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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

अमर multipotent Otic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में भेदभाव की शुरुआत

Published: January 2, 2016 doi: 10.3791/53692
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University
* These authors contributed equally

Protocol

1. IMOP प्रकोष्ठों में आत्म नवीकरण को बनाए रखने

  1. संस्कृति मीडिया iMOP तैयार: DMEM / F12, 1X B27 पूरक, 25 माइक्रोग्राम / एमएल carbenecillin और 20 एनजी / एमएल bFGF। बाँझ अभिकर्मकों का उपयोग iMOP संस्कृति मीडिया के 50 मिलीलीटर बनाओ। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में DMEM / F12 के 49 मिलीलीटर गर्म।
    1. पिघलना 50X B27 पूरक और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए फिल्टर निष्फल 100 मिलीग्राम / एमएल carbenecillin aliquots। आरटी पर 100 माइक्रोग्राम / एमएल bFGF विभाज्य बाहर गला लें। जोड़ें 1 मिलीलीटर 50X B27, 100 माइक्रोग्राम / एमएल bFGF के 10 μl और DMEM / F12 में 100 मिलीग्राम / एमएल carbenecillin की 12.5 μl।
  2. संवर्धन iMOP कोशिकाओं के लिए एक 60 मिमी टिशू कल्चर पकवान में मीडिया के 3 एमएल का प्रयोग करें। मीडिया की मात्रा को दोगुना से हर दूसरे दिन संस्कृतियों के लिए नए सिरे से मीडिया जोड़ें। BFGF की है कि एकाग्रता 5 एनजी / एमएल नीचे नहीं छोड़ देता है सुनिश्चित करें।
    1. नीचे दिए गए चरणों में सूचीबद्ध के रूप में संस्कृति में 7 दिन - 5 के बाद 5% सीओ 2 के पारित होने कोशिकाओं के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति iMOP कोशिकाओं। एक 15 पर स्थानांतरण संस्कृतिएक 10 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग मिलीलीटर शंक्वाकार।
  3. HBSS के 50 मिलीलीटर में 0.5 एम EDTA पीएच 8.0 से 0.1 मिलीग्राम गिराए द्वारा HBSS में 1 मिमी EDTA बनाओ। पूर्व गर्म 1 मिमी EDTA एक ​​37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में HBSS में बनाया है।
  4. गुरुत्वाकर्षण अवसादन या 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। आरटी पर। 10 मिनट - गुरुत्वाकर्षण अवसादन के लिए, 5 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृतियों युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार जगह है। उस समय के बाद, otospheres 15 मिलीलीटर शंक्वाकार के तल पर इकट्ठा निरीक्षण करते हैं।
    नोट: अत्यधिक केन्द्रापसारक बल सेल नुकसान का कारण बन सकता है।
  5. ध्यान से महाप्राण सेल गोली परेशान बिना पिपेट aspirating एक 2 मिलीलीटर का उपयोग कर मीडिया बिताया। गोली सेल पूर्व गर्म 1 मिमी EDTA HBSS समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। एक P1000 विंदुक का प्रयोग, धीरे से ऊपर pipet और नीचे 2-3 बार। 37 डिग्री सेल्सियस पर शंक्वाकार रखें और एकल कक्षों में हदबंदी की सुविधा के लिए <5 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. धीरे otospheres अलग हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए सेल समाधान ज़ुल्फ़। कोई oto हैंक्षेत्रों शंक्वाकार की तह तक तलछट, कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं। गर्मी के समय भिन्न हो सकते हैं।
    नोट: EDTA के साथ लंबे समय तक ऊष्मायन अत्यधिक कोशिका मृत्यु का परिणाम देगा।
  7. , 37 डिग्री सेल्सियस से कोशिकाओं को हटाने EDTA बेअसर और कमजोर करने के लिए मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए। महाप्राण बाहर एक 2 मिलीलीटर aspirating पिपेट का उपयोग और कोशिकाओं को धोने के लिए 1X पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ने EDTA पतला।
  8. आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG कोशिकाओं नीचे स्पिन और एक 2 मिलीलीटर aspirating पिपेट का उपयोग 1X पीबीएस बाहर निकालना। 3 बार - धीरे नीचे 2 Pipetting और iMOP संस्कृति मीडिया के 0.5 मिलीलीटर में एक P1000 विंदुक का उपयोग कोशिकाओं Resuspend।
  9. उचित कैसेट 28 के साथ एक microfluidic कण काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना। IMOP कोशिकाओं के एक मिला हुआ प्लेट ~ 6 x 10 6 कोशिकाओं में शामिल होंगे। मीडिया में 100 और गिनती के लिए कैसेट में सेल के समाधान के 75 उल जोड़ें: कोशिकाओं 1 पतला। IMOP cultu में एक 6 सेमी पकवान में प्लेट 1 एक्स 10 6 कोशिकाओंमीडिया फिर से (~ 1: 10 कमजोर पड़ने)। पैसेज iMOPs हर 5-7 दिनों के लिए।
    नोट: बड़े otospheres फार्म या अलग होगा टिशू कल्चर डिश के तल के लिए देते हैं कि प्रकोष्ठों। संस्कृतियों मिला हुआ खत्म हो गई हैं, तो कोशिकाओं को भी मर जाएगा।

2. ठंड और विगलन IMOP प्रकोष्ठों

  1. विगलन और पूर्व ठंड कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस का हल equilibrating द्वारा सिंथेटिक ठंड माध्यम से तैयार करें।
  2. IMOP कोशिकाओं का एक मिला हुआ 6 सेमी पकवान से कोशिकाओं को इकट्ठा। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में - (8 x 10 6 कोशिकाओं ~ 6) एक 10 मिलीलीटर पिपेट और हस्तांतरण कोशिकाओं का प्रयोग करें।
  3. गुरुत्वाकर्षण अवसादन या आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। Otospheres छोटे हैं, तो कोशिकाओं गुरुत्वाकर्षण अवसादन से समझौता नहीं होगा। वैकल्पिक: कुल सेल नंबर निर्धारित करने के लिए कदम 1.9 का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  4. महाप्राण पीछे ढीला सेल गोली जाते वक्त पिपेट aspirating एक 2ml मीडिया का इस्तेमाल कर बिताया।
  5. सीई resuspend करने के लिए सिंथेटिक ठंड मीडिया के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें~ 5 एक्स 10 5 6 से 10 एक्स 3 के लिए कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर LLS। धीरे एक P1000 विंदुक के साथ कोशिकाओं विंदुक। टिप फ़िल्टर्ड 1 मिलीलीटर के साथ एक P1000 पिपेट का उपयोग क्रायोजेनिक शीशियों सेल निलंबन स्थानांतरण।
  6. एक शराब मुक्त ठंड कंटेनर में शीशियों रखें और तापमान पहुंचता है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट तापमान 1 डिग्री सेल्सियस कम करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड कंटेनर जगह है।
  7. कोशिकाओं की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक की भाप चरण के लिए शीशियों हस्तांतरण। संस्कृति के लिए कोशिकाओं पिघलना करने के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए कोशिकाओं से युक्त क्रायोजेनिक शीशी संतुलित करना।
  8. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गर्म iMOP संस्कृति मीडिया।
  9. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी के नीचे घूमता द्वारा जल्दी से जमे हुए शीशी पिघलना। पिछले बर्फ क्रिस्टल गायब हो जाता है एक बार thawed कोशिकाओं के लिए पूर्व गर्म iMOP संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें। स्थानांतरण एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में कोशिकाओं और iMOP संस्कृति मीडिया के एक अतिरिक्त 4 मिलीलीटर जोड़ें
  10. 15 मिलीलीटर सह स्पिन5 मिनट के लिए nical। 200 XG पर खर्च मीडिया महाप्राण और। एक 6 सेमी डिश में iMOP संस्कृति मीडिया और प्लेट कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend। विस्तार के लिए 5% के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 संस्कृतियों सेते हैं।

