Protocol
1. Maintenir autorenouvellement dans les cellules de IMOP
- Préparer IMOP milieux de culture: DMEM / F12, supplément 1X B27, 25 pg / ml carbénécilline et 20 ng / ml de bFGF. Faire 50 ml de IMOP milieux de culture en utilisant des réactifs stériles. Réchauffez 49 ml de DMEM / F12 dans un 50 ml conique dans un bain d'eau à 37 °.
- Thaw 50X B27 supplément et 100 mg / ml carbénécilline aliquotes stérilisées par filtration, pendant 5 min dans un bain d'eau à 37 ° C. Dégeler 100 pg / ml de bFGF aliquote à TA. Ajouter 1 ml 50X B27, 10 pl de 100 pg / ml de bFGF et 12,5 pi de 100 mg / ml carbénécilline dans DMEM / F12.
- Utilisez 3 ml de médias dans une boîte de culture de tissu de 60 mm pour la culture de cellules IMOP. Ajouter un milieu frais à des cultures tous les deux jours en doublant le volume des médias. Assurez-vous que la concentration de bFGF ne chute pas en dessous de 5 ng / ml.
- Cellules IMOP de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2. Les cellules Passage après 5 - 7 jours en culture comme indiqué dans les étapes ci-dessous. La culture de transfert à un 15ml conique aide d'une pipette de 10 ml.
- Ajouter 1 mM d'EDTA dans du HBSS en diluant 0,1 ml de pH 8,0 EDTA 0,5 M dans 50 ml de HBSS. Préchauffer EDTA 1 mM fait dans HBSS dans un bain d'eau à 37 C °.
- Récolte des cellules par sédimentation par gravité ou par centrifugation à 200 g pendant 5 min. à la température ambiante. Pour sédimentation par gravité, placez le conique de 15 ml contenant les cultures dans le 37 ° C incubateur pour 5 - 10 min. Après ce temps, observer les otospheres recueillir au bas de la 15 ml conique.
REMARQUE: la force centrifuge excessive peut causer des dommages aux cellules. - Soigneusement aspiration passé multimédia à l'aide de 2 ml d'aspiration pipette sans perturber le culot cellulaire. Ajouter 0,5 ml de solution 1 mM EDTA HBSS préchauffée à culot cellulaire. Avec une pipette P1000, pipeter doucement monter et descendre 2 - 3 fois. Placer conique à 37 ° C et incuber pendant <5 min pour faciliter la dissociation dans des cellules individuelles.
- Mélanger doucement la solution cellulaire pour déterminer si otospheres sont dissociés. Si aucun otosphères sédimentent au fond du cône, les cellules sont dissociées. Le temps d'incubation peut varier.
REMARQUE: prolongée incubation avec EDTA entraînera la mort cellulaire excessive. - Éliminer les cellules de 37 ° C, ajouter 2 ml de médias pour neutraliser et diluer le EDTA. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer dilué EDTA en utilisant une pipette de 2 ml aspiration et ajouter 5 ml de PBS 1X pour laver les cellules.
- Spin cellules vers le bas à 200 g pendant 5 min à température ambiante et aspirer à 1X PBS en utilisant une pipette de 2 ml d'aspiration. Reprendre les cellules à l'aide d'une pipette P1000 dans 0,5 ml de IMOP milieux de culture par pipetage doucement monter et descendre 2 - 3 fois.
- Compter les cellules en utilisant un compteur de particules microfluidique avec les cassettes appropriées 28. Une plaque de cellules confluentes IMOP contiendra ~ 6 X10 6 cellules. Diluer cellules 1: 100 dans les médias et ajouter 75 ul de solution de cellules dans la cassette pour le comptage. Plate 1 x 10 6 cellules dans une boîte de 6 cm dans IMOP culture médias (~ 1: 10 dilution). IMOPs Passage toutes les 5 - 7 jours.
REMARQUE: Les cellules qui forment de grandes otospheres ou joindre au fond de la boîte de culture de tissus permettra de différencier. Les cellules seront également meurent si les cultures sont plus confluentes.
2. congélation et la décongélation de cellules IMOP
- Préparer milieu de congélation et décongélation synthétique par la solution d'équilibrage à 4 ° C avant la congélation des cellules.
- Recueillir des cellules à partir d'un cm plat de cellules confluentes IMOP 6. Utiliser une pipette de 10 ml et les cellules de transfert (~ 6 - 8 x 10 6 cellules) dans un 15 ml conique.
- Récolte des cellules par sédimentation par gravité ou par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Si les otospheres sont petites, les cellules ne déposent par gravité sédimentation. Facultatif: Compter les cellules à l'aide de l'étape 1.9 pour déterminer le nombre total de cellules.
- Aspirer passé médias en utilisant une pipette 2 ml d'aspiration tout en laissant le culot cellulaire lâche derrière.
- Ajouter 0,25 ml de milieu de congélation synthétiques pour resuspendre CElls à une densité de 5 x 10 ~ 5 à 3 x 10 6 cellules / ml. Pipette en douceur les cellules avec une pipette P1000. Transférer la suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques aide d'une pipette P1000 avec 1 ml pointe filtrés.
