Protocol
1. Die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung in IMOP Cells
- Bereiten iMOP Kulturmedien: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin und 20 ng / ml bFGF. Machen Sie 50 ml iMOP Kulturmedien unter Verwendung von sterilen Reagenzien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad.
- Auftau 50X B27 Supplement und filtersterilisiert 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min in einem 37 ° C Wasserbad. Auftauen 100 ug / ml bFGF Aliquot bei RT. 1 ml 50X B27, 10 ul 100 ug / ml bFGF und 12,5 & mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12.
- Verwenden Sie 3 ml Medium in einem 60 mm-Gewebekulturschale zur Züchtung iMOP Zellen. In frischem Medium, um Kulturen jeden zweiten Tag durch eine Verdoppelung des Volumens der Medien. Sicherzustellen, dass die Konzentration von bFGF nicht unter 5 ng / ml abfiel.
- Kultur iMOP Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 Passage-Zellen nach 5-7 Tagen in Kultur, wie in den unten aufgeführten Schritte. Übertragungs Kultur in einen 15ml konischen Verwendung einer 10 ml Pipettenspitze.
- Stellen 1 mM EDTA in HBSS durch Verdünnen von 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS. Pre-warmen 1 mM EDTA in HBSS in einem 37 ° C Wasserbad gestellt.
- Ernten der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. bei RT. Für Schwerkraftsedimentation, legen Sie die 15-ml-Erlen mit den Kulturen in der 37 ° C Inkubator für 5 bis 10 min. Nach dieser Zeit wird, beobachten die otospheres sammeln sich am Boden des konischen 15 ml.
HINWEIS: Übermäßiger Zentrifugalkraft können Zellschäden verursachen. - Saugen Sie vorsichtig den verbrauchten Medien mit einer 2 ml Ansaugpipette ohne das Zellpellet zu stören. 0,5 ml vorgewärmtes, 1 mM EDTA HBSS Lösung Pellet Zelle. Mit Hilfe eines P1000 Pipette vorsichtig pipettieren nach oben und unten 2 - 3-mal. Zeigen konischen bei 37 ° C und Inkubation für <5 min zur Dissoziation in Einzelzellen zu erleichtern.
- Vorsichtig schwenken die Zell-Lösung zu bestimmen, ob otospheres dissoziiert sind. Wenn keine otoSphären zu sedimentieren zu dem Boden des konischen werden die Zellen dissoziiert. Die Inkubationszeit kann variieren.
HINWEIS: Längerer Inkubation mit EDTA in übermäßigen Zelltod führen. - Entfernen Zellen von 37 ° C, 2 ml Medium zu neutralisieren und zu verdünnen das EDTA. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Saugen Sie verdünnten EDTA unter Verwendung einer 2 ml Ansaugpipette und 5 ml 1X PBS, um die Zellen zu waschen.
- Spin Zellen nach unten bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und saugen aus 1X PBS mit einem 2 ml Ansaugpipette. Resuspendieren der Zellen unter Verwendung eines P1000 Pipetten in 0,5 ml iMOP Kulturmedium durch sanftes Auf- und Abpipettieren 2-3 mal.
- Graf Zellen unter Verwendung eines mikrofluidischen Partikelzähler mit den entsprechenden Kassetten 28. Ein konfluenten Platte iMOP Zellen ~ 6 X10 enthalten 6 Zellen. Zellen verdünnt 1: 100 in Medium und füge 75 ul der Zell-Lösung in die Kassette für die Zählung. Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale in iMOP culture Medien (~ 1: 10 Verdünnung). Passage iMOPs alle 5 - 7 Tage die.
Hinweis: Zellen, die große otospheres bilden oder sich an der Unterseite der Gewebekulturschale wird unterscheiden. Die Zellen werden auch sterben, wenn die Kulturen über konfluent.
2. Einfrieren und Auftauen IMOP Cells
- Vorbereitung synthetischen Einfriermedium durch Auftauen und Äquilibrieren der Lösung auf 4 ° C vor dem Gefrierzellen.
- Sammeln Sie Zellen aus einer konfluenten 6 cm Schüssel iMOP Zellen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette und Übertragungszellen (~ 6 - 8 x 10 6 Zellen) in einen 15-ml-Erlen.
- Ernten der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Wenn die otospheres sind klein, werden Zellen, die nicht durch die Schwerkraft Sedimentation absetzen. Optional: Zählen von Zellen mit Schritt 1,9 bis Gesamtzellzahl zu bestimmen.
- Saugen Sie verbrauchte Medium mit einem 2 ml Ansaugpipette während die losen Zellpellet hinter.
- In 0,25 ml synthetischen Einfrieren Medien ce resuspendierenlls in einer Dichte von ~ 5 × 10 5 bis 3 × 10 6 Zellen / ml. Gently Pipette Zellen mit einem P1000 Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in Kryoröhrchen mit einem P1000 Pipette mit 1 ml gefilterte Spitze.
- Legen Sie die Fläschchen in einem Alkohol frei Gefrierbehälter und setzen Sie den Gefrierbehälter bei -80 ° C, die Temperatur 1 ° C pro Minute zu verringern, bis die Temperatur erreicht 80 ° C.
- Für langfristige Lagerung von Zellen, übertragen die Vials in die Dampfphase aus einem Flüssigstickstofflagertank. Auftauen Zellen für die Kultur, ins Gleichgewicht Kryo-Fläschchen mit gefrorenen Zellen bei -80 ° C.
- Pre-warmen iMOP Kulturmedien in einem 37 ° C Wasserbad.
