Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

بدء التمايز في الخلايا متعددة القدرات مخلد أذني السلف

doi: 10.3791/53692 Published: January 2, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الحفاظ على التجديد الذاتي في الخلايا IMOP

  1. إعداد IMOP سائل الإعلام والثقافة: DMEM / F12، 1X B27 تكملة، 25 ميكروغرام / مل carbenecillin و 20 نانوغرام / مل bFGF. جعل 50 مل من IMOP سائل الإعلام والثقافة باستخدام الكواشف معقمة. الاحماء 49 مل من DMEM / F12 في المخروطية 50 مل في 37 ° C حمام الماء.
    1. ذوبان الجليد 50X B27 تكملة وفلتر تعقيم 100 ملغ / مل carbenecillin قسامات لمدة 5 دقائق في حمام مائي 37 ° C. ذوبان الجليد من 100 ميكروغرام / مل bFGF قسامة في RT. إضافة 1 مل 50X B27، 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل bFGF و 12.5 ميكرولتر من 100 ملغ / مل carbenecillin في DMEM / F12.
  2. استخدام 3 مل من وسائل الإعلام في 60 ملم صحن زراعة الأنسجة للخلايا زراعة IMOP. إضافة وسائط جديدة لثقافات كل يوم من خلال مضاعفة حجم وسائل الاعلام. ضمان لا يسهو أن تركيز bFGF أقل من 5 نانوغرام / مل.
    1. خلايا IMOP الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. خلايا مرور بعد 5-7 أيام في الثقافة كما هو موضح في الخطوات التالية. ثقافة نقل إلى 15مل المخروطية باستخدام ماصة 10 مل.
  3. جعل 1 ملم EDTA في HBSS عن طريق تمييع 0.1 مل من 0.5 M EDTA الرقم الهيدروجيني 8،0 إلى 50 مل من HBSS. قبل دافئ 1 ملم EDTA المحرز في HBSS في 37 ° C حمام الماء.
  4. حصاد الخلايا عن طريق الترسيب الجاذبية أو الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. في RT. لخطورة الترسيب، ضع مخروطي 15 مل تحتوي على الثقافات في الحاضنة 37 درجة مئوية ل5-10 دقيقة. بعد ذلك الوقت، ومراقبة otospheres جمع في الجزء السفلي من مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: قوة الطرد المركزي المفرط يمكن أن يسبب تلف الخلايا.
  5. بعناية قضى نضح وسائل الإعلام باستخدام 2 مل الشفط ماصة دون الإخلال بيليه الخلية. إضافة 0.5 مل من قبل تحسنت حل 1 ملم EDTA HBSS إلى الخلية بيليه. باستخدام ماصة P1000، الماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات. وضع المخروطية في 37 ° C واحتضان ل<5 دقائق لتسهيل التفكك إلى خلايا واحدة.
  6. دوامة بلطف حل الخلية لتحديد ما إذا كان يتم فصل otospheres. إذا لم اوتومجالات الرواسب في قاع مخروطي، وفصل الخلايا. قد تختلف وقت الحضانة.
    ملاحظة: سوف المطول الحضانة مع EDTA يؤدي إلى موت الخلايا المفرط.
  7. إزالة الخلايا من 37 ° C، إضافة 2 مل من وسائل الاعلام لتحييد ويخفف من EDTA. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح من المخفف EDTA باستخدام 2 مل الشفط ماصة وإضافة 5 مل من 1X PBS لغسل الخلايا.
  8. تدور الخلايا في أسفل 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT ونضح من 1X PBS باستخدام 2 مل الشفط ماصة. resuspend الخلايا باستخدام ماصة P1000 في 0.5 مل من IMOP سائل الإعلام والثقافة من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
  9. عد الخلايا باستخدام عداد الجسيمات ميكروفلويديك مع الأشرطة المناسبة 28. وهناك لوحة متكدسة من خلايا IMOP يحتوي ~ 6 X10 6 خلايا. تمييع الخلايا 1: 100 في وسائل الإعلام وإضافة 75 ماي من حل الخلية في شريط كاسيت لفرز الأصوات. لوحة 1 × 10 6 خلايا في طبق 6 سم في IMOP cultuإعادة سائل الإعلام (~ 1: 10 تمييع). iMOPs مرور كل 5-7 أيام.
    ملاحظة: الخلايا التي تشكل otospheres كبيرة أو نعلق على الجزء السفلي من صحن زراعة الأنسجة والتفريق. الخلايا سوف يموت أيضا إذا كان الثقافات قد ولت متموجة.

2. التجميد والذوبان خلايا IMOP

  1. إعداد الاصطناعية المتوسطة تجميد كتبها الذوبان وتوازنه الحل إلى 4 درجات مئوية قبل خلايا التجميد.
  2. جمع الخلايا من سم طبق متموجة 6 خلايا IMOP. استخدام ماصة 10 مل ونقل الخلايا (~ 6-8 × 10 6 خلايا) في مخروطي 15 مل.
  3. حصاد الخلايا عن طريق الترسيب الجاذبية أو الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إذا كان otospheres صغيرة، والخلايا لا تسوية عن طريق الجاذبية الترسيب. اختياري: عد الخلايا باستخدام الخطوة 1.9 لتحديد إجمالي أعداد الخلايا.
  4. قضى نضح وسائل الإعلام باستخدام 2ML الشفط ماصة مع ترك الخلية بيليه فضفاضة وراء.
  5. إضافة 0.25 مل من وسائل الإعلام تجميد الاصطناعية ل resuspend مLLS في كثافة ~ 5 × 5-3 أكتوبر × 10 6 خلية / مل. ماصة بلطف الخلايا مع ماصة P1000. نقل تعليق الخلية إلى قارورة المبردة باستخدام ماصة P1000 مع 1 مل تصفيتها طرف.
  6. ضع قارورة في وعاء تجميد خالية من الكحول ووضع الحاوية تجميد في -80 ° C إلى خفض درجة حرارة 1 ° C في الدقيقة الواحدة حتى تصل درجة الحرارة -80 ° C.
  7. للتخزين على المدى الطويل من الخلايا، ونقل قنينات إلى مرحلة البخار من السائل خزان النيتروجين. لذوبان الجليد من الخلايا للثقافة وتتوازن قارورة المبردة التي تحتوي على الخلايا المجمدة في -80 ° C.
  8. قبل دافئ وسائل الإعلام ثقافة IMOP في 37 ° C حمام الماء.
  9. ذوبان الجليد القارورة المجمدة بسرعة يحوم أسفل القارورة في 37 ° C حمام الماء. إضافة 1 مل من IMOP قبل تحسنت وسائل الإعلام ثقافة إلى الخلايا إذابة مرة واحدة يختفي الكريستال الجليدي الأخير. نقل الخلايا إلى 15 مل المخروطية وإضافة 4 مل إضافية من IMOP سائل الإعلام والثقافة
  10. تدور 15 مل المشتركnical لمدة 5 دقائق. في 200 x ج ونضح وسائل الإعلام المستهلك. resuspend الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة IMOP وخلايا لوحة في طبق 6 سم. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 للتوسع.