- Placer les flacons dans un récipient de congélation sans alcool et placer le récipient de congélation à -80 ° C pour réduire la température de 1 ° C par minute jusqu'à ce que la température atteint -80 ° C.
- Pour le stockage à long terme de cellules, transférer les flacons à la phase vapeur d'un liquide réservoir de stockage d'azote. Pour dégeler les cellules de la culture, équilibrer flacon cryogénique contenant les cellules congelées à -80 ° C.
- Milieux de culture IMOP Pré-au chaud dans un bain-marie à 37 °.
- Décongeler rapidement le flacon congelé en le faisant tourner le fond du flacon dans un bain d'eau à 37 C °. Ajouter 1 ml de milieux de culture préchauffé IMOP à cellules décongelées une fois que le cristal de glace dernière disparaît. Cellules dans un ml conique 15 de transfert et d'en ajouter 4 ml de IMOP milieux de culture
- Faites tourner la 15 ml conique pendant 5 min. à 200 xg et aspirer les milieux épuisés. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de IMOP milieux de culture et les cellules de la plaque dans une boîte de 6 cm. Incuber les cultures à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour l'expansion.
3. différenciation des cellules IMOP dans sensorielle épithéliums
- Préparer 50 ml de IMOP médias de différenciation de l'épithélium sensoriel: DMEM / F12, supplément 1X B27, 25 pg / ml carbénécilline. Faire 50 ml de IMOP sensorielle médias de différenciation de l'épithélium. Réchauffez 49 ml de DMEM / F12 dans un 50 ml conique dans un bain d'eau à 37 °. Thaw 50X supplément de B27 et 100 mg / ml carbénécilline aliquotes pour 5 min. C dans un bain d'eau à 37 °. Ajouter 1 ml 50X B27 et 12,5 pi de 100 mg / ml carbénécilline dans DMEM / F12.
- Pour la récolte, dissocier, remettre en suspension et de compter les cellules Répétez les étapes 1.4 à 1.9
- Planche 1 x 10 6 cellules dans une boîte de 6 cm au Jour -3 utilisant IMOP milieux de culture. Le jour 0, les cultures de transfert en utilisant une pipette de 10 ml dans un 15 ml conique. Recueillir l'otosphères par sédimentation par gravité comme indiqué dans l'étape 1.6. Aspirer passé support à l'aide de 2 ml d'une pipette d'aspiration et de laisser les otospheres sur le fond de la forme conique.
- Ajouter délicatement dans 2 ml de sensorielle médias de différenciation de l'épithélium. Transfert otospheres à un plat de 6 cm en utilisant un grand alésage 10 ml pipette.
NOTE: cisaillement mécanique de pipetage dure peut dissocier les cellules des otospheres. - Ajouter 2 ml de milieu frais de différenciation de l'épithélium sensoriel aux cultures tous les autres jours. Si nécessaire, les cellules peuvent être recueillies par sédimentation par gravité et remplacé médias.
- Recueillir otospheres au jour 10 par le transfert à une conique 15 ml et en permettant aux otospheres dans les sédiments comme indiqué dans l'étape 1.6.Aspirate les médias passé à utiliser un 2 ml d'aspiration pipette et laissent les otospheres intact.
- Fixer otospheres par incubation à 4% de formaldehyde dans du PBS 1X pendant 15 minutes à température ambiante. Enlever la solution de formaldéhyde, laver otospheres avec un tampon de lavage (PBS 1X contenant 0,1% de Triton X-100) avant l'incubation dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 10% de sérum de chèvre normal et 0,1% de Triton X-100) pendant 1 heure.
- Remplacer tampon et incuber des échantillons dans un tampon bloquant avec l'anticorps dilué. Incuber à 4 ° C. Laver les échantillons avec 1X PBS contenant 0,1% de Triton X-100 sous réserve de la otosphere à immunocoloration 27. Otospheres de transfert dans PBS 1X et place otospheres dans les médias sur une lame de verre à l'aide d'une pipette P1000. Mettez une lamelle sur l'échantillon et permettent milieux de montage à sec à 4 ° C.
- Acquérir des images à épifluorescence en utilisant une configuration de microscope inversé équipé d'une caméra CCD de 16 bits et d'un air 20X 0,75 NA ou un objectif 40X 1,3 à immersion d'huile. Recueillir la fluorescence de différents canaux de couleur en utilisant les longueurs d'onde cotée (excitation et d'émission): bleu (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), le vert (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rouge (562 ± 20 nm / et 625 ± 20 nm) et infrarouge (628 ± 20 nm / 20 et 692 ±nm).
4. Dosage EdU Incorporation
- Le jour -3, plaque 1 x 10 6 cellules IMOP dans un plat de 6 cm. Trois jours plus tard, le jour 0, récolte, dissocier, remettre en suspension et de compter les cellules en répétant les étapes 1,4-1,9.
- Plate 2,5 x 10 5 cellules dans des milieux de culture de IMOP et 5 x10 5 cellules sensorielles médias de différenciation de l'épithélium dans différents puits d'une plaque à 6 puits.
- Déterminer le pourcentage de cellules en phase S par Edu incorporation au jour 3 en utilisant un dosage d'incorporation EdU
- Ajouter EdU actions directement aux cultures IMOP pour obtenir une concentration finale de 1 uM EdU dans le milieu de culture.