- Auftauen gefrorenen Fläschchen schnell von Wirbeln den Boden des Fläschchens in einem 37 ° C Wasserbad. 1 ml der vorgewärmten iMOP Kulturmedien, um aufgetauten Zellen, sobald die letzten Eiskristall verschwindet. Übertragungszellen in einem 15 ml konischen und fügen zusätzliche 4 ml iMOP Nährmedien
- Drehen Sie das 15 ml Conische für 5 min. bei 200 xg und saugen die verbrauchte Medien. Resuspendieren der Zellen in 2 ml iMOP Kulturmedien und Zellen in einer Platte 6 cm Schale. Kulturen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für die Expansion.
3. Differenzierung IMOP Cells in Sinnesepithelien
- Bereiten Sie 50 ml iMOP Sinnesepithelien Differenzierungsmedium: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin. Machen Sie 50 ml iMOP Sinnesepithelien Differenzierung Medien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad. Auftau 50X B27 Supplement und 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min. in einem 37 ° C Wasserbad. 1 ml 50X B27 und 12,5 & mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12.
- Zu ernten, zu distanzieren, resuspendieren und zählen Zellen Wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,9
- Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale an Tag -3 Verwendung iMOP Kulturmedien. Am Tag 0 Transfer Kulturen mit einer 10 ml Pipette in ein 15-ml-Erlen. Sammeln Sie die otoKugeln durch die Schwerkraft der Sedimentation, wie in Schritt 1.6 angegeben. Aspirat aus verbrauchten Medien unter Verwendung einer 2 ml Ansaugpipette und lassen die otospheres auf der Unterseite des konischen.
- Sanft fügen in 2 ml Sinnesepithelien Differenzierung Medien. Transfer otospheres zu einer 6 cm-Schale mit einer großen Bohrung 10 ml Pipette.
HINWEIS: Mechanische Scher vor rauen Pipettieren können Zellen aus den otospheres distanzieren. - 2 ml frischem sensorischen Epitheldifferenzierung Medien Kulturen jeden zweiten Tag. Falls erforderlich, können die Zellen durch Schwerkraftsedimentation und Medien ersetzt gesammelt werden.
- Sammeln otospheres am Tag 10 durch die Übertragung von einer 15-ml-Erlen und es den otospheres sedimentieren, wie in Schritt angegeben 1.6.Aspirate die verbrauchten Medien unter Verwendung einer 2 ml-Pipette und verlassen Ansaugen der otospheres ungestört.
- Fix otospheres durch Inkubation in 4% Formaldehyd in 1 × PBS für 15 min bei RT. Entfernen Formaldehydlösung, waschen otospheres mit Waschpuffer (1X PBS, das 0,1% Triton X-100) vor der Inkubation in Blockierungspuffer (1 × PBS, das 10% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100) für 1 Stunde.
- Ersetzen Puffer und Inkubation Proben in Blocking-Puffer mit verdünnter Antikörper. Inkubieren bei 4 ° C. Wasch Proben mit 1X PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 unterliegt die otosphere der Immunofärbung 27. Transfer otospheres in 1X PBS und Ort otospheres in die Montagetechnik auf einen Glasobjektträger mit einem P1000 Pipette. Setzen Sie ein Deckglas über die Probe und lassen Sie die Montage Medien bei 4 ° C zu trocknen.
- Erwerben Epifluoreszenz Bildern unter Verwendung eines Umkehrmikroskops Setup mit einem 16-Bit-CCD-Kamera und entweder 20X 0,75 Luft oder 40X 1,3 NA -Ölimmersionsobjektiv ausgestattet. Sammeln Fluoreszenz von verschiedenen Farbkanälen unter Verwendung der genannten (Anregung und Emission) Wellenlängen: blau (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), Grün (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rot (562 ± 20 nm / und 625 ± 20 nm) und Infrarot (628 ± 20 nm / und 692 ± 20nm).
4. Assaying EdU Incorporation
- Am Tag -3, Platte 1 x 10 6 iMOP Zellen in einer 6 cm Schale. Drei Tage später, am Tag 0, ernte, distanzieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen durch Wiederholen der Schritte von 1,4 bis 1,9.
- Platte 2,5 x 10 5 Zellen in iMOP Nährmedien und 5 x10 5 Zellen in Sinnesepithelien Differenzierungsmedium in verschiedenen Vertiefungen einer 6 Well-Platte.
- Bestimmen den Prozentsatz an Zellen in S-Phase durch EdU Einarbeitung am Tag 3 durch Verwendung eines EdU Inkorporationstest
- Hinzufügen EdU Lager direkt an die iMOP Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 1 uM EdU in dem Kulturmedium zu erhalten.
- Inkubieren EdU in iMOP Kulturen für 2 Stunden und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Harvest, distanzieren und sammeln Zellen wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,9. Hinzufügen in 4% Formaldehyd in 1 × PBS für 15 min. bei RT, um Zellen zu reparieren. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Entfernen Formaldehydlösung und properly entsorgen.
- Etikett Kerne von Zellen mit Hoechst und einge EdU mit grünem Fluoreszenzfarbstoff-Azid gemß dem Protokoll des Herstellers.
HINWEIS: Alle Waschungen werden mit 1X PBS, 3% BSA und 0,1% Tween 20. Wasche die Zellen mit 1 × PBS zweimal durchgeführt. - Berg-Zellen auf einem Objektträger mit Antifade-Reagenz und legen Sie eine 1,5 Abdeckglas über die Probe. Erwerben Fluoreszenzbilder der markierten Zellen mit Hilfe eines Epifluoreszenz-Mikroskopie.
