдается по отношению к гистограмме пролиферирующих клеток (ИМОП Рисунок 6в). Определение процента клеток выше порога показал увеличение Cdkn1b экспрессирующих клеток от 23,5% до 85,5% (рис 6D). Используя описанные протоколы, количественный анализ экспрессии Cdkn1b подтвердили увеличение количества клеток, которые активируют Cdkn1b во сенсорного эпителия и дифференцировке нейронов. Увеличение числа клеток, экспрессирующих Cdkn1b могут быть использованы для подтверждения дифференцировку клеток в ИМОП этих протоколов.
jove_content "FO: Keep-together.within-странице =" 1 ">
Рисунок 1. Включение EDU как тест, чтобы определить, пролиферативные государство ППМН культур. ИМОП полученных otospheres, культивируемые в присутствии оФРФ. Ядра клеток были помечены (A) Hoechst и (B) Edu Alexafluor 488. (C) объединены изображением Hoechst и EDU флуоресценции. Otospheres культивировали 3 дня в средствах массовой информации, не имеющих оФРФ. Клетки из культуры метили (D) Хехст и (Е) ОБРАЗОВАНИЕ Alexafluor 488. (F) Присоединяющимся изображений Hoechst и ОБР маркировки. Объединенные флуоресцентные изображения Hoechst (пурпурного) и ОБР (зеленый) меченых клеток после диссоциации otospheres и промывки ФБР, содержащим 1X 0,1% Твин 20. Клетки из otospheres культивируемых (G) в присутствии оФРФ или (H) отсутствие оФРФ. Длина шкалыбары 10 мкм, если указано. (I), Процент ОБР не меченых клеток из клеток, культивированных ИМОП в присутствии или в отсутствие оФРФ. Количество индивидуальных клеток анализируемых был обозначен в гистограммы и ошибок баров были изображены как стандартная ошибка среднего (SEM). Подсчет клеток с N = 5 независимых экспериментов. Т-тест Стьюдента было сделано для определения статистической значимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Общая схема сенсорного эпителия дифференциации. (А) Срок дифференциации клеток в ИМОП сенсорного эпителия. На линейном графике обозначает время клеточного распада и изменения информации. (В) Типичная фазового контрастаИзображения otospheres на день 0, (C) 3 (D) 7 и (Е) 10 во время неуправляемого сенсорной дифференциации эпителия. Длина масштабной линейки 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Экспрессия маркеров, которые указывают клеточного цикла и дифференциации в ППМН полученных сенсорного эпителия. Otosphere ППМН клеток, культивируемых в ИМОП культуральной среде. Ядра клеток были помечены (A) Hoechst и (б) Cdkn1b антитела. Фибриллярного актина метили (C) фаллоидином. (D), Объединенная образ типичного otospheres содержащих пролиферирующие клетки ИМОП. Otospheres из ИМОП клеток культивировали в сенсорной epithЭлия культура СМИ в течение 10 дней. Клетки из otopsheres были отмечены (E), Hoechst (F) Cdkn1b и (G) фаллоидином. (Н) Объединенные образ otospheres проявляют повышенный Cdkn1b и фаллоидином маркировку. Пролиферирующие otospheres были помечены (I) Hoechst (J) CDH1 (К) фаллоидином. (L), Объединенная изображение показывает слабую флуоресценцию от этих маркеров. Otospheres дифференцировались в сенсорные эпителия также помечены (М) Hoechst, (N) CDH1, (O) фаллоидином. (Р) Объединенная изображение показывает типичную сильный CDH1 и фаллоидином маркировку. Длина шкалы баров 10 мкм, если не указано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Общая схема дифференцировки нейронов. (А) Срок дифференциации клеток в ИМОП нейронов. Контрастные изображения Фазовые ИМОП клеток, подвергающихся дифференцировку нейронов в точке (В) День 1, (C) 3 (D) 5 и (E) 7. Наконечники указывают на невриты. Флуоресцентные изображения ИМОП клеток, культивированных, как otospheres в ИМОП культуральных сред, меченных (F) и Hoechst (G). Cdkn1b (Н) Объединенные образ клеток, меченных Hoechst и Cdkn1b. Флуоресцентные изображения ИМОП клеток после 7 дней культивирования нейронов дифференциации средств массовой информации. Ядра клеток были помечены (I) и Hoechst (J) Cdkn1b. (К) Объединенные образ клеток, меченных Hoechst и Cdkn1b. Длина шкалы баров 10 мкм, если не указано. ом / файлы / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Экспрессия молекулярных маркеров, указывающих на клеточный цикл и выход дифференцировки нейронов. ИМОП клетки через 7 дней после дифференцировки нейронов. Ядра были помечены (A) Hoechst, (б) Tubb3 (нейронов β-тубулина) антител, чтобы выделить клеточной морфологии и (с) Cdkn1b антитела. (D), объединенного изображения с маркировки Cdkn1b и Tubb3 в отдельных клетках. Длина масштабной линейки 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