- Incuber EdU dans des cultures de IMOP pendant 2 heures et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Harvest, dissocier et de recueillir des cellules répétez les étapes 1,4-1,9. Ajouter à 4% de formaldehyde dans du PBS 1X pendant 15 minutes. à la température ambiante pour fixer les cellules. Récolte des cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Enlever la solution de formaldéhyde et properly disposer.
- Étiquette de noyaux de cellules avec Hoechst et incorporés EdU fluorescence verte avec de l'azoture de colorant selon le protocole du fabricant.
REMARQUE: Tous les lavages sont effectués avec du PBS 1X, 3% de BSA et 0,1% de cellules Tween 20. Laver avec 1X PBS deux fois. - Cellules de montage sur une diapositive à l'aide antifade réactif et placer un verre de 1,5 couvercle sur l'échantillon. Acquérir les images fluorescentes de cellules marquées à l'aide d'un microscope à épifluorescence.
5. Différencier Neurones IMOP-Derived
- Faire 50 ml de milieu de différenciation neuronale: médias Neurobasal, 1X supplément B27, 2 mM de L-glutamine. Thaw bouteille de 50X B27 et 200 mM de L-glutamine en 37 ° C bain d'eau pendant 5 min. Ajouter 1 ml 50X B27 et 0,5 ml de 200 mM de L-glutamine à 48,5 ml de milieu Neurobasal.
- Manteau lamelle en plaçant 12 mm rondes 1,5 lamelles de verre dans un 10 cm plaque stérile et ajouter 70% de EtOH à la plaque pour stériliser et nettoyer les lamelles.
- Agiter doucement l'anserslips pour vous assurer qu'ils sont couverts dans l'éthanol. Laissez la plaque pendant 10 min à température ambiante. Rincer les lamelles 3 fois avec stérile PBS 1X pour laver l'éthanol restant. Rincer la lamelle une fois avec H 2 0 stérile pour laver restant PBS 1X.
- Aspirer le H 2 0 2 ml en utilisant une pipette d'aspiration et de laisser les lamelles sec. Exposer les lamelles à la lumière UV dans la culture de tissus hotte pendant 15 min. Magasin lamelles de dans un environnement stérile, si elle est utilisée immédiatement.
- Placez une lamelle 12 mm rond dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Agiter doucement la plaque pour garantir que les lamelles reposent à plat sur le fond du puits.
- Thaw 2 mg / ml de poly-D-lysine solution stock à RT et diluer à 10 pg / ml concentration poly-D-lysine dans PBS 1X. Ajouter 0,25 ml de 10 pg / ml de poly-D-lysine dans les puits. Laissez la plaque dans l'incubateur à 37 ° pendant 1 heure.
- Laver les puits 3 fois avec stérile PBS 1X. Thaw 10 mg ml de solution / boursier laminine à la température ambiante et diluer à 10 ug / ml dans du PBS 1X. Ajouter 0,25 ml de 10 pg / ml de laminine solution de travail dans un seul puits d'une plaque 24 multipuits. Incuber la plaque à 37 ° C incubateur. Aspirer la solution de laminine à l'aide d'une pipette 2 ml d'aspiration.
- Laver la lamelle 3 fois avec du PBS 1X en ajoutant dans 1 ml de PBS 1X avec une pipette P1000 et l'élimination du PBS 1X par aspiration avec une pipette de 2 ml d'aspiration. Laissez 1X PBS à partir du dernier lavage dans le puits jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être plaqué. Initier la différenciation neuronale par la récolte, la dissociation et le comptage des cellules dans les étapes 1.4-1.9.Plate cellules 1 x 10 6 dans un plat de 6 cm à Jour -3.
- Au jour 0, la récolte, de dissocier et de compter les cellules en répétant 1,4-1,9. Graine 1 x 10 5 à 1,5 x 10 5 cellules dans 0,5 ml IMOP multimédias différenciation neuronale préchauffé par puits dans une boîte de 24 puits multiples. Aspirer et ajouter des médias de la différenciation neuronale préchauffé à des cultures tous les autres jours.
- Fixer neurones IMOP dérivés de formaldéhyde 4% pendant 15 min. unt RT sur la Journée solution de formaldéhyde 7. Retirer, laver neurones IMOP dérivés avec un tampon de lavage (PBS 1X contenant 0,1% de Triton X-100) avant incubation dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 10% de sérum de chèvre normal et 0,1% de Triton X-100) pendant 1 heure.
- Remplacer tampon et incuber des échantillons dans un tampon bloquant avec l'anticorps dilué. Incuber à 4 ° C. Laver les échantillons avec 1X PBS contenant 0,1% de Triton X-100 cellules soumises à immunocoloration 27. Laver la lamelle avec du PBS 1X avant de placer sur des supports de montage. Permettre aux médias de montage à sec à 4 ° C avant d'acquérir des images à épifluorescence comme indiqué dans l'étape 3.8.