3. تمييز الخلايا الحسية IMOP في الظهارة

  1. إعداد 50 مل من IMOP وسائل الإعلام ظهائر الحسية التمايز: DMEM / F12، 1X B27 تكملة، 25 ميكروغرام / مل carbenecillin. جعل 50 مل من IMOP الحسي وسائل الإعلام ظهائر التمايز. الاحماء 49 مل من DMEM / F12 في المخروطية 50 مل في 37 ° C حمام الماء. ذوبان الجليد 50X B27 تكملة و 100 ملغ / مل carbenecillin قسامات لمدة 5 دقائق. في 37 ° C حمام الماء. إضافة 1 مل 50X B27 و 12.5 ميكرولتر من 100 ملغ / مل carbenecillin في DMEM / F12.
  2. حصاد، فصل، و resuspend وعدد الخلايا كرر الخطوات من 1،4-1،9
  3. لوحة 1 × 10 6 خلايا في طبق 6 سم في يوم -3 باستخدام IMOP سائل الإعلام والثقافة. في يوم 0 والثقافات نقل باستخدام ماصة 10 مل إلى 15 مل المخروطية. جمع اوتوالمجالات عن طريق الجاذبية الترسيب كما ذكر في الخطوة 1.6. نضح من قضى وسائل الإعلام باستخدام 2 مل الشفط ماصة وترك otospheres على الجزء السفلي من المخروطية.
  4. إضافة بلطف في 2 مل من وسائل الإعلام الحسي ظهائر التمايز. نقل otospheres إلى طبق 6 سم باستخدام كبيرة تحمل 10 مل ماصة.
    ملاحظة: القص الميكانيكية من pipetting لالقاسي يمكن أن تنأى الخلايا من otospheres.
  5. إضافة 2 مل من الحسي جديدة وسائل الاعلام الظهارية التمايز إلى ثقافات كل يوم. إذا لزم الأمر، والخلايا التي يمكن جمعها بواسطة الترسيب الجاذبية وسائل الإعلام استبدالها.
  6. جمع otospheres في يوم 10 عن طريق نقل إلى 15 مل المخروطية والسماح للotospheres على الرسوبيات كما جاء في خطوة 1.6.Aspirate وسائل الإعلام قضى باستخدام 2 مل الشفط ماصة وترك otospheres دون عائق.
  7. إصلاح otospheres التي يحتضنها في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة الحل الفورمالديهايد، وغسل otospheres مع غسل العازلة (1X PBS تحتوي على 0.1٪ TritonX 100) قبل تفرخ في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي و 0.1٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة.
    1. استبدال العازلة واحتضان عينات في عرقلة العازلة مع الأجسام المضادة المخفف. احتضان عند 4 درجات مئوية. عينات غسل مع 1X PBS تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 موضوع وotosphere إلى 27 المناعية. otospheres نقل إلى 1X PBS وotospheres المكان إلى تصاعد وسائل الإعلام على شريحة زجاجية باستخدام ماصة P1000. وضع ساترة على عينة والسماح لوسائل الإعلام متزايدة لتجف في 4 درجات مئوية.
  8. الحصول على صور epifluorescence باستخدام الإعداد مجهر مقلوب مزودة بكاميرا CCD 16 بت وإما 20X 0.75 الهواء أو NA الهدف الغمر النفط 40X 1.3. جمع مضان من قنوات مختلفة الألوان باستخدام المدرجة (الإثارة والانبعاث) الأطوال الموجية: الأزرق (377 ± 25 نانومتر / 447 ± 30 نانومتر) والأخضر (475 ± 25 نانومتر / 540 ± 25 نانومتر) والأحمر (562 ± 20NM / و 625 20NM ±) والأشعة تحت الحمراء (628 ± 20NM / و 692 ± 20نانومتر).

4. يعاير ايدو التأسيس

  1. في يوم -3، لوحة 1 × 10 6 خلايا IMOP في طبق 6 سم. بعد ثلاثة أيام على يوم 0، الحصاد، فصل، و resuspend وعدد الخلايا بتكرار الخطوات 1،4-1،9.
  2. لوحة 2.5 × 10 5 خلايا في وسائل الإعلام ثقافة IMOP و5 X10 5 الخلايا الحسية في وسائل الإعلام ظهائر التمايز في آبار مختلفة من صحن 6 جيدا.
  3. تحديد النسبة المئوية للخلايا في المرحلة S من قبل ايدو التأسيس في يوم 3 باستخدام التأسيس فحص EDU
    1. إضافة الأسهم ايدو مباشرة على ثقافات IMOP للحصول على تركيز النهائي من 1 ميكرومتر ايدو في وسائل الإعلام الثقافة.
    2. احتضان ايدو في الثقافات IMOP لمدة 2 ساعة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. الحصاد، وفصل وجمع الخلايا كرر الخطوات من 1،4-1،9. أضيف في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة. في RT لإصلاح الخلايا. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة الحل الفورمالديهايد وبصورة ملائمةذ التصرف.
    3. نوى تسمية الخلايا مع هويشت وأدرجت ايدو مع الأخضر مضان صبغ أزيد وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
      ملاحظة: تتم جميع يغسل مع 1X PBS، 3٪ BSA و 0.1٪ خلايا توين 20. غسل مع 1X PBS مرتين.
    4. خلايا جبل على شريحة باستخدام antifade كاشف وتضع كوب 1.5 غطاء على عينة. الحصول على صور الفلورسنت من الخلايا المسمى باستخدام المجهر epifluorescence.