OAD / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
6. Single Cell Количественный интенсивность флуоресценции Анализ Cdkn1b. (А) Интенсивность флуоресценции Нормированная экспрессии Cdkn1b определяли вычисления отношения Cdkn1b и Hoechst интенсивности флуоресценции от отдельных клеток. Нормированной интенсивности флуоресценции наносили на график по отношению к количества клеток в виде гистограммы. Нормированной интенсивности флуоресценции Cdkn1b из пролиферирующих ИМОП клеток, культивируемых в присутствии оФРФ (черный) и ИМОП otospheres дифференцировались в сенсорном эпителии (SE) (красный) показаны. Порог был установлен на 0.65 нормализованных единицах интенсивности флуоресценции (стрелок) (б) процент клеток, экспрессирующих ИМОП Cdkn1b выше порогового значения, от пролиферации (черный) и сенсорного эпителия дифференцирован культур (красный). (С) Объединенные флуоресцентное изображение сенсорного эпителия дифференцирован ИМОП клеток, меченных Hoechst и Myo6 антител. (D (Е) Процент ИМОП клеток, экспрессирующих Cdkn1b из пролиферирующих (черный) и нейронные дифференциации культур (красный). Отдельные клетки, используемые для анализа были обозначены в каждом гистограммы. Результаты были получены из различных экспериментов (N = 3), а столбец ошибки изображен СЭМ. Трет-критерий Стьюдента использовали для определения статистической значимости. (F), Объединенные флуоресцентное изображение биполярного или псевдо-униполярный ИМОП полученных нейронов, меченных Hoechst и Tubb3. Длина шкалы баров 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Культура клеток судно | Суrface Площадь (см 2) | Количество клеток, посеянных на текущий ремонт | Количество клеток, посеянных на сенсорном эпителии дифференциации | Количество клеток, посеянных на дифференцировку нейронов | Коэффициент масштабирования Относительная до 60 мм блюдо | Объем носителя, используемый (мл) | |
| Multwell Плиты | |||||||
| 96 | 0,3 | 10000 | 20000 | 10,000-50,000 | 0,015 | 0,1 | |
| 24 | 2 | 90000 | 180000 | 100,000-150,000 | 0,100 | 0,5 | |
| 12 | 4 | 180000 | 360000 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500000 | 1000000 | 500,000-750,000 | 0.500 | 2 | |
| Блюда | |||||||
| 35 мм | 10 | 500000 | 1000000 | 500000 | 0.500 | 2 | |
| 60 мм | 20 | 1000000 | 2000000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100 мм | 60 | 2500000 | 5000000 | 2,500,000- 3000000 | 3.000 | 8 | |
Таблица 1. Сотовые Номера для поддержания дифференциации клеток ППМН в Varдолговые расписки планшета для культуры ткани. Форматы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мониторинг линии ППМН культур
Протокол для поддержания самообновления и продвижение дифференциации нового линии клеток ИМОП описано и дополнительные форматы обшивки включены (таблица 1). Отмечены несколько важных шагов, которые помогут с рутинной расширения и дифференциации клеток ИМОП. Подобно плюрипотентных стволовых клеток культур, ИМОП клетки теоретически имеют неопределенный срок службы. Чтобы убедиться, что клеточные линии надлежащим образом, мониторинг ИМОП культуры обычно для жизнеспособности клеток, самообновления и дифференцировки потенциала. Для определения жизнеспособности клеток после диссоциации, мы используем трипанового синего окрашивания. В целом, более 70% клеток являются жизнеспособными после диссоциации. Для мониторинга самообновление клеток в ИМОП, иммуноокрашивания с-Мус и Sox2 антитела делается. Под пролиферативных условиях культивирования, ИМОП клетки имеют время удвоения ~ 18 часов. Изменения в экспрессии самообновления маркеров или сделатьubling время являются потенциальными показатели измененной самообновления. Для контроля дифференцировки потенциал ИМОП клеток, выход клеточного цикла и экспрессии маркеров ранней стадии для сенсорных нейронов эпителиальные или используются для оценки потенциала дифференциации клеток. Если ИМОП клетки не пройти любой из критериев, описанных выше, было бы целесообразно, чтобы прекратить культур.