3. संवेदी epithelia में IMOP फर्क कोशिकाओं

  1. DMEM / F12, 1X B27 पूरक, 25 माइक्रोग्राम / एमएल carbenecillin: iMOP संवेदी epithelia भेदभाव मीडिया के 50 मिलीलीटर की तैयारी। IMOP संवेदी epithelia भेदभाव मीडिया के 50 मिलीलीटर बनाओ। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में DMEM / F12 के 49 मिलीलीटर गर्म। पिघलना 50X B27 पूरक और 5 मिनट के लिए 100 मिलीग्राम / एमएल carbenecillin aliquots। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में। 1 मिलीलीटर 50X B27 और DMEM / F12 में 100 मिलीग्राम / एमएल carbenecillin की 12.5 μl जोड़ें।
  2. , फसल, resuspend अलग कर देना और गिनती के लिए कोशिकाओं 1.4-1.9 चरणों को दोहराएँ
  3. डे -3 संस्कृति मीडिया iMOP का उपयोग करने पर एक 6 सेमी पकवान में प्लेट 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं। 0 दिवस पर, हस्तांतरण संस्कृतियों एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग। ओटो लीजिएगुरुत्वाकर्षण अवसादन द्वारा क्षेत्रों के रूप में 1.6 चरण में कहा गया है। महाप्राण बाहर पिपेट aspirating एक 2 मिलीलीटर का उपयोग कर मीडिया बिताए और शंक्वाकार के तल पर otospheres छोड़ दें।
  4. धीरे संवेदी epithelia भेदभाव मीडिया के 2 मिलीलीटर में जोड़ें। स्थानांतरण एक बड़ी बोर 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 6 सेमी डिश के लिए otospheres।
    नोट: कठोर pipetting से यांत्रिक बाल काटना otospheres से कोशिकाओं को अलग कर देना कर सकते हैं।
  5. हर दूसरे दिन संस्कृतियों के लिए ताजा संवेदी उपकला भेदभाव मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। यदि आवश्यक हो, कोशिकाओं की जगह गुरुत्वाकर्षण अवसादन और मीडिया द्वारा एकत्र किया जा सकता है।
  6. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार को स्थानांतरित करने और otospheres कदम में कहा गया है के रूप में खर्च मीडिया पिपेट aspirating एक 2 मिलीलीटर का उपयोग कर 1.6.Aspirate तलछट और अबाधित otospheres छोड़ने के लिए अनुमति देकर 10 दिन में otospheres लीजिए।
  7. आरटी पर 15 मिनट के लिए 1X पीबीएस में 4% formaldehyde में incubating द्वारा otospheres को ठीक करें। Formaldehyde के समाधान निकालें धोने बफर (1X पीबीएस 0.1% TritonX -10 युक्त साथ otospheres धोने0) बफर अवरुद्ध में incubating से पहले (1X पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम और 1 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन X-100) युक्त।
    1. बफर बदलें और पतला एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध बफर में नमूने सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 1X पीबीएस 27 immunostaining को 0.1% ट्राइटन X-100 विषय otosphere युक्त साथ धो नमूने हैं। एक P1000 पिपेट का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते मीडिया में 1X पीबीएस में स्थानांतरण otospheres और जगह otospheres। नमूना भर में एक coverslip रखो और बढ़ते मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं।
  8. एक 16 बिट सीसीडी कैमरा और एक 20X 0.75 हवा या एक 40x 1.3 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग epifluorescence छवियों मोल। नीला (377 ± 25 एनएम / 447 ± 30 एनएम), हरे (475 ± 25 एनएम / 540 ± 25 एनएम), लाल (562 ± 20nm / और 625: सूचीबद्ध (उत्तेजना और उत्सर्जन) तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर विभिन्न रंग चैनलों से प्रतिदीप्ति लीजिए ± 20nm) और अवरक्त (628 20nm ± / और 692 ± 20एनएम)।

4. परख edu निगमन

  1. डे -3 पर, एक 6 सेमी डिश में 1 एक्स 10 6 iMOP थाली कोशिकाओं। तीन दिन बाद दिवस 0 पर, फसल, अलग कर देना, resuspend और कदम 1.4-1.9 दोहरा द्वारा कोशिकाओं की गिनती।
  2. प्लेट iMOP संस्कृति मीडिया में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं और एक 6 अच्छी तरह से पकवान के विभिन्न कुओं में संवेदी epithelia भेदभाव मीडिया में 5 X10 5 कोशिकाओं।
  3. एक edu समावेश परख का उपयोग करके 3 दिन edu समावेश से एस चरण में कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित
    1. संस्कृति मीडिया में 1 माइक्रोन edu के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए iMOP संस्कृतियों के लिए सीधे edu शेयर जोड़ें।
    2. 2 घंटे के लिए iMOP संस्कृतियों में edu सेते हैं और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। हार्वेस्ट, अलग कर देना और इकट्ठा कोशिकाओं कदम 1.4-1.9 दोहराएँ। 15 मिनट के लिए 1X पीबीएस में 4% formaldehyde में जोड़ें। आरटी पर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए। आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। Formaldehyde समाधान और properl हटायेY निपटाने।
    3. लेबल Hoechst के साथ कोशिकाओं के नाभिक और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार हरी प्रतिदीप्ति डाई azide के साथ edu शामिल किया।
      नोट: सभी washes 1X पीबीएस, दो बार 1X पीबीएस के साथ 3% BSA और 0.1% के बीच 20 धो कोशिकाओं के साथ किया जाता है।
    4. और antifade अभिकर्मक का उपयोग कर एक स्लाइड पर माउंट कोशिकाओं नमूना भर में एक 1.5 कवर कांच जगह है। एक epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग लेबल की कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों मोल।

5. IMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स फर्क

  1. Neurobasal मीडिया, 1X B27 पूरक, 2 मिमी एल Glutamine: न्यूरोनल भेदभाव मीडिया के 50 मिलीलीटर बनाओ। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 50X B27 और 200 मिमी एल glutamine का पिघलना बोतल। Neurobasal मीडिया के 48.5 मिलीलीटर 1ml 50X B27 और 0.5 मिलीलीटर 200 मिमी एल glutamine जोड़ें।
  2. एक बाँझ 10 सेमी की थाली में गोल 12 मिमी 1.5 कांच coverslips रखने और निष्फल और coverslips साफ करने के लिए थाली करने के लिए 70% EtOH के ऐड से कोट coverglass।
  3. धीरे कोव आंदोलनrslips वे इथेनॉल में कवर कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए। आरटी पर 10 मिनट के लिए थाली छोड़ दें। शेष इथेनॉल बाहर धोने के लिए बाँझ 1X पीबीएस के साथ coverslips 3 बार कुल्ला। 1X पीबीएस शेष बाहर धोने के लिए बाँझ एच 2 0 के साथ एक बार coverslip कुल्ला।
  4. पिपेट aspirating एक 2 मिलीलीटर का उपयोग करते हुए एच 2 0 Aspirate और coverslips सूखी। 15 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड में पराबैंगनी प्रकाश में coverslips बेनकाब। तुरंत इस्तेमाल नहीं करता है, तो स्टोर एक बाँझ वातावरण में coverslips।
  5. एक 24 अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक कुएं में एक 12 मिमी दौर coverslip रखें। Coverslips अच्छी तरह से नीचे पर फ्लैट झूठ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे थाली हिला।
  6. पिघलना 2 मिलीग्राम / 1X पीबीएस में एक 10 माइक्रोग्राम / एमएल पाली डी lysine एकाग्रता के लिए आरटी पर पाली डी lysine शेयर समाधान मिलीग्राम और पतला। 10 स्नातकीय / एमएल पाली डी lysine के 0.25 मिलीलीटर कुओं में जोड़े। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली छोड़ दें।
  7. बाँझ 1X पीबीएस के साथ कुओं 3 बार धोएं। आरटी पर 10 मिलीग्राम / एमएल laminin स्टॉक समाधान और पिघलना 10 माइक्रोग्राम / मी के लिए पतला1X पीबीएस में एल। जोड़ें 10 माइक्रोग्राम एक 24 बहु अच्छी तरह से पकवान का एक भी कुएं में काम कर समाधान / एमएल laminin की 0.25 मिलीलीटर। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं। एक 2 मिलीलीटर aspirating पिपेट का उपयोग laminin समाधान बाहर Aspirate।
  8. एक P1000 विंदुक के साथ 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर में जोड़ने और पिपेट aspirating एक 2 मिलीलीटर के साथ aspirating द्वारा 1X पीबीएस हटाने के द्वारा coverslip 1X पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। कोशिकाओं चढ़ाया जा करने के लिए तैयार हैं जब तक अच्छी तरह से में पिछले धोने से 1X पीबीएस छोड़ दें। बवाल और दिन -3 में एक 6 सेमी डिश में चरणों में 1.4-1.9.Plate 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं कोशिकाओं की गिनती, कटाई से neuronal भेदभाव आरंभ।
  9. 0 दिवस, फसल को अलग कर देना और 1.4-1.9 दोहरा द्वारा कोशिकाओं की गिनती। बीज 1 एक्स 10 5 - अच्छी तरह से में एक 24 बहु अच्छी तरह से पकवान प्रति पूर्व गर्म न्यूरोनल भेदभाव मीडिया 0.5 मिलीलीटर में 10 x 5 iMOP कोशिकाओं 1.5। महाप्राण और हर दूसरे दिन संस्कृतियों के लिए पूर्व गर्म neuronal भेदभाव मीडिया जोड़ें।
  10. 15 मिनट के लिए 4% formaldehyde में iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स को ठीक करें। एटी आर टी 7 दिन निकालें formaldehyde समाधान पर, धोने बफर के साथ iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स धो बफर अवरुद्ध में incubating से पहले (1X पीबीएस 0.1% TritonX-100 युक्त) (1X पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम और 0.1% से युक्त ट्राइटन X-100) 1 घंटे के लिए।
    1. बफर बदलें और पतला एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध बफर में नमूने सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 1X पीबीएस 0.1% ट्राइटन X-100 विषय कोशिकाओं से युक्त साथ धो नमूने 27 immunostaining करने के लिए। बढ़ते मीडिया पर रखने से पहले 1X पीबीएस के साथ coverglass धो लें। बढ़ते मीडिया 3.8 चरण में सूचीबद्ध के रूप में epifluorescence छवियों को प्राप्त करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर सूखे की अनुमति दें।

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Representative Results

IMOP प्रकोष्ठों में bFGF निकासी घटने प्रसार

IMOP कोशिकाओं के proliferative क्षमता कम होती है और iMOP कोशिकाओं के भेदभाव को आरंभ करने के लिए, bFGF संस्कृतियों से वापस ले लिया गया। वृद्धि कारक वापसी प्रसार कम हो जाती है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए, edu समावेश प्रसार परख के रूप में नियुक्त किया गया था। (bFGF के बिना) iMOP संस्कृति मीडिया (bFGF युक्त) और संवेदी epithelia मीडिया में सुसंस्कृत otospheres साथ सुसंस्कृत otospheres से edu शामिल है कि कोशिकाओं के प्रतिशत की तुलना में था। Otosphere संस्कृतियों काटा और तय न्यूक्लियोटाइड अनुरूप शिक्षा, साथ स्पंदित कर रहे थे। शामिल edu न्यूक्लियोटाइड fluorescently Alexafluor 488 azide के लिए क्लिक करें-रसायन विज्ञान का उपयोग के साथ लेबल रहे थे। BFGF के अभाव में हो otospheres से कोशिकाओं bFGF (चित्रा 1 ए-एफ) के साथ संवर्धित कोशिकाओं को edu रिश्तेदार के समावेश में कमी आई दिखाया। आकार ओ के रूप मेंच otosphere यह एक epifluorescent खुर्दबीन के साथ otosphere से सभी कोशिकाओं कल्पना करने के लिए तेजी से मुश्किल था, वृद्धि हुई है। यह पता करने के लिए, कोशिकाओं को अलग और वे स्पष्ट रूप से जन एन देखे जा सकते हैं कि इतनी बढ़ रहे थे। यहाँ तक कि हदबंदी और निर्धारण के बाद, कोशिकाओं एकत्रित कर रहे हैं। एक अलग राज्य में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, फिर से कुल से कोशिकाओं को रोका कि डिटर्जेंट परीक्षण किया गया। बीच 20 कोशिकाओं की फिर से एकत्रीकरण रोका कि डिटर्जेंट में से एक था। अलग कोशिकाओं 0.1% के बीच 20 से धोया और स्लाइड पर घुड़सवार थे। Edu लेबल कोशिकाओं तो epifluorescence माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1G, एच) द्वारा कल्पना थे। अलग-अलग प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणाम (एन = 5) edu के प्रतिशत में एक महत्वपूर्ण कमी bFGF वापसी (पी <0.005) के बाद 3 दिनों के बाद 19% से 48% से कोशिकाओं लेबल दिखाया। इन परिणामों के एस चरण कोशिकाओं का प्रतिशत और iMOP कोशिकाओं के proliferative संभावित बाद में काफी कमी की पुष्टिbFGF वापसी।