5. Differenzierung IMOP abgeleiteten Neuronen
- Machen Sie 50 ml der neuronalen Differenzierung Medien: Neurobasal Medien, 1X B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin. Thaw Flasche 50X B27 und 200 mM L-Glutamin in 37 ° C Wasserbad für 5 min. 1ml 50X B27 und 0,5 ml 200 mM L-Glutamin 48,5 ml Neurobasal Medium.
- Coat Deckglas, indem 12 mm rund 1,5 Deckgläser in einer sterilen 10 cm Platte und fügen Sie 70% EtOH an der Platte, die sterilisiert und reinigen Sie die Deckgläser.
- Rühren Sie vorsichtig die Buchtrslips um sicherzustellen, dass sie in Ethanol abgedeckt sind. Lassen Sie die Platte für 10 Minuten bei RT. Mit steriler 1X PBS spülen Sie die Deckgläschen 3 mal zum Auswaschen der verbleibenden Ethanol. Spülen Sie das Deckglas einmal mit sterilem H 2 0 zu waschen restlichen 1X PBS.
- Saugen Sie das H 2 0 mit einem 2 ml Ansaugpipette und lassen Sie die Deckgläser trocken. Setzen Sie die Deckgläser mit UV-Licht in der Gewebekultur Haube für 15 min. Speicher Deckgläschen in einer sterilen Umgebung, wenn sie nicht sofort verwendet.
- Legen Sie eine 12 mm runde Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Schale. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Deckgläser liegen flach auf dem Boden des Bohrlochs.
- Tau-2 mg / ml Poly-D-Lysin-Stammlösung bei RT gelöst und auf eine 10 ug / ml Poly-D-Lysin-Konzentration in 1X PBS. Zugabe von 0,25 ml von 10 ug / ml Poly-D-Lysin an die Vertiefungen. Lassen Sie die Platte in der 37 ° C-Inkubator für 1 Stunde.
- 3-mal mit steriler 1X PBS Waschen Sie die Vertiefungen. Tau-10 mg / ml Laminin Stammlösung bei RT und 10 & mgr; g / m verdünntenl in 1 × PBS. Zugabe von 0,25 ml von 10 ug / ml Laminin Arbeitslösung in eine einzige Vertiefung einer 24-Well-Platte mit mehreren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C Inkubator. Saugen Sie die Laminin-Lösung unter Verwendung eines 2 ml Ansaugpipette.
- 3-mal mit 1X PBS waschen des Deckglases durch Zugabe von in 1 ml 1X PBS mit einer P1000-Pipette und Entfernen des 1X PBS durch Absaugen mit einer 2 ml Ansaugpipette. Lassen 1X PBS von den letzten Wasch im Brunnen, bis die Zellen sind bereit, überzogen werden. Einzuleiten neuronale Differenzierung durch Ernten, Dissoziieren und Zählen der Zellen in den Schritten 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale an Tag -3.
- Am Tag 0, ernte, distanzieren und zählen Zellen durch Wiederholen von 1,4 bis 1,9. Seed 1 x 10 5 bis 1,5 x 10 5 iMOP Zellen in 0,5 ml vorgewärmten neuronalen Differenzierung Medium pro Well in einer 24 Multi-Well-Schale. Saugen Sie und fügen vorgewärmten neuronalen Differenzierung Medien Kulturen jeden zweiten Tag.
- Fix iMOP abgeleiteten Neuronen in 4% Formaldehyd für 15 min. eint RT an Tag 7. Entfernen Formaldehydlösung, Waschen iMOP abgeleiteten Neuronen mit Waschpuffer (1 × PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100) vor der Inkubation in Blockierungspuffer (1 × PBS, das 10% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100) für 1 Stunde.
- Ersetzen Puffer und Inkubation Proben in Blocking-Puffer mit verdünnter Antikörper. Inkubieren bei 4 ° C. Wasch Proben mit 1X PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 unterworfen Zellen an Immun 27. Vor der Platzierung auf Montagemedien Waschen Sie die Deckgläser mit 1X PBS. Lassen Sie die Montage Medien bei 4 ° C vor dem Erwerb Epifluoreszenz Bilder wie in Schritt 3.8 aufgeführten trocknen.
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Representative Results
bFGF Widerrufs Verringert Proliferation in IMOP Cells
Um die proliferative Kapazität von iMOP Zellen zu verringern und zu initiieren Differenzierung iMOP Zellen wurde bFGF aus den Kulturen entnommen. Um zu bestätigen, dass die Wachstumsfaktorentzug verringert Proliferation wurde EdU Einarbeitung als Proliferationstest verwendet. Der Prozentsatz von Zellen, die aus EdU otospheres mit iMOP Kulturmedium (enthaltend bFGF) und otospheres in Sinnesepithelien Medien kultiviert kultiviert eingebaut (ohne bFGF) wurde verglichen. Otosphere Kulturen wurden mit dem Nukleotidanalogon EDU, geerntet und fixiert gepulst. Incorporated EdU Nukleotide wurden fluoreszenz mit AlexaFluor 488 Azid mit Klick-Chemie markiert. Zellen aus otospheres in Abwesenheit von bFGF gezüchtet zeigten verringerte Einarbeitung EdU relativ zu Zellen, die mit bFGF (1A-F) kultiviert. Da die Größe of die otosphere erhöht, war es immer schwierig, alle Zellen von der otosphere mit einem Epifluoreszenzmikroskop visualisieren. Zur Lösung dieses Problems wurden die Zellen dissoziiert und so montiert, dass sie sich eindeutig en Masse visualisiert werden. Auch nach der Dissoziation und Fixierung werden die Zellen wieder aggregiert. Um die Zellen in einem dissoziierten Zustand zu halten, wurden Waschmittel, die die Zellen von der Wieder aggregierenden verhindert getestet. Tween 20 war einer der Detergenzien, die Re-Aggregation der Zellen verhindert. Dissoziierten Zellen wurden mit 0,1% Tween 20 gewaschen und auf Objektträger montiert. EdU markierten Zellen wurden dann durch Epifluoreszenzmikroskopie (1G, H) visualisiert. Repräsentative Ergebnisse aus einzelnen Experimenten (n = 5) zeigte eine deutliche Abnahme des Anteils der EdU nach 3 Tagen nach bFGF Entnahme (p <0,005) markierten Zellen von 48% auf 19%. Diese Ergebnisse bestätigen einen dramatischen Rückgang des Anteils an S-Phasen-Zellen und proliferative Potenzial von Zellen nach iMOPbFGF Rückzug.