5. تمييز الخلايا العصبية المستمدة IMOP

  1. جعل 50 مل من وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية: Neurobasal وسائل الإعلام، 1X B27 تكملة، 2 مم L-الجلوتامين. زجاجة ذوبان الجليد من 50X B27 و 200 ملي L-الجلوتامين في 37 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق. إضافة 1ML 50X B27 و 0.5 مل 200 ملي L-الجلوتامين إلى 48.5 مل من وسائل الإعلام Neurobasal.
  2. معطف ساترة عن طريق وضع 12 ملم 1.5 coverslips الزجاج في العقيمة 10 سم لوحة وإضافة 70٪ ETOH لوحة لتعقيم وتنظيف لل coverslips.
  3. تستنهض الهمم بلطف كوفrslips لضمان يتم تغطيتها في الإيثانول. ترك لوحة لمدة 10 دقيقة في RT. شطف لل coverslips 3 مرات مع العقيمة 1X PBS لتغسل الإيثانول المتبقية. شطف ساترة مرة واحدة مع H العقيمة 2 0 لتغسل ما تبقى 1X PBS.
  4. نضح H 2 0 باستخدام 2 مل الشفط ماصة والسماح لل coverslips الجافة. كشف لل coverslips للأشعة فوق البنفسجية في غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. متجر coverslips في بيئة معقمة إذا لم يتم استخدامها فورا.
  5. وضع ساترة واحد 12 ملم في كل بئر من صحن 24 أيضا. يهز لوحة بلطف لضمان لل coverslips شقة تقع في الجزء السفلي من البئر.
  6. ذوبان الجليد 2 ملغ / مل بولي-D-يسين حل السهم عند RT وتمييع إلى 10 ميكروغرام / مل تركيز بولي-D-يسين في برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 0.25 مل من 10 ميكروغرام / مل بولي-D-ليسين إلى الآبار. ترك لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  7. غسل الآبار 3 مرات مع العقيمة 1X PBS. ذوبان الجليد 10 ملغ / مل حل الأسهم laminin في RT وتمييع إلى 10 ميكروغرام / ملتر في 1X PBS. إضافة 0.25 مل من 10 ميكروغرام / مل laminin حل العمل في بئر واحدة من طبق 24 متعددة جيدا. احتضان لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية. نضح من الحل laminin باستخدام 2 مل الشفط ماصة.
  8. غسل ساترة 3 مرات مع 1X PBS عن طريق إضافة في 1 مل من 1X PBS مع ماصة P1000 وإزالة PBS 1X بواسطة الشفط مع 2 مل الشفط ماصة. ترك 1X PBS من غسل الماضي في البئر حتى الخلايا على استعداد لتكون مطلية. الشروع في تمايز الخلايا العصبية من قبل الحصاد، وعدم الربط عد الخلايا في الخطوات 1.4-1.9.Plate 1 × 10 6 خلايا في طبق 6 سم في يوم -3.
  9. في يوم 0، الحصاد، وفصل عدد الخلايا عن طريق تكرار 1،4-1،9. البذور 1 × 10 5-1،5 × 10 5 خلايا IMOP إلى 0.5 مل قبل تحسنت وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية لكل بئر في 24 طبق متعددة جيدا. نضح وإضافة قبل تحسنت وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية للثقافات كل يوم.
  10. إصلاح الخلايا العصبية IMOP المشتقة في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 15 دقيقة. اتي RT يوم 7. إزالة الحل الفورمالديهايد، وغسل الخلايا العصبية IMOP المشتقة مع غسل العازلة (1X PBS تحتوي على 0.1٪ TritonX-100) قبل تفرخ في عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي و 0.1٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة.
    1. استبدال العازلة واحتضان عينات في عرقلة العازلة مع الأجسام المضادة المخفف. احتضان عند 4 درجات مئوية. عينات غسل مع 1X PBS تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 الخلايا المناعية تخضع ل27. غسل ساترة مع 1X PBS قبل وضع على وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. السماح لوسائل الإعلام متزايدة لتجف في 4 درجات مئوية قبل الحصول على الصور epifluorescence كما هو موضح في الخطوة 3.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