IMOP व्युत्पन्न संवेदी epithelia एक्सप्रेस Cdkn1b और दिखाएँ रूपात्मक बदलाव

IMOP संवेदी epithelia भेदभाव प्रोटोकॉल का एक समय (2A चित्रा) दिखाया गया है। Proliferative संस्कृतियों से Otospheres एकल कक्षों में अलग और iMOP संस्कृति मीडिया में 3 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी गई। इस विधि को इन शुरू कर संस्कृतियों में बाद mitotic कोशिकाओं के खिलाफ कोशिकाओं और चयन proliferating लिए समृद्ध मदद करता है। 3 दिनों के बाद, नवगठित otospheres संवेदी epithelia भेदभाव मीडिया में वरीयता प्राप्त और 10 दिनों के लिए अनिर्देशित भेदभाव से गुजरना करने के लिए अनुमति दी गई। Otospheres आकार (चित्रा 2 बी-ई) में वृद्धि हो रही शुरू होने से पहले बोने के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर otospheres युक्त ठेठ संस्कृतियों के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के आकार में एक प्रारंभिक कमी देखी गई।

27 की रूपात्मक और आणविक विशेषताओं को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था आणविक मार्कर के साथ immunostaining iMOP कोशिकाओं के भेदभाव के दौरान होने वाले परिवर्तनों के कई का खुलासा नहीं कर सकते हैं। Cdkn1b (p27 रात बिताने का स्थान) की अभिव्यक्ति भेदभाव के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता, तो यह निर्धारित करने के लिए, proliferative या संवेदी epithelia विभेदित iMOP संस्कृतियों से otospheres तुलना में थे। फ्लोरोसेंट मार्करों कल्पना और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा कब्जा कर लिया गया। Proliferative संस्कृतियों से otospheres की छवियों प्रतिनिधि लगभग कोई phalloidin धुंधला (चित्रा 3 ई) के साथ नाभिक के बाहर Cdkn1b की कम अभिव्यक्ति दिखाया। संवेदी epithelia भेदभाव मीडिया में सुसंस्कृत Otospheres कोशिकाओं (चित्रा 3 एह) के परिधीय किनारों में phalloidin लेबलिंग की उपस्थिति के साथ परमाणु Cdkn1b सहवर्ती की अभिव्यक्ति की वृद्धि हुई प्रदर्शन किया। Proliferating iMOP otospheres में, Cdh1 (ई-cadheriएन) और phalloidin दुर्बलता (चित्रा 3 आईएल) लेबल रहे हैं। विभेदित iMOP otospheres में, स्पष्ट phalloidin और Cdh1 लेबलिंग एक्टिन तंतु और पिछले परिणामों 27 के समान सेल सेल आसंजन (चित्रा 3 सांसद), के क्षेत्रों में morphological परिवर्तन पर प्रकाश डाला। संवेदी epithelia भेदभाव के दौरान, एक्टिन तंतु में morphological परिवर्तन की कोशिकाओं के बीच आसंजन साइटों में Cdh1 अभिव्यक्ति की उपस्थिति समानांतर। इस प्रोटोकॉल में, phalloidin और Cdh1 में परिवर्तन के साथ-साथ Cdkn1b अभिव्यक्ति में वृद्धि iMOP कोशिकाओं में संवेदी epithelia भेदभाव के रूप में जल्दी संकेतक सेवा करते हैं।

IMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स एक्सप्रेस Cdkn1b और Tubb3

IMOP neuronal भेदभाव प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध (चित्रा 4 ए) दिखाया गया है। ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के लिए इसी प्रकार, iMOP कोशिकाओं अलग और अल थेiMOP संस्कृति मीडिया में 3 दिनों के लिए वसूली करने के लिए इजाजत दे दी। Otospheres काटा गया, एकल कक्षों में अलग और पाली-डी-लाइसिन और laminin लेपित coverslips पर वरीयता प्राप्त। कोशिकाओं 7 दिनों के लिए अंतर करने के लिए अनुमति दी गई। वे iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स (चित्रा 4 बी-ई) में भेदभाव के रूप में समय बिंदुओं पर प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों प्रगतिशील रूपात्मक बदलाव का प्रदर्शन किया। 7 दिन के द्वारा, लंबे neurites सेल निकायों (चित्रा 4E तीर) से देने में देखा जा सकता है। IMOP कोशिकाओं और iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स proliferating, न्यूरोनल भेदभाव के दौरान Cdkn1b की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए की तुलना में थे। Otospheres Hoechst और Cdkn1b एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे। proliferating otospheres से iMOP कोशिकाओं कम परमाणु Cdkn1b अभिव्यक्ति (चित्रा 4 एफ एच) के साथ कुछ कोशिकाओं था। इसके अलावा, iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स 7 दिन neuronal भेदभाव (चित्रा 4 के बाद परमाणु Cdkn1b अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि देखी गईइंद्रकुमार)। Cdkn1b कोशिकाओं को एक न्यूरोनल वंश को गोद लेने गए थे, तो यह निर्धारित करने के लिए, neuronal मार्कर Tubb3 साथ iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की लेबलिंग किया गया था। IMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की छवियों प्रतिनिधि Cdkn1b और Tubb3 (चित्रा 5 ईसवी) के सह-लेबलिंग से पता चला है। बढ़ाई और इन कोशिकाओं से neurites की मात्रा का ठहराव प्रत्येक Tubb3 के साथ जुड़े एक औसत 1.5 neurites सेल लेबल दिखाया (एन = 60) (5 चित्रा ईजी)। Cdkn1b और Tubb3 साथ immunostaining हमारे neuronal भेदभाव प्रोटोकॉल में द्विध्रुवी या छद्म एकध्रुवीय iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में भेदभाव का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