IMOP stamm Sinnesepithelien Express CDKN1B und zeigen morphologische Veränderungen
Eine Zeitachse der iMOP Sinnesepithelien Differenzierungsprotokoll dargestellt (Abbildung 2A). Otospheres von proliferativen Kulturen wurden in Einzelzellen dissoziiert und für 3 Tage im iMOP Kulturmedien zu erholen. Diese Methode hilft bereichern für proliferierende Zellen und wählt gegen post-mitotischen Zellen in diesen Kulturen ab. Nach 3 Tagen wurden die neu gebildeten otospheres in Sinnesepithelien Differenzierungsmedium ausgesät und man ließ sie für ungelenkte Differenzierung für 10 Tage zu unterziehen. Hellfeldbilder von typischen Kulturen mit otospheres zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Aussäen zeigten eine anfängliche Abnahme der Größe vor otospheres beginnen vergrößernden (2B-E).
27 zu markieren. Um festzustellen, ob die Expression von CDKN1B (p27 KIP) als Marker für die Differenzierung verwendet werden, wurden otospheres von proliferativen oder Sinnesepithelien differenziert iMOP Kulturen verglichen. Fluoreszenzmarker wurden visualisiert und durch Epifluoreszenzmikroskopie gefangen genommen. Repräsentative Bilder der otospheres von proliferativen Kulturen zeigten eine geringe Expression von CDKN1B außerhalb der Kerne mit fast keine Phalloidin-Färbung (3 AD). Otospheres in Sinnesepithelien Differenzierungsmedien kultiviert werden angezeigt mit dem Auftreten von Phalloidin Kennzeichnung in den Umfangsrändern der Zellen (3 EH) erhöhte Expression von Kern CDKN1B gleichzeitige. In proliferierenden iMOP otospheres, Cdh1 (E-cadherin) und Phalloidin schwach markiert (Figur 3 IL). In differenzierten iMOP otospheres ausgeprägte Phalloidin und Cdh1 Markierung vor der morphologischen Veränderungen in Aktinfilamente und Regionen der Zelladhäsion (Abbildung 3 MP), ähnlich zu früheren Ergebnissen 27. Während Sinnesepithelien Differenzierung, die morphologischen Veränderungen in Aktinfilamente parallel das Aussehen Cdh1 Expression in Haftstellen zwischen den Zellen. In diesem Protokoll, die Erhöhung der CDKN1B Ausdruck zusammen mit den Veränderungen in der Phalloidin und Cdh1 dienen als Frühindikatoren für Sinnesepithelien Differenzierung iMOP Zellen.
IMOP abgeleiteten Neuronen Express CDKN1B und Tubb3
Eine schematische Darstellung der neuronalen Differenzierung iMOP Protokoll angezeigt (4A). Ähnlich wie bei dem oben erwähnten Protokoll wurden iMOP Zellen dissoziiert und aldingt beachtet zur Erholung für 3 Tage in iMOP Kulturmedien. Otospheres wurden geerntet, in Einzelzellen dissoziiert und gesät auf Poly-D-Lysin und Laminin beschichtete Deckgläser. Die Zellen wurden für 7 Tage zu unterscheiden. Repräsentative Hellfeld-Bilder zu den Zeitpunkten angezeigt progressive morphologische Veränderungen, wie sie in iMOP abgeleiteten Neuronen (4B-E) unterschieden. Mit dem 7. Tag kann lange Neuriten zu sehen, der sich von Zellkörpern (4E Pfeilspitzen) werden. Um die Änderungen im Expressionsniveaus von CDKN1B während der neuronalen Differenzierung festzustellen, proliferierende Zellen und iMOP iMOP abgeleiteten Neuronen verglichen. Otospheres wurden mit Hoechst und CDKN1B Antikörpern markiert. iMOP Zellen aus proliferierenden otospheres hatte wenige Zellen mit niedrigen Kern CDKN1B Ausdruck (4 FH). Weiterhin zeigte iMOP abgeleiteten Neuronen eine Zunahme der Anzahl der Zellen mit Kern CDKN1B Ausdruck 7 Tage nach neuronaler Differenzierung (Abbildung 4IK). Um festzustellen, ob die CDKN1B Zellen wurden zur Annahme eines neuronalen Linie, wurde die Kennzeichnung von iMOP abgeleiteten Neuronen mit dem neuronalen Marker Tubb3 getan. Repräsentative Bilder der iMOP abgeleiteten Neuronen zeigten Co-Kennzeichnung CDKN1B und Tubb3 (Abbildung 5 AD). Vergrößerung und Quantifizierung von Neuriten aus diesen Zellen zeigten eine durchschnittliche 1,5 Neuriten mit jedem Tubb3 zugeordnet markierten Zelle (n = 60) (Figur 5 EG). In unserem neuronalen Differenzierung Protokoll Immunfärbung mit CDKN1B und Tubb3 kann als Indikator für die Differenzierung in bipolar oder unipolar Pseudo iMOP abgeleiteten Neuronen verwendet werden.