bFGF سحب النقصان انتشار في خلايا IMOP

للتقليل من قدرة التكاثري من الخلايا IMOP والشروع في تمايز الخلايا IMOP، تم سحب bFGF من الثقافات. للتأكد من أن عامل النمو انسحاب يقلل الانتشار، كان يعمل ايدو التأسيس كشرط فحص الانتشار. وتمت مقارنة نسبة الخلايا التي أدرجت ايدو من otospheres مثقف مع وسائل الإعلام ثقافة IMOP (التي تحتوي على bFGF) وotospheres مثقف في وسائل الإعلام ظهائر الحسية (بدون bFGF). تم نابض الثقافات Otosphere مع التناظرية النوكليوتيدات ايدو، تحصد والثابتة. وصفت النيوكليوتيدات أدرجت ايدو fluorescently مع Alexafluor 488 أزيد يستخدم النقر الكيمياء. خلايا من otospheres نمت في غياب bFGF أظهرت انخفض إدماج ايدو نسبة إلى الخلايا المستزرعة مع bFGF (الشكل 1A-F). ويبلغ حجم سو زاد من otosphere، كان من الصعب على نحو متزايد لتصور كل الخلايا من otosphere مع مجهر epifluorescent. ولمعالجة ذلك، تم فصل الخلايا وشنت بحيث يمكن تصور بشكل لا لبس فيه بشكل جماعي. حتى بعد التفكك والتثبيت، والخلايا إعادة تجميعها. للحفاظ على خلايا في حالة فصلها، تم اختبار المنظفات التي منعت الخلايا من إعادة الارشفة. كان توين 20 واحدة من المنظفات التي حالت دون إعادة التجميع للخلايا. تم غسلها تنفصل الخلايا مع 0.1٪ توين 20 والتي شنت على الشرائح. ايدو الخلايا المسمى ثم تم تصور بواسطة المجهر epifluorescence (الشكل 1G، H). (ن = 5) أظهرت نتائج ممثلة من التجارب الفردية انخفاضا كبيرا في نسبة ايدو صفت الخلايا من 48٪ إلى 19٪ بعد 3 أيام بعد bFGF انسحاب (P <0.005). هذه النتائج تؤكد انخفاض حاد في نسبة الخلايا مرحلة S وإمكانات التكاثري من الخلايا IMOP بعد bFGF الانسحاب.

المستمدة IMOP الحسية الظهارة اكسبرس Cdkn1b ومشاهدة المورفولوجية التغييرات

ويرد الجدول الزمني للIMOP الحسي بروتوكول ظهائر التمايز (الشكل 2A). تم فصلها Otospheres من الثقافات التكاثري في الخلايا واحد وسمح لاسترداد لمدة 3 أيام في وسائل الإعلام ثقافة IMOP. يساعد هذا الأسلوب إثراء لتكاثر الخلايا ويختار ضد الخلايا بعد الإنقسامية في هذه الثقافات ابتداء. بعد 3 أيام، والمصنف otospheres شكلت حديثا في وسائل الإعلام الحسي ظهائر التمايز ويسمح للخضوع لتمايز غير موجهة لمدة 10 يوما. وأظهرت لقطات الحقل مشرق الثقافات نموذجية تحتوي على otospheres في نقاط زمنية مختلفة بعد البذر انخفاضا في حجم الأولي قبل بدء otospheres زيادة في الحجم (الشكل 2B-E).

جنرال الكتريك = "1"> منذ brightfield المجهري لا يمكن أن تكشف الكثير من التغييرات التي تحدث أثناء تمايز الخلايا IMOP، المناعية مع الواسمات الجزيئية تم استخدامها لتسليط الضوء على الميزات المورفولوجية والجزيئية للخلايا متمايزة 27. لتحديد ما إذا كان التعبير عن Cdkn1b (P27 KIP) يمكن أن تستخدم كعلامة للتمايز، وتمت مقارنة otospheres من ظهائر متباينة الثقافات IMOP التكاثري أو حسية. وتصور علامات الفلورسنت واستولت عليها المجهر epifluorescence. وأظهرت لقطات تمثيلية من otospheres من الثقافات التكاثري التعبير انخفاض Cdkn1b خارج النواة مع ما يقرب من أي تلطيخ phalloidin (الشكل 3 م). Otospheres المثقف في وسائل الإعلام الحسي ظهائر التمايز المعروضة زاد التعبير عن Cdkn1b يصاحب النووي مع ظهور العلامات phalloidin في الحواف المحيطية من الخلايا (الشكل 3 EH). في المتكاثرة otospheres IMOP، Cdh1 (cadheri Eن) وphalloidin وصفت ضعيف (الشكل 3 IL). في otospheres IMOP متباينة، phalloidin وضوحا ووضع العلامات Cdh1 تسليط الضوء على التغيرات الشكلية في خيوط ومناطق خلية خلية التصاق (الشكل 3 MP)، على غرار النتائج السابقة 27 الأكتين. خلال الحسي ظهائر التمايز، والتغييرات الشكلية في خيوط الأكتين موازية ظهور Cdh1 التعبير في مواقع الالتصاق بين الخلايا. في هذا البروتوكول، والزيادة في Cdkn1b التعبير جنبا إلى جنب مع التغييرات في phalloidin وCdh1 تخدم مؤشرات مبكرة على الحسي ظهائر التمايز في الخلايا IMOP.

الخلايا العصبية اكسبرس Cdkn1b وTubb3 المستمدة IMOP

ويرد التخطيطي IMOP بروتوكول تمايز الخلايا العصبية (الشكل 4A). وعلى غرار بروتوكول المذكور، تم فصل الخلايا IMOP و آلlowed لاسترداد لمدة 3 أيام في وسائل الإعلام ثقافة IMOP. تم حصاد Otospheres، نأت إلى خلايا واحدة والمصنفة على بولي-D-يسين و laminin المغلفة coverslips. سمح للخلايا التفريق لمدة 7 أيام. صور مشرقة مجال التمثيل في نقاط زمنية عرض التغيرات المورفولوجية التقدمية لأنها متباينة في الخلايا العصبية IMOP المشتقة (الشكل 4B-E). قبل يوم واحد 7، يمكن أن ينظر neurites التي طويلة تمتد من أجسام الخلايا (السهام الشكل 4E). لتحديد التغيرات في مستويات التعبير عن Cdkn1b خلال تمايز الخلايا العصبية، الخلايا المتكاثرة IMOP والخلايا العصبية IMOP المستمدة من قورنت. وصفت Otospheres مع هويشت وCdkn1b الأجسام المضادة. لديها خلايا IMOP من otospheres المتكاثرة خلايا قليلة مع انخفاض النووي Cdkn1b التعبير (الشكل 4 FH). وعلاوة على ذلك، أظهرت الخلايا العصبية IMOP المستمدة من زيادة في عدد الخلايا مع التعبير Cdkn1b النووي بعد 7 أيام تمايز الخلايا العصبية (الشكل 4IK). لتحديد ما إذا كانت الخلايا Cdkn1b تم اعتماد نسب الخلايا العصبية، وقد تم وضع العلامات من العصبونات IMOP المشتقة مع علامة العصبية Tubb3. وأظهرت لقطات تمثيلية من الخلايا العصبية IMOP المستمدة المشارك العلامات المميزة للCdkn1b وTubb3 (الشكل 5 م). أظهر التكبير وتقدير من neurites التي من هذه الخلايا بمعدل 1.5 neurites التي ترتبط مع بعضها Tubb3 صفت الخلية (ن = 60) (الشكل 5 EG). لدينا في بروتوكول تمايز الخلايا العصبية، المناعية مع Cdkn1b وTubb3 يمكن استخدامها كمؤشر على التمايز في الخلايا العصبية المشتقة IMOP القطبين أو شبه أحادية القطب.