परमाणु Cdkn1b अभिव्यक्ति के स्तर भेदभाव की शुरुआत के बाद बढ़ाएँ

वे भेदभाव से गुजरना रूप otospheres में रूपात्मक बदलाव iMOP कोशिकाओं में गुणात्मक परिवर्तन दिखा। Immu से मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिएnofluorescence छवियों जल्दी भेदभाव की घटनाओं, संवेदी epithelia भेदभाव के दौर से गुजर व्यक्ति proliferating iMOP कोशिकाओं (एन = 239) और iMOP कोशिकाओं से Cdkn1b के परमाणु प्रतिदीप्ति तीव्रता निरूपित करने के लिए (एन = 246) मापा गया। स्वतंत्र प्रयोगों से Cdkn1b प्रतिदीप्ति संकेतों को सामान्य करने के लिए, व्यक्ति की कोशिकाओं से Hoechst प्रतिदीप्ति को Cdkn1b का अनुपात निर्धारित किया गया था। IMOP कोशिकाओं (लाल) फर्क proliferating iMOP कोशिकाओं (काला) और संवेदी epithelia से Cdkn1b की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता के histograms (चित्रा 6A) प्लॉट किए जाते थे। उच्च Cdkn1b व्यक्त कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है proliferating iMOP कोशिकाओं (काला) के लिए हिस्टोग्राम के लिए संवेदी epithelia भेदभाव (लाल) रिश्तेदार के लिए हिस्टोग्राम की दाहिनी ओर बदलाव के रूप में मनाया गया। Cdkn1b, सामान्यीकृत Cdkn1b प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों के लिए एक सीमा (0.65) व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत में वृद्धि का निर्धारण करने के लिए सेट (नोक) और कोशिकाओं का प्रतिशत abo था सीमा निर्धारित किया गया था लिया है। संवेदी epithelia भेदभाव के बाद, iMOP कोशिकाओं Cdkn1b (चित्रा 6B) व्यक्त कोशिकाओं के 67.1% से 25.3% से बढ़कर प्रदर्शन किया। एक ही मात्रात्मक विश्लेषण iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के लिए लागू किया गया था। (एन = 583) proliferative iMOP कोशिकाओं की तुलना (एन = 525) और 7 दिन iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स जब iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के साथ जुड़े हिस्टोग्राम में एक दाहिनी ओर शिफ्ट iMOP कोशिकाओं (चित्रा 6C) proliferating लिए हिस्टोग्राम के सापेक्ष मनाया गया। सीमा से ऊपर कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित 85.5% (चित्रा 6D) के लिए 23.5% से Cdkn1b व्यक्त कोशिकाओं में वृद्धि का पता चला। वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, Cdkn1b अभिव्यक्ति की मात्रात्मक विश्लेषण संवेदी epithelia और neuronal भेदभाव के दौरान Cdkn1b upregulate कि कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि की पुष्टि की। Cdkn1b व्यक्त कोशिकाओं की वृद्धि की संख्या इन प्रोटोकॉल में iMOP कोशिकाओं के भेदभाव पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