Nuclear CDKN1B Expressionsniveaus erhöhen nach Beginn der Differenzierung
Die morphologischen Veränderungen in otospheres zeigen qualitative Veränderungen in iMOP Zellen, wie sie die Differenzierung zu unterziehen. Quantitative Ergebnisse aus der immu Erreichungnofluorescence Bilder in frühen Differenzierungsereignisse, Kernfluoreszenzintensität CDKN1B von einzelnen proliferierenden iMOP Zellen (n = 239), und Zellen, die eine iMOP Sinnesepithelien Differenzierung bezeichnet (n = 246) wurden gemessen. Um CDKN1B Fluoreszenz-Signale von unabhängigen Versuchen zu normalisieren, wurde das Verhältnis der CDKN1B Hoechst Fluoreszenz einzelner Zellen bestimmt. Histogramme der normierten Fluoreszenzintensität CDKN1B vermehren iMOP Zellen (schwarz) und Sinnesepithelien Differen iMOP Zellen (rot) aufgetragen wurden (6A). Eine Erhöhung der Anzahl von Hoch CDKN1B exprimierenden Zellen wurde als eine Rechtsverschiebung des Histogramms für Sinnesepithelien Differenzierung (rot), bezogen auf das Histogramm für proliferierende Zellen iMOP (schwarz) beobachtet. Zur Bestimmung der Zunahme des Prozentsatzes von Zellen, die CDKN1B, einen Schwellenwert für normierte CDKN1B Fluoreszenzintensitätseinheiten (0,65) eingestellt wurde (Pfeilspitze) und der Anteil der Zellen abo habe die Schwelle bestimmt. Nach Sinnesepithelien Differenzierung angezeigt iMOP Zellen einen Anstieg von 25,3% auf 67,1% der Zellen, die CDKN1B (6B). Das gleiche quantitative Analyse wurde auf iMOP abgeleiteten Neuronen angewendet. Beim Vergleich proliferative iMOP Zellen (n = 525) und 7 Tag iMOP abgeleiteten Neuronen (n = 583) eine Rechtsverschiebung in der Histogramm mit iMOP abgeleiteten Neuronen verbunden wurde, bezogen auf das Histogramm für proliferierende Zellen iMOP (6C) beobachtet. Bestimmung des Prozentsatzes von Zellen über der Schwelle zeigte eine Zunahme CDKN1B exprimierenden Zellen von 23,5% auf 85,5% (Figur 6D). Verwendung der beschriebenen Protokolle quantitative Analyse CDKN1B Expression bestätigt eine Erhöhung der Anzahl der Zellen, während CDKN1B Sinnesepithelien und neuronalen Differenzierung hochregulieren. Die erhöhte Anzahl von CDKN1B exprimierenden Zellen verwendet werden, um die Differenzierung von Zellen in iMOP dieser Protokolle zu bestätigen.
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Abbildung 1 EdU Incorporation als ein Assay zur proliferativen Zustand der IMOP Kulturen zu bestimmen. IMOP abgeleiteten otospheres in Gegenwart von bFGF gezüchtet. Kerne der Zellen wurden mit (A) Hoechst und (B) EdU AlexaFluor 488. (C) Mischbild von Hoechst und EdU Fluoreszenz markiert. Otospheres kultiviert 3 Tage im Medium ohne bFGF. Zellen aus Kulturen wurden mit (D) Hoechst und (E) EdU AlexaFluor 488. (F) verbundenes Bild Hoechst und EdU Kennzeichnung markiert. Verschmolzen Fluoreszenzbilder von Hoechst (magenta) und EDU (grün) markierten Zellen nach Dissoziieren otospheres und Waschen mit 1 × PBS mit 0,1% Tween 20-Zellen wurden von otospheres kultiviert (G) in Anwesenheit von bFGF oder (H) die Abwesenheit von bFGF. Länge der SkalaBalken 10 um wenn nicht anders angegeben. (I) Prozentsatz EdU markierten Zellen aus iMOP Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von bFGF gezüchtet. Die Anzahl der einzelnen Zellen untersucht wurde, innerhalb der Balkenanzeige und Fehlerbalken bezeichnet wurden als Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Zellzählungen wurden von n = 5 unabhängigen Experimenten. Die T-Test wurde durchgeführt, um eine statistische Signifikanz zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Allgemeines Schema Sinnesepithelien Differenzierung. (A) Timeline zur Differenzierung iMOP Zellen in Sinnesepithelien. Das Liniendiagramm zeigt die Zeit der Zelle Dissoziation und Medienwechsel. (B) Typische PhasenkontrastBilder otospheres am Tag 0, (C) 3, (D) 7 und (E) 10 während ungelenkte Sinnesepithelien Differenzierung. Länge der Maßstabsleiste ist 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Expression von Markern Richt von Zellzyklusarrest und Differenzierung in IMOP stamm Sinnesepithelien. Otosphere der iMOP Zellen in iMOP Kulturmedien kultiviert. Kerne der Zellen wurden mit (A) Hoechst und (B) CDKN1B Antikörper markiert. Filamentöses Aktin wurde mit (C) Phalloidin markiert. (D) Das fusionierte Bild eines typischen otospheres enthält wuchernden iMOP Zellen. Otospheres von iMOP Zellen wurden in sensorischen Epith kultiviertElia Kulturmedium für 10 