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Representative Results
bFGF Retrait Diminutions prolifération dans des cellules IMOP
Pour diminuer la capacité de prolifération des cellules IMOP et initier la différenciation des cellules IMOP, le bFGF a été retiré à partir de la culture. Pour confirmer que le retrait du facteur de croissance diminue la prolifération, EdU incorporation a été utilisé comme un test de prolifération. Le pourcentage de cellules qui a incorporé de otospheres EdU cultivées avec un milieu de culture IMOP (contenant bFGF) et otospheres cultivées dans des milieux de l'épithélium sensoriel (sans bFGF) a été comparé. Otosphere cultures ont été puisées avec l'analogue nucléotidique EDU, récoltées et fixe. Nucléotides Incorporated Edu ont été marquées par fluorescence avec AlexaFluor 488 azoture utilisant clic-chimie. Les cellules provenant otospheres cultivées en l'absence de bFGF ont montré une diminution de l'incorporation EdU par rapport à des cellules cultivées avec le bFGF (Figure 1A-F). Comme la taille of la otosphere augmenté, il est plus difficile de visualiser l'ensemble des cellules de la otosphere avec un microscope à épifluorescence. Pour remédier à cela, les cellules ont été dissociées et montées de façon à pouvoir être visualisés en masse sans ambiguïté. Même après la dissociation et la fixation, les cellules agrégés de nouveau. Pour maintenir les cellules dans un état de dissociation, détergents qui empêchent les cellules de ré-agrégation ont été testés. Tween 20 est une des détergents qui ont empêché réagrégation des cellules. Les cellules dissociées ont été lavées avec 0,1% de Tween 20 et montées sur des lames. Edu cellules marquées ont ensuite été visualisées par microscopie épifluorescence (figure 1G, H). Des résultats représentatifs provenant d'expériences individuelles (n = 5) ont montré une diminution significative du pourcentage de cellules EdU marqué de 48% à 19% au bout de 3 jours après retrait du bFGF (p <0,005). Ces résultats confirment une chute spectaculaire du pourcentage de cellules en phase S et le potentiel de prolifération de cellules après IMOPretrait bFGF.
IMOP dérivé sensorielle épithéliums express CDKN1B et Show changements morphologiques
Une chronologie de IMOP sensorielle protocole de différenciation des épithéliums est représenté (figure 2A). Otospheres de cultures prolifératives ont été dissociées en cellules individuelles et laisse récupérer pendant 3 jours dans des milieux de culture IMOP. Cette méthode permet d'enrichir pour la prolifération des cellules et sélectionne contre les cellules post-mitotiques dans ces cultures à partir. Après 3 jours, otospheres néoformés ont été ensemencées dans sensorielle milieux de différenciation des épithéliums et autorisés à subir une différenciation non guidé pendant 10 jours. Des images lumineuses de cultures typiques contenant otospheres à différents points de temps après l'ensemencement sur le terrain ont montré une baisse initiale de la taille avant de otospheres commencent augmentation de la taille (figure 2B-E).
27. Pour déterminer si l'expression de CDKN1B (KIP p27) peut être utilisé comme marqueur pour la différenciation, de otospheres épithéliales différenciées de cultures IMOP proliferatives ou sensorielles ont été comparés. Des marqueurs fluorescents ont été visualisés et capturés par microscopie à épifluorescence. Des images représentatives de otospheres de cultures prolifératives ont montré une faible expression de CDKN1B dehors des noyaux avec presque pas de coloration de la phalloïdine (Figure 3 AD). Otospheres cultivées en milieu de différenciation sensorielle de l'épithélium affichées expression concomitante de nucléaire CDKN1B augmenté avec l'apparition de l'étiquetage de la phalloïdine dans les bords périphériques des cellules (figure 3 EH). En proliférant otospheres de IMOP, Cdh1 (E-cadherin) et phalloidin sont faiblement marquées (Figure 3 IL). Dans otospheres de IMOP différenciés, phalloidin prononcée et l'étiquetage Cdh1 mettent en évidence les changements morphologiques dans les filaments et les régions de l'adhésion cellule-cellule (figure 3 MP), similaire aux résultats précédents 27 actine. Au cours de la différenciation de l'épithélium sensoriel, les changements morphologiques dans les filaments d'actine parallèles l'apparition d'expression Cdh1 dans les sites d'adhérence entre les cellules. Dans ce protocole, l'augmentation de l'expression CDKN1B avec les changements dans la phalloïdine et Cdh1 servir d'indicateurs précoces de la différenciation de l'épithélium sensoriel dans les cellules IMOP.