1 ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "jove_content आकृति 1
BFGF की उपस्थिति में सुसंस्कृत IMOP संस्कृतियों के proliferative स्थिति का निर्धारण करने के लिए edu निगमन एक परख के रूप में चित्रा 1। IMOP व्युत्पन्न otospheres। कोशिकाओं के नाभिक (ए) Hoechst और (बी) edu Alexafluor 488 (सी) Hoechst और edu प्रतिदीप्ति का विलय छवि के साथ लेबल रहे थे। Otospheres bFGF कमी मीडिया में 3 दिन सुसंस्कृत। संस्कृतियों से प्रकोष्ठों Hoechst और edu लेबलिंग (डी) Hoechst और (ई) edu Alexafluor 488 (एफ) मर्ज किए गए चित्र के साथ लेबल रहे थे। 1X पीबीएस 0.1% बीच 20. कोशिकाओं से युक्त साथ otospheres और कपड़े धोने के बवाल के बाद Hoechst (मैजेंटा) और edu (हरा) लेबल की कोशिकाओं के विलय प्रतिदीप्ति छवियों bFGF की उपस्थिति या bFGF (एच) अनुपस्थिति में (G) सुसंस्कृत otospheres से थे। बड़े पैमाने की लंबाईedu का संकेत दिया। (मैं) प्रतिशत bFGF की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत iMOP कोशिकाओं से कोशिकाओं लेबल जब तक सलाखों के 10 माइक्रोन हैं। बार ग्राफ और त्रुटि सलाखों के भीतर चिह्नित किया गया था विश्लेषण किया व्यक्ति की कोशिकाओं की संख्या मतलब (SEM) के मानक त्रुटि के रूप में चित्रित किया गया था। सेल मायने रखता एन = 5 स्वतंत्र प्रयोगों से थे। छात्र के टी-परीक्षण सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
संवेदी epithelia भेदभाव की चित्रा 2. जनरल योजनाबद्ध। संवेदी epithelia में iMOP फर्क कोशिकाओं के लिए (ए) समय। लाइन ग्राफ सेल हदबंदी और मीडिया में परिवर्तन के समय को दर्शाता है। (बी) विशिष्ट चरण विपरीतअनिर्देशित संवेदी epithelia भेदभाव के दौरान दिवस 0 पर otospheres की छवियों, (ग) 3 (डी) 7 और (ई) 10। पैमाने पर पट्टी की लंबाई 100 मीटर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
IMOP संस्कृति मीडिया में सुसंस्कृत iMOP कोशिकाओं के IMOP व्युत्पन्न संवेदी epithelia। Otosphere में सेल चक्र गिरफ्तारी और भेदभाव के सांकेतिक मार्करों की चित्रा 3. अभिव्यक्ति। कोशिकाओं के नाभिक (ए) Hoechst और (बी) Cdkn1b एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे। Filamentous actin (सी) phalloidin के साथ चिह्नित किया गया। (डी) proliferating iMOP कोशिकाओं से युक्त एक ठेठ otospheres का मर्ज किए गए छवि। IMOP कोशिकाओं से Otospheres संवेदी epith में सुसंस्कृत थे10 दिनों के लिए एलिया संस्कृति मीडिया। Otopsheres से कोशिकाओं (ई) Hoechst, (एफ) Cdkn1b और (छ) phalloidin के साथ चिह्नित किया गया। Otospheres (एच) मर्ज किए गए छवि Cdkn1b और phalloidin लेबलिंग वृद्धि हुई दिखा रहा है। Proliferating otospheres (आई) Hoechst, (जे) Cdh1, (कश्मीर) phalloidin साथ लेबल रहे थे। (एल) मर्ज किए गए छवि इन मार्करों से कमजोर प्रतिदीप्ति पता चलता है। संवेदी epithelia में भेदभाव Otospheres भी (एम) Hoechst, (एन) Cdh1, (ओ) phalloidin साथ लेबल रहे थे। (पी) मर्ज किए गए छवि ठेठ मजबूत Cdh1 और phalloidin लेबलिंग से पता चलता है। स्केल सलाखों की लंबाई जबतक 10 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Neuronal भेदभाव की चित्रा 4. जनरल योजनाबद्ध। न्यूरॉन्स में iMOP फर्क कोशिकाओं के लिए (ए) समय। (बी) के दिन 1, (ग) 3 (डी) 5 और (ई) 7. Arrowheads neurites को इंगित पर neuronal भेदभाव के दौर से गुजर iMOP कोशिकाओं के चरण विपरीत छवियाँ। (एफ) Hoechst और (छ) Cdkn1b के साथ लेबल iMOP संस्कृति मीडिया में otospheres के रूप में सुसंस्कृत iMOP कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों। (एच) Hoechst और Cdkn1b साथ लेबल की कोशिकाओं के मर्ज किए गए छवि। न्यूरोनल भेदभाव मीडिया में संस्कृति के 7 दिनों के बाद iMOP कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों। कोशिकाओं के नाभिक (आई) Hoechst और (जे) Cdkn1b साथ लेबल रहे थे। Hoechst और Cdkn1b साथ लेबल की कोशिकाओं के (कश्मीर) मर्ज किए गए छवि। जब तक नोट पैमाने सलाखों की लंबाई 10 मीटर है। ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,692 / 53692fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा सेल चक्र से बाहर निकलें और neuronal भेदभाव की आणविक मार्कर सांकेतिक 5. अभिव्यक्ति। 7 दिन neuronal भेदभाव के बाद iMOP कोशिकाओं। नाभिक सेलुलर आकृति विज्ञान और (सी) Cdkn1b एंटीबॉडी को उजागर करने के लिए (ए) Hoechst, (बी) Tubb3 (न्यूरोनल β ट्यूबिलिन) एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे। (डी) व्यक्ति की कोशिकाओं में Cdkn1b और Tubb3 की लेबलिंग के साथ विलय छवि। पैमाने पर पट्टी की लंबाई 20 मीटर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Cdkn1b अभिव्यक्ति की चित्रा 6 Cdkn1b के एकल कक्ष मात्रात्मक प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण। (ए) सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता व्यक्ति की कोशिकाओं से Cdkn1b और Hoechst प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया था। सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता एक हिस्टोग्राम के रूप में सेल नंबर के सापेक्ष साजिश रची गई थी। संवेदी epithelia (एसई) (लाल) में भेदभाव bFGF (काला) और iMOP otospheres की उपस्थिति में सुसंस्कृत iMOP कोशिकाओं proliferating से Cdkn1b की सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाए जाते हैं। एक सीमा proliferating (काला) और संवेदी epithelia विभेदित संस्कृतियों (लाल) से, 0.65 सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों (नोक) (बी) दहलीज मूल्य से ऊपर Cdkn1b व्यक्त iMOP कोशिकाओं का प्रतिशत तय किया गया था। (सी) Hoechst और Myo6 एंटीबॉडी के साथ लेबल संवेदी epithelia विभेदित iMOP कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवि विलय कर दिया। (डी (ई) (काला) proliferating और neuronal फर्क संस्कृतियों (लाल) से Cdkn1b व्यक्त iMOP कोशिकाओं का प्रतिशत। विश्लेषण के लिए इस्तेमाल व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक बार ग्राफ में चिह्नित किए गए थे। परिणाम विभिन्न प्रयोगों से संकलित किया गया (एन = 3) और त्रुटि सलाखों SEM के रूप में दर्शाया गया है। छात्र टी परीक्षण सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (एफ) द्विध्रुवी या Hoechst और Tubb3 के साथ लेबल छद्म एकध्रुवीय iMOP व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की फ्लोरोसेंट छवि विलय कर दिया। स्केल सलाखों की लंबाई 20 मीटर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल संस्कृति पोत रrface क्षेत्र (2 सेमी) कोशिकाओं की संख्या नियमित रखरखाव के लिए वरीयता प्राप्त संवेदी epithelia भेदभाव के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं की संख्या neuronal भेदभाव के लिए वरीयता प्राप्त 60 मिमी डिश के लिए स्केलिंग कारक सापेक्ष प्रयुक्त मीडिया की मात्रा (एमएल)
Multwell प्लेट्स
96 0.3 10,000 20,000 10,000-50,000 0.015 0.1
24 2 90,000 180000 100,000-150,000 0.100 0.5
12 4 180000 360000 300,000 0.200 1
6 10 500,000 1000000 500,000-750,000 0.500 2
बर्तन
35 मिमी 10 500,000 1000000 500,000 0.500 2
60 मिमी 20 1000000 2,000,000 1,000,000-1,500,000 1.000 3
100 मिमी 60 2,500,000 5,000,000 2,500,000- 3000000 3.000 8

वार में IMOP कोशिकाओं के भेदभाव का रख-रखाव के लिए तालिका 1. सेल नंबरशुभ टिशू कल्चर प्लेट प्रारूप।

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Discussion

IMOP संस्कृतियों निगरानी

एक उपन्यास iMOP सेल लाइन के भेदभाव आत्म नवीकरण को बनाए रखने और बढ़ावा देने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णन किया गया है और अतिरिक्त चढ़ाना प्रारूपों (1 टेबल) शामिल किए गए हैं। दिनचर्या विस्तार और iMOP कोशिकाओं की भिन्नता के साथ मदद कि कई महत्वपूर्ण कदम का उल्लेख किया जाता है। स्टेम सेल संस्कृतियों के लिए भी इसी तरह, iMOP कोशिकाओं सैद्धांतिक रूप से अनिश्चितकालीन जीवन-काल है। सेल लाइनों को ठीक से रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, iMOP संस्कृतियों नियमित तौर पर सेल व्यवहार्यता, आत्म नवीकरण और भेदभाव की क्षमता के लिए निगरानी कर रहे हैं। हदबंदी के बाद सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, हम trypan नीले रंग धुंधला रोजगार। सामान्य में, कोशिकाओं के 70% हदबंदी के बाद व्यवहार्य हैं। किया जाता है सी Myc और Sox2 एंटीबॉडी के साथ immunostaining, iMOP कोशिकाओं में आत्म नवीकरण पर नजर रखने के लिए। Proliferative संस्कृति शर्तों के तहत, iMOP कोशिकाओं 18 घंटा ~ का दोहरीकरण समय है। क्या करना है या आत्म नवीकरण मार्कर की अभिव्यक्ति में परिवर्तनसमय ubling बदल आत्म नवीकरण के संभावित संकेतक हैं। IMOP कोशिकाओं, संवेदी उपकला या न्यूरॉन्स के लिए प्रारंभिक चरण मार्कर की कोशिका चक्र से बाहर निकलें और अभिव्यक्ति की भेदभाव की क्षमता की निगरानी करने के लिए कोशिकाओं की भेदभाव की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। IMOP कोशिकाओं ऊपर वर्णित criterions में से किसी एक के पास नहीं है, तो यह संस्कृतियों को समाप्त करने के लिए उचित होगा।