Tage. Zellen aus otopsheres wurden mit (E) Hoechst, (F) CDKN1B und (G) Phalloidin markiert. (H) zusammengefügte Bild von otospheres zeigt erhöhte CDKN1B und Phalloidin Kennzeichnung. Proliferierende otospheres wurden mit (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K) Phalloidin markiert. (L) Das fusionierte Bild zeigt schwache Fluoreszenz von diesen Markern. Otospheres in Sinnesepithelien differenziert wurden auch mit (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) Phalloidin markiert. (P) Die fusionierte Bild zeigt typische starke Cdh1 und Phalloidin Kennzeichnung. Länge der Maßstabsbalken sind 10 & mgr; wenn nicht anders angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. allgemeines Schema Neuronale Differenzierung. (A) Timeline zur Differenzierung iMOP Zellen zu Neuronen. Phasenkontrast-Aufnahmen iMOP Zellen, die neuronale Differenzierung bei (B) Tag 1, (C) 3, (D) 5 und (E) 7. Pfeilspitzen weisen auf Neuriten. Fluoreszenzbilder iMOP Zellen otospheres in iMOP mit (F) und Hoechst (G) CDKN1B markierten Kulturmedien kultiviert. (H) zusammengefügte Bild von Zellen mit Hoechst und CDKN1B beschriftet. Fluoreszenzbilder iMOP Zellen nach 7 Tagen Kultur in neuronalen Differenzierung Medien. Kerne von Zellen mit (I) und Hoechst (J) CDKN1B markiert. (K) zusammengefügte Bild von Zellen mit Hoechst und CDKN1B beschriftet. Länge der Maßstabsbalken sind 10 & mgr; wenn nicht anders vermerkt. om / files / ftp_upload / 53.692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Expression molekularer Marker Richt von Zellzyklus-Ausfahrt und Neuronale Differenzierung. IMOP Zellen 7 Tage nach neuronaler Differenzierung. Kerne wurden mit (A) Hoechst, (B) Tubb3 (neuronale β-Tubulin) Antikörpern markiert, zelluläre Morphologie und (C) CDKN1B Antikörper zu markieren. (D) zusammengefügte Bild mit Kennzeichnung CDKN1B und Tubb3 in einzelnen Zellen. Länge der Maßstabsleiste ist 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 6 Single Cell Quantitative Fluoreszenzintensitätsanalyse des CDKN1B. (A) normalisierte Fluoreszenzintensität CDKN1B Expression wurde durch Berechnung des Verhältnisses der CDKN1B und Hoechst Fluoreszenzintensität von einzelnen Zellen bestimmt. Die normierte Fluoreszenzintensität relativ zur Zellzahlen als Histogramm dargestellt. Normierten Fluoreszenzintensität CDKN1B vermehren iMOP Zellen in Anwesenheit von bFGF (schwarz) und iMOP otospheres in Sinnesepithelien (SE) (rot) differenzierte kultivierte gezeigt. Ein Schwellenwert wurde bei 0,65 normierten Fluoreszenzintensität Einheiten (Pfeilspitze) (B) Prozentsatz der Zellen, die CDKN1B iMOP über dem Schwellenwert von proliferierenden (schwarz) und Sinnesepithelien differenzierte Kulturen (rot) gesetzt. (C) Zusammengeführte Fluoreszenzbild Sinnesepithelien differenziert iMOP Zellen mit Hoechst und Myo6 Antikörpern markiert. (D (E) Prozentsatz der Zellen, die CDKN1B iMOP vermehren (schwarz) und neuronale Differenzierung Kulturen (rot). Einzelzellen für die Analyse verwendet wurden in jedem Balken bezeichnet. Ergebnisse von verschiedenen Experimenten zusammengestellt (n = 3) und Fehlerbalken nach SEM dargestellt. Der Student t-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu bestimmen. Fluoreszenzbild der bipolaren oder Pseudo-unipolar iMOP abgeleiteten Neuronen mit Hoechst und Tubb3 markiert (F) zusammengelegt. Länge der Maßstabsbalken sind 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zellkulturgefäß | Surface Fläche (cm 2) | Anzahl der Zellen für die Routinewartung Gesetzte | Anzahl der Zellen für Sinnesepithelien Differenzierung Gesetzte | Anzahl der Zellen für Neuronale Differenzierung Gesetzte | Skalierungsfaktor Bezogen auf 60 mm Dish | Volumen der verwendeten Medien (ml) | |
| Multiwell-Platten | |||||||
| 96 | 0,3 | 10.000 | 20.000 | 10.000-50.000 | 0,015 | 0.1 | |
| 24 | 2 | 90.000 | 180.000 | 100.000-150.000 | 0,100 | 0,5 | |
| 12 | 4 | 180.000 | 360.000 | 300,000 | 0,200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500,000-750,000 | 0,500 | 2 | |
| Geschirr | |||||||
| 35 mm | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500.000 | 0,500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1.000.000 | 2.000.000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2.500.000 | 5.000.000 | 2,500,000- 3.000.000 | 3.000 | 8 | |
Tabelle 1 Cell Zahlen für die Aufrechterhaltung der Differenzierung von IMOP Cells in Varschiedenen Gewebekulturplatte Formate.