Cdkn1b النووية مستويات التعبير الزيادة بعد بدء التمايز

التغييرات الشكلية في otospheres تظهر التغيرات النوعية في الخلايا IMOP كما أنها تخضع التمايز. لتحقيق النتائج الكمية من immuصور nofluorescence للدلالة على الأحداث التمايز في وقت مبكر، وكثافة مضان النووية لCdkn1b من الخلايا الفردية المتكاثرة IMOP (ن = 239) والخلايا IMOP تمر الحسي ظهائر التمايز (ن = 246) تم قياس. لتطبيع إشارات مضان Cdkn1b من تجارب مستقلة، تم تحديد نسبة Cdkn1b إلى هويشت مضان من الخلايا الفردية. تم رسم رسوم بيانية للكثافة مضان تطبيع من Cdkn1b من الخلايا المتكاثرة IMOP (أسود) وظهائر الحسية تمييز الخلايا IMOP (أحمر) (الشكل 6A). وقد لوحظ زيادة في عدد الخلايا معربا عن ارتفاع Cdkn1b تحولا نحو اليمين من الرسم البياني لالحسي ظهائر التمايز (أحمر) بالنسبة للرسم البياني لتكاثر الخلايا IMOP (أسود). لتحديد زيادة في نسبة الخلايا معربا عن Cdkn1b، عتبة لCdkn1b وحدة كثافة مضان تطبيع (0.65) ومجموعة (رأس السهم) والنسبة المئوية للخلايا ABO لقد تم تحديد عتبة. بعد الحسي ظهائر التمايز، عرض خلايا IMOP زيادة من 25.3٪ إلى 67.1٪ من الخلايا معربا عن Cdkn1b (الشكل 6B). تم تطبيق نفس التحليل الكمي للخلايا العصبية IMOP مشتقة. عند مقارنة الخلايا IMOP التكاثري (ن = 525) والخلايا العصبية المشتقة IMOP 7 يوم (ن = 583) لوحظ وجود تحول نحو اليمين في الرسم البياني المرتبطة الخلايا العصبية المشتقة IMOP نسبة إلى الرسم البياني لتكاثر الخلايا IMOP (الشكل 6C). تحديد النسبة المئوية للخلايا فوق عتبة كشف زيادة في Cdkn1b الخلايا معربا عن من 23.5٪ إلى 85.5٪ (الشكل 6D). باستخدام البروتوكولات المذكورة، وأكد التحليل الكمي للCdkn1b التعبير زيادة في عدد الخلايا التي upregulate Cdkn1b خلال ظهائر الحسية وتمايز الخلايا العصبية. الأعداد المتزايدة من Cdkn1b الخلايا معربا يمكن استخدامها لتأكيد تمايز الخلايا IMOP في هذه البروتوكولات.