IMOP संस्कृतियों को प्रभावित चर कि

IMOP संवर्धन कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण कदम आत्म नवीकरण को बढ़ावा देने के संस्कृतियों में bFGF के एक सक्रिय एकाग्रता बनाए रखना है। कोशिकाओं 29,30 संवर्धन जब bFGF के कथित 37 डिग्री सेल्सियस पर अत्यधिक अस्थिर है। संस्कृतियों के विकास काफी होने के कारण bFGF अस्थिरता के लिए सहज भेदभाव से प्रभावित हो सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, ताजा मीडिया लगातार 5 एनजी / एमएल ऊपर bFGF के स्तर को बनाए रखने के क्रम में संस्कृतियों के लिए आपूर्ति की है। BFGF के स्तर के स्थिरीकरण से रिहाई नियंत्रित का उपयोगglycolic और लैक्टिक एसिड पॉलिएस्टर microspheres मीडिया 31 में bFGF के स्तर को स्थिर बनाए रखने के लिए मीडिया की जरूरत परिवर्तन की आवृत्ति कम कर सकता है। तेजी से छोड़ देने bFGF के अलावा अक्सर iMOP संस्कृतियों में bFGF के स्तर को बनाए रखने के लिए मीडिया को जोड़ने की जरूरत कम हो जाएगा।

IMOP कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने में एक और महत्वपूर्ण कदम हदबंदी अभिकर्मकों और यांत्रिक बाल काटना करने के लिए निवेश की सीमा है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हदबंदी 1 मिमी EDTA के साथ ऊष्मायन के द्वारा पूरा किया है। जोरदार pipetting के कारण अत्यधिक यांत्रिक बाल काटना कम करने और सेल व्यवहार्यता बढ़ाने में मदद मिलेगी iMOP कोशिकाओं passaging जब कई centrifugation कदम को सीमित करने, EDTA के साथ अत्यधिक ऊष्मायन समय रोकने। इन चरणों को तवज्जो दी जाती प्रभावी रूप से संस्कृतियों के विस्तार के दौरान कोशिकाओं की बड़ी संख्या की व्यवहार्यता बनाए रख सकते हैं।

IMOP कोशिकाओं की दिनचर्या संस्कृति के दौरान, कोशिकाओं बवाल के लिए कई तरीकों का परीक्षण किया गया। Mechanpipetting से राजनैतिक बाल काटना otospheres अलग कर देना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन समान रूप से या लगातार एकल कक्षों का उत्पादन नहीं करता। IMOP कोशिकाओं के सेलुलर हदबंदी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के उपयोग को प्रभावी ढंग otospheres से एकल कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं, लेकिन इन अभिकर्मकों otospheres में सुधार के लिए और इलाज सतहों का पालन करने के लिए कोशिकाओं के चिपकने वाला गुण प्रभावित करते हैं। वाणिज्यिक अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए, कई washes के भेदभाव प्रोटोकॉल को रोजगार से पहले हदबंदी अभिकर्मकों को दूर करने के लिए आवश्यक थे।

वर्तमान भेदभाव प्रोटोकॉल में, दोनों संवेदी epithelia और neuronal भेदभाव की स्थिति एकल कक्षों या मृत कोशिकाओं के गुच्छों के रूप में देखा गया है कि कोशिका मृत्यु में हुई। Apoptotic कोशिका मृत्यु विट्रो में लंबे समय तक संस्कृति के दौरान उचित भेदभाव या अस्तित्व संकेतों की कमी के कारण हो सकता है। B27 पूरक निहित दोनों भेदभाव की स्थिति कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए। B27 supplem यद्यपिईएनटी प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स 32 के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, यह iMOP कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। इस तरह बनाए रखने और नियमित संस्कृति के दौरान और इन विट्रो भेदभाव में iMOP कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं रॉक अवरोध करनेवाला के रूप में यौगिकों के अलावा। रॉक अवरोध करनेवाला बड़े पैमाने पर भेदभाव 33 को प्रभावित किए बिना सीरम मुक्त संस्कृति में कोशिकाओं के अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए स्टेम सेल संस्कृतियों में इस्तेमाल किया गया है। संस्कृति मीडिया के लिए रॉक अवरोध करनेवाला के अलावा iMOP कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता को प्रभावित किए बिना लंबे समय भेदभाव प्रोटोकॉल के दौरान सेल अस्तित्व को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। बढ़ सेल अस्तित्व कुशलता से परिपक्व बालों की कोशिकाओं या SGNs की बड़ी संख्या को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास की अनुमति देगा।

IMOP भेदभाव का एक प्रारंभिक मार्कर के रूप में वृद्धि Cdkn1b अभिव्यक्ति

जल्दी कर्णावत विकास के दौरान, सेल के प्रारंभिक घटनाचक्र से बाहर निकलने के बालों की कोशिकाओं, समर्थन कोशिकाओं और SGNs 34 के लिए भेदभाव पछाड़ दिया है। न्यूरोनल progenitors के टर्मिनल बँटवारा एक लहर आधार से शुरू और कोक्लीअ 35 की सर्वोच्च दिशा में प्रगति में फैलता है। एक विरोध ढाल में, बालों की कोशिकाओं और समर्थन कोशिकाओं को जन्म दे कि prosensory progenitors के टर्मिनल बँटवारा कोक्लीअ 34,36 के आधार पर शीर्ष से प्रगति। Cdkn1b के अस्थायी अभिव्यक्ति बाद mitotic राज्य के लिए अच्छी तरह से संबद्ध है, यद्यपि यह विकासशील कोक्लीअ में सेल चक्र से बाहर निकलें को बढ़ावा देता है कि एकमात्र कारक सबसे अधिक संभावना नहीं है। इस के समर्थन में, Cdkn1b उत्परिवर्ती पशुओं अभी भी बाद mitotic बालों की कोशिकाओं 37 विकसित कर सकते हैं। इसके बजाय, Cdkn1b भेदभाव की शुरुआत चिह्नित करने के लिए एक प्रारंभिक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अनिर्देशित iMOP भेदभाव संस्कृतियों में, भेदभाव के लिए एक प्रारंभिक मार्कर स्पष्ट रूपात्मक सुविधाओं मनाया जा सकता है इससे पहले कि भेदभाव की प्रारंभिक अवस्था को बढ़ावा देने के लिए प्रोटोकॉल के विकास में मदद करेंगे। </ P>