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Discussion
Überwachung IMOP Kulturen
Ein Protokoll zum Aufrechterhalten der Selbsterneuerung und die Förderung der Differenzierung einer neuartigen iMOP Zellinie beschrieben und zusätzliche Plattierung Formate enthalten sind (Tabelle 1). Mehrere wichtige Schritte, die mit Routine Expansion und Differenzierung von Zellen iMOP helfen, werden zur Kenntnis genommen. Ähnlich wie pluripotente Stammzellkulturen, iMOP Zellen haben theoretisch eine unbegrenzte Lebensdauer. Um sicherzustellen, dass Zelllinien korrekt geführt werden iMOP Kulturen routinemäßig für die Lebensfähigkeit der Zellen, die Selbsterneuerung und Differenzierung des Potentials aufgezeichnet. Um nach der Dissoziation die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen, setzen wir Trypanblaufärbung. Im allgemeinen über 70% der Zellen lebensfähig nach der Dissoziation. Um die Selbsterneuerung in iMOP Zellen überwachen, Immunfärbung mit c-Myc und Sox2-Antikörpern durchgeführt wird. Unter proliferative Kulturbedingungen, iMOP Zellen eine Verdopplungszeit von ~ 18 Stunden. Veränderungen in der Expression von Selbsterneuerung Marker oder tunubling Zeit sind potenzielle Indikatoren für veränderte Selbsterneuerung. Um das Differenzierungspotential iMOP Zellen, Zellzyklus-Ausgang und die Expression von frühen Stadium Marker für sensorische Epithel oder Neuronen überwacht werden verwendet, um das Differenzierungspotential der Zellen beurteilen. Wenn iMOP Zellen nicht eine der oben beschriebenen Kriterien übergeben, wäre es ratsam, die Kulturen zu kündigen.
Variablen, die IMOP Kulturen beeinflussen
Ein kritischer Schritt bei der Kultivierung von Zellen iMOP ist, eine aktive Konzentration von bFGF in den Kulturen zu halten, um die Selbsterneuerung zu fördern. bFGF ist angeblich sehr labil bei 37 ° C, wenn die Kultivierung von Zellen 29,30. Das Wachstum der Kulturen deutlich durch spontane Differenzierung durch bFGF Instabilität beeinflusst werden können. Im aktuellen Protokolls frisches Medium wird ständig zu den Kulturen um bFGF Ebenen über 5 ng / ml aufrechtzuerhalten geliefert. Stabilisierung der bFGF Ebenen unter Verwendung von kontrollierter FreisetzungGlykol- und Milchsäure Polyester-Mikrokügelchen könnten die Häufigkeit der Medienwechsel erforderlich, um stabile Niveaus von bFGF in Medien 31 zu halten reduzieren. Neben der stetig lösbare bFGF wird die Notwendigkeit, die häufig Medien zu bFGF Ebenen in iMOP Kulturen zu erhalten zu reduzieren.
Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen iMOP ist die Exposition gegenüber Dissoziation Reagenzien und mechanische Scher begrenzen. Im aktuellen Protokoll wird Dissoziation durch Inkubation mit 1 mM EDTA durchgeführt. Die Eindämmung übermäßigen Inkubationszeit mit EDTA, reduzieren übermäßige mechanische Scherung durch kräftiges Pipettieren verursacht und die Begrenzung mehrerer Zentrifugationsschritte bei Passagieren iMOP Zellen werden dazu beitragen, die Lebensfähigkeit der Zellen. Aufmerksamkeit auf diesen Schritten angegeben kann Lebensfähigkeit große Anzahl von Zellen während der Expansion des Kulturen wirksam aufrechtzuerhalten.
Während der Routinekultur iMOP Zellen wurden mehrere Verfahren zum Dissoziieren der Zellen getestet. MechaniCal Scher vom Pipettieren kann verwendet werden, um otospheres distanzieren, aber nicht gleichmäßig oder gleichbleibend produzieren Einzelzellen. Verwendung von handelsüblichen Reagenzien zur Zell Dissoziation iMOP Zellen effektiv zu erzeugen einzelnen Zellen aus otospheres, aber diese Reagenzien beeinträchtigen die Hafteigenschaften der Zellen zu otospheres reformieren und die zu behandelnden Oberflächen zu haften. Um kommerzielle Reagenzien zu verwenden, wurden mehrere Wäschen erforderlich, um die Dissoziation Reagenzien vor dem Einsatz Differenzierungsprotokolle zu entfernen.
In der aktuellen Differenzierungsprotokolle führten beide Sinnesepithelien und neuronale Differenzierung Bedingungen in den Zelltod, die in Form von einzelnen Zellen oder Klumpen von toten Zellen beobachtet wurde. Apoptotischen Zelltod könnte aufgrund des Mangels an geeigneten Differenzierung oder Überleben Merkmale während der verlängerten Kultur in vitro. Beide enthalten B27 Ergänzung Differenzierungsbedingungen zu fördern das Überleben von Zellen. Obwohl B27 Nachtrent wurde gezeigt, dass das Überleben von primären hippocampalen Neuronen 32 zu fördern, kann es nicht ausreichend für die Förderung des Überlebens iMOP Zellen sein. Zugabe von Verbindungen, wie der ROCK-Inhibitor kann zur Aufrechterhaltung und das Überleben der Zellen während iMOP Routinekulturen und in vitro Differenzierung erhöhen. ROCK-Inhibitor wurde ausgiebig in pluripotenten Stammzellkulturen verwendet werden, um das Überleben von Zellen in einem serumfreien Kulturen ohne Beeinträchtigung Differenzierung 33 zu fördern. Die Zugabe von ROCK-Inhibitor zu den Kulturmedien können helfen, das Überleben der Zelle während der langen Differenzierungsprotokolle zu erhöhen, ohne die Differenzierungspotenzial iMOP Zellen. Erhöhte das Überleben der Zelle wird Entwicklung von Protokollen zu ermöglichen, eine große Zahl von reifen Haarzellen oder Sgns effizient zu erzeugen.