jove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" 1 "> الشكل 1
الشكل 1. ايدو التأسيس باعتباره الفحص لتحديد التكاثري دولة الثقافات IMOP. IMOP المستمدة otospheres المثقف في وجود bFGF. وصفت نوى الخلايا مع (A) هويشت و (B) EDU Alexafluor 488. (C) صورة مدموجة من هويشت وايدو مضان. Otospheres مثقف 3 أيام في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى bFGF. وصفت الخلايا من الثقافات مع (D) هويشت و (E) EDU Alexafluor 488. (F) الصور المدمجة من هويشت وايدو وضع العلامات. وكانت الصور مضان اندمجت من هويشت (أرجواني) وايدو (الأخضر) الخلايا المسمى بعد الانفصال otospheres وغسل مع 1X PBS تحتوي على 0.1٪ توين 20. خلايا من otospheres مثقف (G) في وجود bFGF أو (H) غياب bFGF. طول نطاققضبان هي 10 ميكرون ما لم يذكر. (I) في المئة من ايدو وصفت الخلايا من الخلايا IMOP مثقف في وجود أو عدم وجود bFGF. ويصور عدد من الخلايا الفردية تحليلها وتدل داخل شريط الرسم البياني والخطأ الحانات حيث الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). وكانت التهم خلية من ن = 5 تجارب مستقلة. وقد تم اختبار t للطالب لتحديد الدلالة الإحصائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تخطيطي العام الحسية الظهارة التمايز. (A) الجدول الزمني للتمييز بين الخلايا IMOP إلى ظهائر الحسية. الرسم البياني خط يدل على زمن تفارق الخلية والتغييرات الوسائط. (B) المرحلة النموذجية المقابلصور otospheres يوم 0، (C) 3 (D) 7 و (E) 10 أثناء غير موجهة الحسي ظهائر التمايز. طول شريط المقياس هو 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. التعبير عن علامات إرشادية لاعتقال دورة الخلية والتمايز في المستمدة IMOP الحسية الظهارة. Otosphere الخلايا IMOP مثقف في وسائل الإعلام ثقافة IMOP. وصفت نوى الخلايا مع (A) هويشت و (B) Cdkn1b الأجسام المضادة. وصفت الأكتين الخيطية مع (C) phalloidin. (D) صورة المدمجة من otospheres نموذجية تحتوي على الخلايا المتكاثرة IMOP. تم مثقف Otospheres من خلايا IMOP في epith الحسيةإيليا سائل الإعلام والثقافة لمدة 10 يوما. وتميزت الخلايا من otopsheres مع (E) هويشت، (F) Cdkn1b و(G) phalloidin. (H) صورة مدموجة من otospheres عرض زيادة Cdkn1b ووضع العلامات phalloidin. وصفت otospheres المتكاثرة مع (I) هويشت، (J) Cdh1، (K) phalloidin. (L) تظهر الصورة المدمجة ضعف مضان من هذه العلامات. وصفت Otospheres متباينة في ظهائر الحسية أيضا مع (M) هويشت، (N) Cdh1، (O) phalloidin. (P) تظهر الصورة المدمجة العلامات قوي نموذجي Cdh1 وphalloidin. طول الحانات هي مقياس 10 ميكرون ما لم يذكر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ز بديل = "الشكل 4" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 53692 / 53692fig4.jpg" />
الرقم 4. تخطيطي عام العصبية التمايز. (A) الجدول الزمني للتمييز بين الخلايا IMOP إلى الخلايا العصبية. على النقيض من الصور المرحلة من خلايا IMOP تمر تمايز الخلايا العصبية في (B) يوم 1، (C) 3 (D) 5 و (E) تشير 7. النصال على neurites التي. الصور مضان من الخلايا IMOP مثقف كما otospheres في وسائل الإعلام ثقافة IMOP المسمى مع (F) هويشت و (G) Cdkn1b. (H) صورة مدموجة من الخلايا المسمى مع هويشت وCdkn1b. الصور مضان من الخلايا IMOP بعد 7 أيام من ثقافة في وسائل الإعلام تمايز الخلايا العصبية. وصفت نوى الخلايا مع (I) هويشت و(J) Cdkn1b. (K) صورة مدموجة من الخلايا المسمى مع هويشت وCdkn1b. طول الحانات هي مقياس 10 ميكرون ما لم يذكر. OM / ملفات / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. التعبير الجزيئية علامات إرشادية للخروج دورة الخلية العصبية والتمايز. IMOP الخلايا بعد 7 أيام تمايز الخلايا العصبية. وصفت نوى مع (A) هويشت، (B) Tubb3 (الخلايا العصبية β تويولين) الأجسام المضادة لتسليط الضوء على مورفولوجيا الخلايا والأجسام المضادة (C) Cdkn1b. (D) صورة مدموجة مع وضع العلامات من Cdkn1b وTubb3 في الخلايا الفردية. طول شريط النطاق هو 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

OAD / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
تم تحديد الشكل 6. خلية واحدة الكمي مضان تحليل كثافة Cdkn1b. (A) كثافة مضان تطبيع Cdkn1b التعبير عن طريق حساب نسبة Cdkn1b وهويشت كثافة مضان من الخلايا الفردية. وقد تآمر كثافة مضان تطبيع النسبي لأعداد الخلايا كما رسم بياني. ويبين كثافة مضان تطبيع من Cdkn1b من الخلايا المتكاثرة IMOP مثقف في وجود bFGF (أسود) وotospheres IMOP متباينة في ظهائر الحسية (SE) (أحمر). تم تعيين عتبة عند 0.65 وحدة تطبيع كثافة مضان (رأس السهم) (B) النسبة المئوية للخلايا IMOP معربا عن Cdkn1b فوق قيمة العتبة، من الانتشار (أسود) وظهائر متباينة الثقافات الحسية (الحمراء). (C) مدموجة صورة الفلورسنت من ظهائر متباينة الخلايا الحسية IMOP المسمى مع هويشت وMyo6 الأجسام المضادة. (D (E) النسبة المئوية للخلايا IMOP معربا عن Cdkn1b من الانتشار (أسود) والعصبية التفريق الثقافات (الحمراء). وتدل الخلايا الفردية المستخدمة للتحليل في كل رسم بياني بار. تم تجميع النتائج من التجارب المختلفة (ن = 3) وأشرطة الخطأ كما هو مبين SEM. وقد استخدم الطالب اختبار t لتحديد الدلالة الإحصائية. (F) مدموجة صورة الفلورسنت من القطبين أو الخلايا العصبية المشتقة IMOP شبه أحادي القطب المسمى مع هويشت وTubb3. طول الحانات هي مقياس 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خلية الثقافة سفينة سوrface المساحة (سم 2) عدد الخلايا المصنف للصيانة الروتينية عدد الخلايا المزروعة لالحسية الظهارة التمايز عدد الخلايا المزروعة لتمايز الخلايا العصبية توسيع نطاق بالنسبة عامل إلى 60 مم طبق حجم الوسائط المستخدمة (مل)
Multwell لوحات
96 0.3 10000 20000 10،000-50،000 0.015 0.1
24 2 90000 180،000 100،000-150،000 0.100 0.5
12 4 180،000 360،000 300،000 0.200 1
6 10 500،000 1،000،000 500،000-750،000 0.500 2
أطباق
35 ملم 10 500،000 1،000،000 500،000 0.500 2
60 ملم 20 1،000،000 2،000،000 1،000،000-1،500،000 1،000 3
100 مم 60 2،500،000 5،000،000 2،500،000- 3،000،000 3،000 8

الجدول 1. أرقام الخليوي لصيانة تمايز الخلايا IMOP في فارالأنسجة] [إيووس] تنسيقات الثقافة اللوحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