IMOP dérivés neurones express CDKN1B et Tubb3
Un schéma du protocole de IMOP différenciation neuronale est représenté (figure 4A). Similaire au protocole précité, les cellules ont été dissociées IMOP et almugissaient à la récupération pendant 3 jours dans des milieux de culture IMOP. Otospheres ont été récoltées, dissociés en des cellules uniques et ensemencées sur des poly-D-lysine et de laminine revêtu lamelles. Les cellules ont été autorisés à se différencier pendant 7 jours. Images de champ lumineux représentatifs à des points de temps affichés changements morphologiques progressives comme il se différencient en neurones IMOP dérivés (figure 4B-E). Au jour 7, les longs neurites peut être vu à partir de l'extension des corps cellulaires (pointes de flèche Figure 4E). Pour déterminer les changements dans les niveaux d'expression de CDKN1B cours de la différenciation neuronale, de la prolifération des cellules et les neurones IMOP IMOP dérivés ont été comparés. Otospheres ont été marquées avec des anticorps Hoechst et CDKN1B. cellules IMOP de otospheres prolifération avaient quelques cellules avec une faible expression de CDKN1B nucléaire (Figure 4 FH). En outre, les neurones IMOP dérivés ont montré une augmentation du nombre de cellules avec expression de CDKN1B nucléaire 7 jours après la différenciation neuronale (Figure 4IK). Pour déterminer si les cellules ont été CDKN1B adoptent une lignée neuronale, l'étiquetage des neurones IMOP dérivés avec le marqueur neuronal Tubb3 a été fait. Des images représentatives de neurones IMOP dérivés ont montré co-étiquetage des CDKN1B et Tubb3 (Figure 5 AD). Grossissement et la quantification des neurites à partir de ces cellules ont montré une moyenne de 1,5 neurites associés à chaque cellule Tubb3 étiquetés (n = 60) (figure 5 EG). Dans notre protocole de différenciation neuronale, immunocoloration avec CDKN1B Tubb3 et peut être utilisé comme un indicateur de la différenciation en neurones IMOP dérivé bipolaire ou pseudo-unipolaires.
CDKN1B nucléaire niveaux d'expression augmentent après Lancement Différenciation
Les changements morphologiques dans otospheres montrent des changements qualitatifs dans les cellules IMOP car ils subissent une différenciation. Pour atteindre les résultats quantitatifs de l'IMMUnofluorescence images pour désigner des événements précoces de différenciation, nucléaire intensité de fluorescence des cellules individuelles à partir de CDKN1B prolifération de IMOP (n = 239) et les cellules subissant une différenciation IMOP de l'épithélium sensoriel (n = 246) ont été mesurées. Pour normaliser CDKN1B signaux de fluorescence provenant d'expériences indépendantes, le rapport de CDKN1B à Hoechst fluorescence à partir de cellules individuelles a été déterminée. Histogrammes de l'intensité de fluorescence normalisée de CDKN1B de prolifération des cellules IMOP (noir) et épithéliums sensoriels différenciation des cellules IMOP (en rouge) ont été tracées (figure 6A). Une augmentation du nombre de cellules exprimant élevés CDKN1B a été observée comme un déplacement vers la droite de l'histogramme pour la différenciation des épithéliums sensoriels (rouge) par rapport à l'histogramme de cellules proliférantes IMOP (noir). Afin de déterminer l'augmentation du pourcentage de cellules exprimant CDKN1B, pour un seuil normalisées CDKN1B unités d'intensité de fluorescence (0,65) a été réglé (tête de flèche) et le pourcentage de cellules ABO ve le seuil a été déterminé. Après la différenciation des épithéliums sensoriels, les cellules IMOP affichent une augmentation de 25,3% à 67,1% de cellules exprimant CDKN1B (figure 6B). La même analyse quantitative a été appliquée pour les neurones IMOP dérivés. Lorsque l'on compare les cellules IMOP prolifératives (n = 525) et les neurones de IMOP dérivé 7 jour (n = 583) un déplacement vers la droite dans l'histogramme associé avec les neurones de IMOP dérivé a été observée par rapport à l'histogramme de la prolifération des cellules de IMOP (Figure 6C). Détermination du pourcentage de cellules au-dessus du seuil a révélé une augmentation dans les cellules exprimant CDKN1B de 23,5% à 85,5% (figure 6D). En utilisant les protocoles décrits, l'analyse quantitative de l'expression CDKN1B confirmé une augmentation du nombre de cellules qui régulent à la hausse au cours de l'épithélium sensoriel CDKN1B et la différenciation neuronale. L'augmentation du nombre de cellules exprimant CDKN1B peuvent être utilisés pour confirmer la différenciation des cellules IMOP dans ces protocoles.