Erhöhte CDKN1B Expression als ein früher Marker der Differenzierung IMOP
Während der frühen Cochlea-Entwicklung, die Anfangsfall ZellZyklus Ausfahrt voraus Differenzierung für Haarzellen, Stützzellen und Sgns 34. Terminal Mitose von neuronalen Vorläuferzellen verbreitet in einer Welle, ausgehend von der Basis und der Spitze voran in Richtung der Schnecke 35. In einer gegenüberliegenden Steigung, Terminal Mitose prosensory Vorläuferzellen, die Anlass zu Haarzellen und Stützzellen fortschreitet von der Spitze zur Basis der Cochlea 34,36. Obwohl die zeitliche Expression CDKN1B korreliert gut mit dem post-mitotischen Zustand ist es sehr wahrscheinlich nicht der einzige Faktor, der Zellzyklus-Ausgang in der Entwicklungs Schnecke fördert. Um dies zu unterstützen, kann CDKN1B mutierten Tiere noch entwickeln postmitotischen Haarzellen 37. Stattdessen können CDKN1B als Frühindikator verwendet werden, um das Einsetzen der Differenzierung zu markieren. In ungelenkte iMOP Differenzierungskulturen, wird ein früher Marker für die Differenzierung bei der Entwicklung von Protokollen zur frühen Stadien der Differenzierung zu fördern, bevor offensichtlichen morphologischen Merkmale beobachtet werden zu unterstützen. </ p>
Ähnlich wie otic Entwicklung, startet die Zyklus Ausfahrt Differenzierung und zu einer erhöhten CDKN1B Ebenen in iMOP Zellen. In proliferierenden iMOP Zellen, können nur geringe Expression von CDKN1B beachten. Weitere Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren, wie CDKN1A (p21 CIP) kann für die normale Zellzyklusprogression in iMOP Zellen verantwortlich sein. Während Sinnesepithelien und neuronalen Differenzierung iMOP Zellen zeigten einzelne Zelle quantitative Analyse einer Untergruppe von Zellen mit verstärkte Expression CDKN1B in differen iMOP Kulturen (6A, C). Expression CDKN1B in diesen Zellen sind ein Hinweis iMOP Zellen, die eine terminale Differenzierung.
IMOP Cells als Cellular Plattform zur Untersuchung von Zell Fate Bestimmung
Seit iMOP Zellen können aus einem Vorläufer-Zustand in verschiedenen otic Abstammungslinien in vitro übergehen, werden sie genutzt werden, um otic Zellschicksal zu studierenBestimmung. Derzeit verwendet das beschriebene Protokoll ungelenkte Differenzierungsverfahren, verschiedene Ohrzelltypen zu erzeugen. Die iMOP System ermöglicht die Zugabe von bioaktiven Molekülen, Verbindungen und definierte Gene, die iMOP Zellen gegenüber der reifen Haarzelle zu leiten, unterstützt Zelle und SGN Abstammungslinien. Eine Verwendung von iMOP Mobilplattform ist es, für die Kandidatentranskriptionsfaktoren (TF), die Differenzierung zu fördern testen. Die Expression von Schlüssel TF kann verwendet werden, um Haarzelle oder neuronale Differenzierung zu treiben. Expression CDKN1B zusammen mit etablierten Marker oder morphologischen Eigenschaften von Haarzellen und SGNS kann verwendet werden, um den Beitrag von Kandidaten TFs zu deutlichen otic Linien 38,39 bestimmen.
Candidate TFs wie Atoh1 sind für Haarzellentwicklung und wurden umgewidmet, um Haarzelldifferenzierung in der beschädigten Hörschnecke 40,41 zu fördern. Einführung Atoh1 in iMOP Zellen können zur Förderung der Haarzelldifferenzierung. In der Entwicng Cochlea werden sowohl Ngn1 und NeuroD1 für die ordnungsgemäße SGN Differenzierung in vivo 42-44 erforderlich. Die Expression von Ngn1 oder NeuroD1 in iMOP Zellen können SGN Differenzierung zu fördern. Diese Experimente sind ähnlich Erzeugung induzierten neuronalen Zellen (IN), wobei die Expression der Transkriptionsfaktoren einzeln oder in Kombination können Fibroblasten oder pluripotente Stammzellen zu Nervenzellen 45-48 konvertieren. Einführung von TFs, die normalerweise während der Entwicklung der Haarzellen oder SGNS exprimiert werden, ist eine gute Strategie zur Führung iMOP Zellen in Richtung der Haarzelle oder SGN Linie.
Bedingungen, die die Differenzierung von einer großen Anzahl von iMOP stammHaarZellen und Sgns fördern eine robuste Mobilplattform für Krankheitsmodelle, kleines Molekül-Screening und toxikologischen Tests, die schnell erreicht werden kann und kostengünstig vor arbeitsintensive Tests an Nagetieren eingeleitet liefern . Die beschriebenen Protokoll stellt ein einfaches und vielseitiges System, das für s genutzt werden kanntudying otic Vorläufer Differenzierung und ist zugänglich für Großversuche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
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