رصد الثقافات IMOP

يوصف بروتوكول للحفاظ على تجديد الذات وتعزيز تمايز خط خلية IMOP الرواية ويتم تضمين صيغ تصفيح إضافية (الجدول 1). وأشار العديد من الخطوات الهامة التي تساعد على توسيع الروتيني وتمايز الخلايا IMOP. على غرار المحفزة مزارع الخلايا الجذعية، الخلايا IMOP لها نظريا لأجل غير مسمى تمتد الحياة. للتأكد من أن خطوط الخلايا يتم الاحتفاظ بشكل صحيح، ويتم رصد الثقافات IMOP بشكل روتيني لبقاء الخلية، تجديد الذات وإمكانية التمايز. لتحديد بقاء الخلية بعد التفكك، ونحن توظيف تلطيخ التريبان الأزرق. بشكل عام، أكثر من 70٪ من الخلايا هي قابلة للحياة بعد التفكك. لرصد التجديد الذاتي في الخلايا IMOP، المناعية مع ج. Myc على والأجسام المضادة Sox2 هو القيام به. في ظل ظروف ثقافة التكاثري، وخلايا IMOP وقتا مضاعفة ~ 18 ساعة. تغييرات في التعبير عن علامات التجديد الذاتي أو القيامubling الوقت هي المؤشرات المحتملة للتغير التجديد الذاتي. رصد إمكانات تمايز الخلايا IMOP، خروج دورة الخلية والتعبير عن علامات مرحلة مبكرة من أجل الظهارية الحسي أو الخلايا العصبية تستخدم لتقييم إمكانية التفريق بين الخلايا. إذا خلايا IMOP لا يمر أي واحد من معيارا المذكورة أعلاه، سيكون من المستحسن إنهاء الثقافات.

المتغيرات التي تؤثر الثقافات IMOP

خطوة حاسمة في زراعة الخلايا IMOP هي للحفاظ على تركيز نشط من bFGF في الثقافات لتعزيز التجديد الذاتي. bFGF يقال عطوب للغاية عند 37 درجة مئوية عند زراعة الخلايا 29،30. نمو الثقافات يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل التمايز عفوية بسبب bFGF عدم الاستقرار. في البروتوكول الحالي، يتم تزويد وسائل الإعلام الجديدة باستمرار إلى الثقافات من أجل الحفاظ على مستويات bFGF فوق 5 نانوغرام / مل. استقرار مستويات bFGF باستخدام التحكم الإفراج عنالجليكوليك وحمض اللاكتيك المجهرية البوليستر يمكن الحد من وتيرة التغييرات الوسائط اللازمة للحفاظ على مستويات ثابتة من bFGF في وسائل الإعلام 31. وإضافة bFGF نشره بشكل مطرد تقلل من الحاجة في كثير من الأحيان إلى إضافة وسائط للحفاظ على مستويات bFGF في الثقافات IMOP.

آخر خطوة حاسمة في الحفاظ على سلامة خلايا IMOP هي للحد من التعرض إلى المواد الكيميائية التفكك والقص الميكانيكية. في البروتوكول الحالي، ويتم إنجاز التفكك التي الحضانة مع 1 ملم EDTA. الحد من الإفراط في فترة حضانة مع EDTA، والحد من القص الميكانيكية المفرطة الناجمة من قبل pipetting قوية والحد من الخطوات الطرد المركزي متعددة عند الركض الخلايا IMOP سوف تساعد على زيادة قابلية الخلية. الاهتمام لهذه الخطوات إمكانية المحافظة على بقاء أعداد كبيرة من الخلايا خلال توسيع الثقافات.

خلال الثقافة الروتينية الخلايا IMOP، تم اختبار عدة طرق لعدم الربط بين الخلايا. ميكانقص كال من pipetting ليمكن استخدامها لفصل otospheres، ولكن لا بشكل موحد أو باستمرار تنتج خلايا مفردة. استخدام الكواشف المتاحة تجاريا لتفارق الخلوي للخلايا IMOP يمكن أن تولد بشكل فعال الخلايا واحد من otospheres، ولكن هذه الكواشف تؤثر على خصائص لاصقة من الخلايا لإصلاح otospheres والتمسك الأسطح المعالجة. من أجل استخدام الكواشف التجارية، وطلب من يغسل متعددة لإزالة الكواشف التفكك قبل استخدام بروتوكولات التمايز.

في البروتوكولات تمايز الحالية، أدت كل من ظهائر وتمايز الخلايا العصبية الحسية في ظروف موت الخلايا الذي لوحظ في شكل الخلايا واحد أو كتل من الخلايا الميتة. يمكن أن يعزى إلى عدم وجود تمايز أو البقاء على قيد الحياة العظة المناسبة أثناء ثقافة طويلة في المختبر موت الخلايا أفكارك. كلا الشرطين التمايز الواردة B27 تكملة لتعزيز بقاء الخلايا. على الرغم من B27 supplemوقد تبين والأنف والحنجرة لتعزيز بقاء الخلايا العصبية الحصين الابتدائية 32، فإنه قد لا يكون كافيا لتعزيز بقاء خلايا IMOP. إضافة مركبات مثل مثبط ROCK قد يساعد في الحفاظ وزيادة بقاء الخلايا IMOP خلال الثقافة الروتينية والتمايز في المختبر. وقد ROCK المانع تستخدم على نطاق واسع في المحفزة الثقافات الخلايا الجذعية لتعزيز بقاء الخلايا في الثقافات حرة المصل دون أن يؤثر ذلك التمايز 33. إضافة ROCK المانع إلى وسائل الإعلام الثقافة يمكن أن تساعد على زيادة بقاء الخلية خلال بروتوكولات التمايز طويلة دون التأثير على إمكانية التفريق بين الخلايا IMOP. وزيادة بقاء الخلية يسمح وضع بروتوكولات لتوليد بكفاءة أعداد كبيرة من خلايا الشعر ناضجة أو SGNs.