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Figure 1. EdU statuts comme un test pour déterminer proliférative État des cultures de IMOP. IMOP dérivé otospheres cultivées en présence de bFGF. Les noyaux des cellules ont été marquées avec (A) et Hoechst (B) image fusionnée de Hoechst et Edu fluorescence EdU AlexaFluor 488. (C). Otospheres cultivées 3 jours dans des milieux dépourvus bFGF. Des cellules provenant de cultures ont été marquées avec (D) et Hoechst (E) EdU AlexaFluor 488. (F) des images fusionnées de Hoechst et EdU étiquetage. Images de fluorescence issu de la fusion de Hoechst (magenta) et EdU (vert) cellules marquées après dissociation otospheres et lavage avec du PBS 1X contenant 0,1% de Tween 20. Les cellules ont été de otospheres culture (G) en présence de bFGF ou (H) absence de bFGF. Longueur de l'échelle10 bars sont à moins d'indication um. (I) Pourcentage de EdU cellules à partir de cellules IMOP cultivées en présence ou en l'absence de bFGF marqué. Le nombre de cellules individuelles analysées a été notée dans les graphique à barres et les barres d'erreur ont été dépeinte comme erreur standard de la moyenne (SEM). Les comptages cellulaires étaient de n = 5 expériences indépendantes. Test t de Student a été effectuée afin de déterminer la signification statistique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma général de Sensory épithéliums différenciation. (A) Calendrier de la différenciation des cellules de l'épithélium sensoriel dans IMOP. Le graphique représente le temps de dissociation de la cellule et les changements de supports. (B) contraste de phase typiqueimages de otospheres le jour 0, (C) 3, (D) et 7 (E) 10 différenciation des épithéliums pendant sensorielle non guidée. Longueur de la barre d'échelle est de 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Expression de marqueurs indicatifs de l'arrêt du cycle cellulaire et la différenciation dans IMOP dérivé sensorielle épithéliums. Otosphere de cellules IMOP cultivées dans des milieux de culture IMOP. Les noyaux des cellules ont été marquées avec (A) et Hoechst anticorps (B) CDKN1B. Actine filamenteuse a été marqué avec (C) phalloïdine. (D) L'image fusionnée d'un otospheres typiques contenant des cellules proliférantes IMOP. Otospheres à partir de cellules ont été cultivées dans IMOP epith sensorielleelia milieux de culture pour 10 jours. Des cellules provenant otopsheres ont été marqués (E) Hoechst, (F) CDKN1B et (G) phalloïdine. (H) image fusionnée de otospheres montrant augmenté CDKN1B et l'étiquetage de la phalloïdine. Otospheres proliférantes ont été marquées avec (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K) phalloïdine. (L) L'image fusionnée montre faible fluorescence de ces marqueurs. Otospheres différenciées en épithéliums sensoriels ont également été marquées avec (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) phalloïdine. (P) L'image fusionnée montre un fort marquage typique Cdh1 et phalloïdine. Longueur des barres d'échelle sont de 10 um à moins d'indication. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Schéma général de différenciation neuronale. (A) Calendrier de la différenciation des cellules en neurones IMOP. Phase images de contraste de cellules IMOP subissant la différenciation neuronale au (B) Jour 1, (C) 3, (D) 5 et (E) 7. Pointes de flèches pointent vers neurites. Images de fluorescence de cellules en culture comme otospheres IMOP dans des milieux de culture de IMOP marqués avec (F) et Hoechst (G) CDKN1B. (H) image fusionnée de cellules marquées avec Hoechst et CDKN1B. Images de fluorescence des cellules IMOP après 7 jours de culture dans les médias de la différenciation neuronale. Les noyaux des cellules ont été marquées avec (I) et Hoechst (J) CDKN1B. (K) image fusionnée de cellules marquées avec Hoechst et CDKN1B. Longueur des barres d'échelle sont de 10 um, sauf indication contraire. om / files / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Expression des marqueurs moléculaires indicatif de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale. IMOP cellules 7 jours après la différenciation neuronale. Les noyaux ont été marquées avec (A) Hoechst, (B) Tubb3 (neuronale β-tubuline) des anticorps pour mettre en évidence la morphologie cellulaire et des anticorps (C) CDKN1B. (D) d'image fusionné avec étiquetage des CDKN1B et Tubb3 dans des cellules individuelles. Longueur de la barre d'échelle est de 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. Cellule à l'unité d'analyse quantitative de l'intensité de fluorescence CDKN1B. (A) Intensité de fluorescence normalisée de CDKN1B expression a été déterminée en calculant le rapport de CDKN1B Hoechst et l'intensité de fluorescence à partir de cellules individuelles. L'intensité de fluorescence normalisée a été tracée par rapport au nombre de cellules sous forme d'histogramme. Normalisé intensité de fluorescence de CDKN1B de la prolifération des cellules de IMOP cultivées en présence de bFGF (noir) et otospheres de IMOP différenciées en épithélium sensoriel (SE) (rouge) ne sont montrés. Un seuil a été fixé à 0,65 unités normalisées d'intensité de fluorescence (pointe de flèche) (B) de pourcentage de cellules exprimant IMOP CDKN1B dessus de la valeur de seuil, de proliférer (noir) et l'épithélium différenciée cultures sensorielles (en rouge). (C) a fusionné image fluorescente des cellules épithéliales différenciées IMOP sensorielles marquées par des anticorps Hoechst et Myo6. (D (E) Pourcentage de cellules exprimant IMOP CDKN1B de proliférer (noir) et neuronales différenciant cultures (rouge). Les cellules individuelles ont été utilisées pour l'analyse désignés dans chaque graphique à barres. Les résultats ont été compilées à partir de différentes expériences (n = 3) et les barres d'erreur décrits comme SEM. Le test t de Student a été utilisé pour déterminer la signification statistique. (F) a fusionné image fluorescente de bipolaire ou neurones IMOP dérivés pseudo-unipolaire marqués avec Hoechst et Tubb3. Longueur des barres d'échelle sont de 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Culture Cellulaire navire | Surface Area (cm 2) | Nombre de cellules ensemencées pour l'entretien courant | Nombre de cellules ensemencées pour sensorielle épithéliums Différenciation | Nombre de cellules ensemencées pour la différenciation neuronale | Facteur d'échelle relative à la boîte de 60 mm | Volume du média utilisé (ml) | |
| Multwell Plaques | |||||||
| 96 | 0,3 | 10.000 | 20.000 | 10,000-50,000 | 0,015 | 0,1 | |
| 24 | 2 | 90000 | 180000 | 100.000-150.000 | 0,100 | 0,5 | |
| 12 | 4 | 180000 | 360000 | 300,000 | 0,200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500000 | 1000000 | 500,000-750,000 | 0,500 | 2 | |
| De la vaisselle | |||||||
| 35 mm | 10 | 500000 | 1000000 | 500000 | 0,500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1000000 | 2000000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2500000 | 5000000 | 2,500,000- 3000000 | 3.000 | 8 | |
Tableau 1. le nombre de cellules pour le maintien de la différenciation des cellules IMOP dans le VarTissue Culture reconnaissances de dette Formats des plaques.