Переменные, которые влияют на линии ППМН культур
Один важный шаг в культивировании клеток является ИМОП поддерживать активный концентрации оФРФ в культурах содействовать самообновление. оФРФ сообщается высокой лабильным при 37 ° С при культивировании клеток 29,30. Рост культур может быть существенно затронуты спонтанной дифференцировки из-за нестабильности оФРФ. В текущем протоколе, свежую среду непрерывно подают в культурах с целью поддержания уровня оФРФ выше 5 нг / мл. Стабилизация уровня оФРФ используя контролируемое высвобождение изгликолевая и полиэфирных микросфер молочнокислые может уменьшить частоту смены носителя, необходимых для поддержания устойчивых уровней оФРФ в средствах массовой информации 31. Добавление неуклонно высвобождаемым оФРФ снизит необходимость часто добавить массовой информации для поддержания уровня оФРФ в ИМОП культур.
Еще одним важным шагом в сохранении жизнеспособности клеток ИМОП, чтобы ограничить воздействие на диссоциации реагентов и механическим сдвигом. В текущем протоколе, диссоциации осуществляется путем инкубации с 1 мМ ЭДТА. Сдерживание чрезмерного время инкубации с ЭДТА, снижение чрезмерного механического сдвиг, вызванный активной пипетки и ограничения несколько шагов центрифугирования при пассажей ИМОП клетки помогут увеличить жизнеспособность клеток. Внимание уделено этих шагов могут эффективно поддерживать жизнеспособность больших количеств клеток в процессе расширения культур.
Во время процедуры культуре клеток ИМОП, были испытаны различные методы для диссоциации клеток. Mechanческих сдвига от пипетки можно использовать для диссоциации otospheres, но не равномерно или постоянно производить отдельные клетки. Использование имеющихся в продаже реагентов для сотовых диссоциации ИМОП клеток может эффективно генерировать отдельные клетки из otospheres, но эти реагенты влияют на адгезионные свойства клеток реформировать otospheres и придерживаться обработанных поверхностей. Для того чтобы использовать Коммерческие реагенты, несколько промывки необходимо удалить, прежде чем диссоциации реагентов с использованием протоколов дифференциации.
В современных протоколов дифференцировки, оба сенсорного эпителия и дифференцировке нейронов условия привели к гибели клеток, что наблюдалось в виде отдельных клеток или сгустки мертвых клеток. Гибель клеток путем апоптоза может быть связано с отсутствием соответствующих дифференцировки или выживания киев течение длительного культуры в пробирке. Оба условия дифференциации, содержащиеся В27 дополнение к способствовать выживанию клеток. Хотя B27 supplemENT было показано, способствует выживанию первичных нейронов гиппокампа 32, она не может быть достаточным для стимуляции выживания клеток ИМОП. Добавление соединений, таких как рок-ингибитора может помочь сохранить и увеличить выживаемость клеток ИМОП во время обычного культуре и в пробирке дифференциации. Ингибитор ROCK широко используется в плюрипотентных стволовых клеток культур способствовать выживанию клеток в сыворотке крови свободных культур, не влияющий на дифференциацию 33. Добавление ингибитора ROCK к культуральной среде может помочь увеличить выживаемость клеток в течение длительного протоколов дифференцировки, не затрагивая дифференциации потенциал ИМОП клеток. Увеличение выживаемость клеток позволит разработку протоколов для эффективного генерирования большого количества зрелых волосковых клеток или SGNs.