कान का विकास करने के लिए इसी प्रकार, चक्र से बाहर निकलने के iMOP कोशिकाओं में वृद्धि हुई Cdkn1b स्तर में भेदभाव और परिणाम आरंभ करता है। IMOP कोशिकाओं proliferating में, Cdkn1b का ही निम्न स्तर अभिव्यक्ति मनाया जा सकता है। ऐसे Cdkn1a (P21 सीआईपी) के रूप में अन्य cyclin निर्भर काइनेज अवरोधकों iMOP कोशिकाओं में सामान्य कोशिका चक्र प्रगति के लिए जिम्मेदार हो सकता है। संवेदी epithelia और iMOP कोशिकाओं के neuronal भेदभाव के दौरान, एकल कोशिका मात्रात्मक विश्लेषण iMOP संस्कृतियों (चित्रा 6A, सी) फर्क में Cdkn1b की वृद्धि अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के एक सबसेट का पता चला। इन कोशिकाओं में Cdkn1b की अभिव्यक्ति टर्मिनल भेदभाव के दौर से गुजर iMOP कोशिकाओं का एक संकेत कर रहे हैं।

सेल भाग्य निर्धारण अध्ययन के लिए एक सेलुलर प्लेटफार्म के रूप में IMOP प्रकोष्ठों

IMOP कोशिकाओं इन विट्रो में विभिन्न कान का प्रजातियों के लिए एक पूर्वज राज्य से संक्रमण कर सकते हैं, इसलिए वे कान का सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकतादृढ़ संकल्प। वर्तमान में, वर्णित प्रोटोकॉल अलग कान प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के अनिर्देशित भेदभाव प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया। iMOP सिस्टम बायोएक्टिव अणुओं, यौगिकों और परिभाषित जीन परिपक्व बाल सेल की ओर iMOP कोशिकाओं है कि गाइड, समर्थन सेल और एसजीएन प्रजातियों के अलावा के लिए अनुमति देता है। IMOP सेलुलर मंच से एक प्रयोग के भेदभाव को बढ़ावा देने कि उम्मीदवार प्रतिलेखन कारक (टीएफ) के लिए परीक्षण करने के लिए है। कुंजी टीएफ की अभिव्यक्ति बाल सेल या neuronal भेदभाव ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्थापित मार्करों या बालों की कोशिकाओं और SGNs की रूपात्मक सुविधाओं के साथ साथ Cdkn1b की अभिव्यक्ति अलग कान का प्रजातियों 38,39 के लिए उम्मीदवार TFS के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

ऐसे Atoh1 के रूप में उम्मीदवार TFS बाल सेल के विकास के लिए आवश्यक हैं और क्षतिग्रस्त कोक्लीअ 40,41 में बाल सेल भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए repurposed कर दिया गया है। IMOP कोशिकाओं में Atoh1 का परिचय बाल सेल भेदभाव को बढ़ावा देने में मदद कर सकता है। उद्योगों के विकास मेंकोक्लीअ एनजी, Ngn1 और NeuroD1 दोनों विवो 42-44 में उचित एसजीएन भेदभाव के लिए आवश्यक हैं। IMOP कोशिकाओं में Ngn1 या NeuroD1 की अभिव्यक्ति एसजीएन भेदभाव को बढ़ावा देने सकता है। इन प्रयोगों TFS व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में की अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स 45-48 में fibroblasts या स्टेम कोशिकाओं में बदल सकते हैं जहां पैदा प्रेरित neuronal कोशिकाओं (में), के समान हैं। सामान्य रूप से बालों की कोशिकाओं या SGNs के विकास के दौरान व्यक्त कर रहे हैं कि TFS का परिचय बाल सेल या एसजीएन वंश की ओर iMOP कोशिकाओं मार्गदर्शन के लिए एक अच्छी रणनीति है।

IMOP व्युत्पन्न बालों की कोशिकाओं और SGNs की एक बड़ी संख्या के भेदभाव को बढ़ावा देने की स्थिति है कि जल्दी से पूरा किया जा सकता है और लागत प्रभावी ढंग से कृन्तकों में श्रम आधारित परीक्षण शुरू कर रहे हैं कि इससे पहले कि रोग मॉडलिंग, छोटे अणु स्क्रीनिंग और विष विज्ञान परीक्षण के लिए एक मजबूत सेलुलर मंच प्रदान करेगा । वर्णित प्रोटोकॉल एस के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक साधारण और बहुमुखी प्रणाली प्रस्तुतकान का पूर्वज भेदभाव tudying और बड़े पैमाने पर प्रयोग करने के लिए उत्तरदायी है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers BioCision BCS-405
Cryogenic Vials (2 ml)  Corning 430654
1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) Electron Microscopy Sciences 72230-01
DMEM/F12 Life Technologies 11320-082
Neurobasal Medium Life Technologies 21103
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 Life Technologies 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025-092
B27 Supplement (50X) Serum Free Life Technologies 17504-044 Stored as 1 ml aliquots
L-Glutamine(200 mM)  Life Technologies 25030-081 Stored as 5 ml aliquots
Natural Mouse Laminin Life Technologies 23017-015 Stored as 1 mg/ml aliquots
Click-iT EdU Alexa Fluor 488  Life Technologies C10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation Media Life Technologies A12542-01
Prolong Gold Antifade Mountant Life Technologies 47743-736 Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Moxi Z Mini Automated Cell Counter Orflo  MXZ001
Moxi Z Cassette Type S Orflo  MXC002
Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) Peprotech 450-33 Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots
Poly-D-Lysine Sigma P7886 Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher Scientific BP2648-1 Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots
5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811D
10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130188
Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130184 
Tissue Culture Treated 6 cm Dish Thermo Fisher Scientific 130181 
EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm Thermo Fisher Scientific SLGV033RS
TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip USA Scientific 1120-3810
TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip USA Scientific 1120-1810
TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl  filter tip USA Scientific 1120-8810
TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip USA Scientific 1126-7810
15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1475-0511
50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1500-1211

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 107 भीतरी कान iMOP अमर multipotent कान का पूर्वज भेदभाव बाल सेल सर्पिल ganglia न्यूरॉन्स समर्थन सेल सेल भाग्य
अमर multipotent Otic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में भेदभाव की शुरुआत
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Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A.… More

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).

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