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Discussion
Suivi Cultures IMOP
Un protocole pour le maintien de l'auto-renouvellement et la promotion de la différenciation d'une lignée cellulaire de IMOP roman est décrit et formats de placage supplémentaires sont inclus (tableau 1). Plusieurs étapes critiques qui aident à la dilatation de routine et la différenciation des cellules IMOP sont notés. Semblable à des cultures de cellules souches pluripotentes, cellules IMOP ont théoriquement une durée de vie indéfinie. Pour veiller à ce que les lignées cellulaires sont correctement entretenus, les cultures de IMOP sont régulièrement contrôlés pour la viabilité cellulaire, auto-renouvellement et potentiel de différenciation. Pour déterminer la viabilité cellulaire après dissociation, nous employons une coloration au bleu trypan. En général, plus de 70% des cellules sont viables après dissociation. Pour surveiller l'auto-renouvellement des cellules IMOP, immunocoloration avec des anticorps Sox2 c-Myc et se fait. Dans des conditions de culture de prolifération, les cellules ont IMOP un temps de doublement d'environ 18 heures. Altérations de l'expression de l'auto-renouvellement des marqueurs ou de fairetemps ubling sont des indicateurs potentiels de l'auto-renouvellement altérée. Pour surveiller le potentiel de différenciation des cellules IMOP, la sortie du cycle cellulaire et l'expression des marqueurs de stade précoce pour épithéliale sensorielle ou neurones sont utilisés pour évaluer le potentiel de différenciation des cellules. Si les cellules IMOP ne passent pas l'une quelconque des critères décrits ci-dessus, il serait souhaitable de mettre fin aux cultures.
Variables qui affectent les cultures de IMOP
Une étape cruciale dans la culture de cellules IMOP est de maintenir une concentration active de bFGF dans les cultures de promouvoir l'auto-renouvellement. bFGF est apparemment très labile à 37 ° C lors de la culture de cellules 29,30. La croissance des cultures peut être significativement affectée par la différenciation spontanée en raison de l'instabilité bFGF. Dans le protocole actuel, du milieu frais est constamment fournie aux cultures afin de maintenir les niveaux de bFGF supérieures à 5 ng / ml. La stabilisation des niveaux de bFGF en utilisant une libération contrôlée deglycolique et des microsphères de polyester d'acide lactique pourraient réduire la fréquence des changements de média nécessaires pour maintenir constants les niveaux de bFGF dans des milieux 31. Ajout de la bFGF régulièrement libérable permettra de réduire la nécessité d'ajouter souvent les médias pour maintenir les niveaux de bFGF dans des cultures de IMOP.
Une autre étape cruciale dans le maintien de la viabilité des cellules IMOP est de limiter l'exposition aux réactifs de dissociation et cisaillement mécanique. Dans le protocole courant, la dissociation est effectuée par incubation avec 1 mM d'EDTA. Maîtriser le temps d'incubation excessive avec de l'EDTA, réduisant cisaillement mécanique excessive causée par pipetage vigoureux et limitant multiples étapes de centrifugation lors de passage de cellules de IMOP aidera à augmenter la viabilité cellulaire. Attention portée à ces étapes peut efficacement maintenir la viabilité d'un grand nombre de cellules lors de l'expansion de cultures.
Au cours de la culture de routine de cellules IMOP, plusieurs procédés pour dissocier les cellules ont été testées. Mechancisaillement ical de pipetage peut être utilisée pour dissocier otospheres, mais ne uniformément ou systématiquement produit pas de cellules individuelles. L'utilisation de réactifs disponibles dans le commerce pour la dissociation cellulaire de cellules IMOP peut générer efficacement des cellules individuelles de otospheres, mais ces réactifs affecter les propriétés adhésives des cellules de réformer otospheres et à adhérer aux surfaces traitées. Afin d'utiliser des réactifs commerciaux, de multiples lavages ont été nécessaires pour éliminer les réactifs de dissociation avant d'employer des protocoles de différenciation.
Dans les protocoles de différenciation actuelles, les deux conditions de l'épithélium et de différenciation neuronale sensorielle entraîné la mort de la cellule qui a été observé sous la forme de cellules ou amas de cellules mortes simples. La mort cellulaire apoptotique peut être dû à l'absence de différenciation ou la survie des signaux appropriés au cours de la culture in vitro prolongée. Les deux conditions de différenciation contenues supplément de B27 pour favoriser la survie des cellules. Bien B27 supplément a été montré pour favoriser la survie des neurones hippocampiques primaires 32, il peut ne pas être suffisant pour favoriser la survie des cellules IMOP. L'addition de composés tels que l'inhibiteur de ROCK peut aider à maintenir et à augmenter la survie des cellules pendant la culture IMOP de routine et dans la différenciation in vitro. Inhibiteur de ROCK a été largement utilisé dans les cultures de cellules souches pluripotentes de promouvoir la survie des cellules dans les cultures sans sérum sans affecter la différenciation 33. Ajout d'un inhibiteur de ROCK aux milieux de culture peut aider à augmenter la survie des cellules lors de protocoles de différenciation longs sans affecter le potentiel de différenciation des cellules IMOP. Augmentation de la survie cellulaire permettra développement de protocoles afin de générer efficacement un grand nombre de cellules ciliées matures ou SGN.