Увеличение Cdkn1b выражение, как ранним маркером ППМН дифференциации
Во время раннего развития улитки, исходное событие клеткивыход из цикла предшествует дифференциации для волосковых клеток, поддерживающих клеток и SGNs 34. Терминал митоза нейронов предшественников распространяется в волне, начиная от основания и движется к вершине улитки 35. В противоположной градиента, терминал митоз prosensory предшественников, которые дают начало волосковых клеток и поддерживающих клеток прогрессирует от вершины к основанию улитки 34,36. Хотя временная выражение Cdkn1b хорошо коррелирует с постмитотические государства, это, скорее всего, не является единственным фактором, который способствует выходу клеточного цикла в развивающихся улитки. В поддержку этого, Cdkn1b мутантные животные могут по-прежнему развиваться постмитотические волосковые клетки 37. Вместо этого, Cdkn1b может быть использован в качестве раннего индикатора для обозначения начала дифференциации. В неуправляемых культур ИМОП дифференцировки, ранним маркером для дифференциации будет оказывать помощь в разработке протоколов для содействия ранние этапы дифференцировки, прежде чем очевидные морфологические особенности можно наблюдать. </ P>
Подобно слухового развития, выход из цикла инициирует дифференциацию и приводит к увеличению уровней Cdkn1b в ИМОП клеток. В пролиферирующих клеток ИМОП, только низкая экспрессия уровень Cdkn1b можно наблюдать. Другие циклинзависимой ингибиторов киназы, такие как p21 CDKN1A (CIP) могут быть ответственны за развитие нормального клеточного цикла в клетках ИМОП. Во сенсорного эпителия и дифференцировке нейронов из клеток ИМОП, одна ячейка Количественный анализ показал подмножество клеток с увеличением экспрессии Cdkn1b в дифференциации ИМОП культур (фиг.6А, В). Выражение Cdkn1b в этих клетках являются показателем ИМОП клеток, подвергающихся терминальную дифференцировку.
ППМН Клетки как сотовый платформы для изучения клеток Судьба Определение
Так ИМОП клетки могут переходить из состояния предшественников в различных слуховых линий в пробирке, они могут быть использованы для изучения ушные судьбу клеткиопределение. В настоящее время описано протокол, используемый неуправляемые процедуры дифференциации для создания различных типов клеток отические. Система ИМОП позволяет добавлением биологически активных молекул, соединений и определенных генов, которые определяют ИМОП клетки к клетке зрелых волос, опорной клетки и SGN линий. Один из вариантов использования ИМОП сотовой платформы для проверки кандидатов переложений факторов (ТФ), которые способствуют дифференциации. Выражение ключа TF может быть использован для ячейки волос или дифференцировку нейронов. Выражение Cdkn1b вместе с установленными маркерами или морфологических особенностей волосковых клеток и SGNs могут быть использованы для определения вклада кандидатов ТФ в различных слуховых линий 38,39.
Кандидаты ТФ, такие как Atoh1 имеют важное значение для развития волосковых клеток и были перепрофилированы для содействия дифференциации клеток волос в поврежденной улитки 40,41. Введение Atoh1 в ИМОП клеток может способствовать дифференциации клеток волос. В developiнг улитку, и Ngn1 и NeuroD1 необходимы для правильной дифференциации SGN в естественных условиях 42-44. Выражение Ngn1 или NeuroD1 в ИМОП клеток может способствовать SGN дифференциации. Эти эксперименты аналогичны генерирующих индуцированных нервных клеток (In), где выражение ТФ отдельности или в комбинации могут преобразовывать фибробласты или плюрипотентных стволовых клеток в нейроны 45-48. Введение ТФ, что, как правило, высказанных в ходе развития волосковых клеток или SGNs это хорошая стратегия для направления ИМОП клетки к клетке волос или SGN линии.
Условия, которые способствуют дифференциации большого количества ИМОП полученных волосковых клеток и SGNs обеспечит надежную сотовую платформу для моделирования заболевания, скрининг небольшой молекулы и токсикологии тестирования, которые можно выполнить быстро и экономически эффективно, прежде чем трудоемкие тесты на грызунах инициируются , Протокол, описанный представляет собой простой и универсальная система, которая может быть использована для Studying ушные дифференциацию предшественников и поддается крупных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
- Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
- Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
- Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
- Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
- Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
- Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
- Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
- Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
- Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314 (2013).
- Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
- Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
- Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
- Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
- Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
- Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
- Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289 (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
- Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
- Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
- Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
- Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
- Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).