Augmentation de l'expression CDKN1B comme un marqueur précoce de différenciation IMOP
Au cours du développement cochléaire précoce, l'événement initial de la cellulela sortie du cycle précède la différenciation des cellules ciliées, cellules de soutien et SGN 34. Mitose terminale de progéniteurs neuronaux se propage dans une vague à partir de la base et en progressant vers le sommet de la cochlée 35. Dans une pente opposée, mitose borne de progéniteurs prosensory qui donnent naissance à des cellules ciliées et des cellules de soutien progresse depuis le sommet jusqu'à la base de la cochlée 34,36. Bien que l'expression temporelle de CDKN1B correspond bien à l'état post-mitotique, il est probablement pas le seul facteur qui favorise la sortie du cycle cellulaire dans le développement de la cochlée. À l'appui de cela, CDKN1B animaux mutants peuvent encore développer des cellules de cheveux post-mitotiques 37. Au lieu de cela, CDKN1B peut être utilisé comme un indicateur précoce pour marquer le début de la différenciation. Dans les cultures de différenciation IMOP non guidées, un marqueur précoce de différenciation va aider à l'élaboration de protocoles de promouvoir premiers stades de la différenciation des caractéristiques morphologiques évidentes avant peuvent être observées. </ p>
Similaire au développement otique, la sortie du cycle initie la différenciation et les résultats dans l'augmentation des niveaux CDKN1B dans les cellules IMOP. Dans des cellules proliférantes de IMOP, seule une faible expression de niveau de CDKN1B peut être observée. Autres inhibiteurs de kinases cycline-dépendantes telles que CDKN1A (p21 CIP) peuvent être responsables de la progression du cycle cellulaire normal dans les cellules IMOP. Au cours de l'épithélium sensoriel et la différenciation neuronale de cellules IMOP, l'analyse quantitative de cellules uniques a révélé un sous-ensemble de cellules avec une augmentation de l'expression CDKN1B dans la différenciation des cultures de IMOP (Figure 6A, C). Expression de CDKN1B dans ces cellules sont une indication de cellules IMOP subissant la différenciation terminale.
Cellules IMOP comme une plateforme cellulaire pour étudier Destin Cellulaire Détermination
Comme les cellules IMOP peuvent passer d'un état d'ancêtre à différentes lignées otiques in vitro, ils peuvent être utilisés pour étudier le destin des cellules otiquedétermination. Actuellement, le protocole décrit utilisé procédures de différenciation non guidées pour générer différents types de cellules auriculaires. Le système de IMOP permet plus de molécules bioactives, composés et gènes définis qui guident les cellules IMOP vers la cellule de cheveux matures, cellules de soutien et les lignages SGN. Une utilisation de la plateforme cellulaire IMOP est de tester les facteurs de transcriptions candidats (TF) qui favorisent la différenciation. L'expression de TF clé peut être utilisée pour entraîner la cellule de cheveux ou de la différenciation neuronale. Expression de CDKN1B avec marqueurs établis ou caractéristiques morphologiques des cellules ciliées et SGN peut être utilisé pour déterminer la contribution de TFS candidats à lignages distincts otiques 38,39.
TF candidats tels que Atoh1 sont essentiels pour le développement des cellules de cheveux et ont été réorientés pour promouvoir la différenciation des cellules ciliées dans la cochlée 40,41 endommagé. Introduction d'Atoh1 en cellules IMOP peut aider à promouvoir la différenciation des cellules de cheveux. Dans le developing cochlée, tant Ngn1 et NeuroD1 sont nécessaires pour la différenciation de SGN appropriée in vivo 42-44. Expression de Ngn1 ou NeuroD1 dans les cellules IMOP peut favoriser la différenciation SGN. Ces expériences sont semblables à générer des cellules neuronales induites (IN), où l'expression de la TF individuellement ou en combinaison peut convertir fibroblastes ou cellules souches pluripotentes en neurones 45-48. Présentation de TFS qui sont normalement exprimés au cours du développement des cellules ciliées ou SGN est une bonne stratégie pour guider les cellules IMOP vers la cellule de cheveux ou SGN lignée.
Les conditions qui favorisent la différenciation d'un grand nombre de cellules et SGN cheveux IMOP dérivé fourniront une plate-forme cellulaire robustes pour la modélisation de la maladie, le criblage de petites molécules et tests de toxicologie qui peut être accompli rapidement et de manière rentable avant que les tests de main-d'œuvre chez les rongeurs sont initiés . Le protocole décrit présente un système simple et polyvalent qui peut être utilisé pour studying différenciation des progéniteurs otique et se prête à des expériences à grande échelle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
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