زيادة التعبير Cdkn1b كعلامة مبكرة من IMOP التمايز

خلال تنمية القوقعة في وقت مبكر، الحدث الأولي للخليةدورة الخروج يسبق التمايز للخلايا الشعر وخلايا دعم وSGNs 34. الانقسام الطرفي من الأسلاف العصبية ينتشر في موجة بدءا من القاعدة والتقدم نحو قمة القوقعة 35. في التدرج المنافس، الانقسام الطرفي من الأسلاف prosensory التي تؤدي إلى خلايا الشعر والخلايا المساندة تقدم من قمة إلى قاعدة القوقعة 34،36. على الرغم من أن التعبير الزمني للCdkn1b يرتبط بشكل جيد لدولة ما بعد الإنقسامية، فإنه على الأرجح ليس هو العامل الوحيد الذي يشجع خروج دورة الخلية في القوقعة النامية. ودعما لهذا، يمكن Cdkn1b الحيوانات متحولة لا تزال تتطور خلايا الشعر بعد الإنقسامية 37. بدلا من ذلك، Cdkn1b يمكن استخدامها كمؤشر مبكر للاحتفال بداية التمايز. في غير موجهة الثقافات IMOP التمايز، وعلامة مبكرة للتمايز تساعد في وضع بروتوكولات لتعزيز المراحل الأولى من تمايز قبل ويمكن ملاحظة الملامح الشكلية واضحة. </ P>

على غرار تطوير أذني، ودورة للخروج يبدأ التمايز ويؤدي إلى زيادة مستويات Cdkn1b في الخلايا IMOP. في الخلايا المتكاثرة IMOP، فقط التعبير مستوى منخفض من Cdkn1b يمكن ملاحظة. السيكلين مثبطات كيناز التابعة الأخرى مثل Cdkn1a (P21 CIP) قد تكون مسؤولة عن العادي تقدم دورة الخلية في الخلايا IMOP. خلال ظهائر الحسية وتمايز الخلايا العصبية من الخلايا IMOP، كشفت خلية واحدة التحليل الكمي مجموعة فرعية من الخلايا مع زيادة التعبير عن Cdkn1b في التفريق الثقافات IMOP (الشكل 6A، C). التعبير عن Cdkn1b في هذه الخلايا تعد مؤشرا للخلايا IMOP تمر محطة التمايز.

خلايا IMOP بمثابة منصة الخلوي لدراسة الخلية مصير تقرير

منذ خلايا IMOP يمكن الانتقال من دولة السلف إلى الأنساب أذني مختلفة في المختبر، ويمكن استخدامها لدراسة مصير خلية أذنيتقرير. حاليا، تستخدم بروتوكول صفها إجراءات المفاضلة غير موجهة لتوليد أنواع مختلفة من الخلايا أذني. يسمح النظام IMOP لإضافة الجزيئات النشطة بيولوجيا، والمركبات والجينات المحددة التي توجه الخلايا IMOP نحو الخلية الشعر ناضجة، خلية دعم والأنساب SGN. واحد استخدام IMOP منصة الخلوية هو لاختبار العوامل تدوين مرشح (TF) التي تعزز التفرقة. التعبير عن TF رئيسية يمكن استخدامها لدفع الخلايا الشعر أو تمايز الخلايا العصبية. التعبير عن Cdkn1b جنبا إلى جنب مع علامات المنشأة أو الميزات المورفولوجية للخلايا الشعر وSGNs يمكن استخدامها لتحديد مساهمة TFS مرشح لالأنساب أذني متميزة 38،39.

TFS مرشح مثل Atoh1 ضرورية لنمو الخلايا الشعر وتم أغراض أخرى لتعزيز الشعر تمايز الخلايا في القوقعة 40،41 التالفة. مقدمة من Atoh1 إلى خلايا IMOP قد تساعد على تعزيز تمايز الخلايا الشعر. في developiنانوغرام القوقعة، كلاهما مطلوب Ngn1 وNeuroD1 للتمايز SGN السليم في الجسم الحي 42-44. التعبير عن Ngn1 أو NeuroD1 في الخلايا IMOP قد تعزز SGN التمايز. هذه التجارب هي مماثلة لتوليد الخلايا العصبية التي يسببها (في)، حيث إن التعبير عن TFS منفردة أو مجتمعة يمكن تحويل الخلايا الليفية أو الخلايا الجذعية المحفزة في الخلايا العصبية 45-48. مقدمة من TFS التي يتم التعبير عنها عادة خلال تطوير خلايا الشعر أو SGNs هي استراتيجية جيدة لتوجيه الخلايا IMOP نحو الخلية الشعر أو SGN النسب.

والظروف التي تعزز التفريق بين عدد كبير من خلايا الشعر المستمدة IMOP وSGNs توفير منصة الخلوية قوية لنمذجة المرض، صغيرة فحص جزيء واختبار السموم التي يمكن إنجازها بسرعة وفعالية من حيث التكلفة قبل الشروع في اختبارات كثيفة العمالة في القوارض . بروتوكول صفها يعرض نظام بسيط ومتعدد الاستعمالات التي يمكن استخدامها لقtudying أذني السلف التمايز وغير قابلة للتجارب واسعة النطاق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers BioCision BCS-405
Cryogenic Vials (2 ml)  Corning 430654
1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) Electron Microscopy Sciences 72230-01
DMEM/F12 Life Technologies 11320-082
Neurobasal Medium Life Technologies 21103
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 Life Technologies 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025-092
B27 Supplement (50X) Serum Free Life Technologies 17504-044 Stored as 1 ml aliquots
L-Glutamine(200 mM)  Life Technologies 25030-081 Stored as 5 ml aliquots
Natural Mouse Laminin Life Technologies 23017-015 Stored as 1 mg/ml aliquots
Click-iT EdU Alexa Fluor 488  Life Technologies C10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation Media Life Technologies A12542-01
Prolong Gold Antifade Mountant Life Technologies 47743-736 Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Moxi Z Mini Automated Cell Counter Orflo  MXZ001
Moxi Z Cassette Type S Orflo  MXC002
Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) Peprotech 450-33 Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots
Poly-D-Lysine Sigma P7886 Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher Scientific BP2648-1 Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots
5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811D
10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130188
Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130184 
Tissue Culture Treated 6 cm Dish Thermo Fisher Scientific 130181 
EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm Thermo Fisher Scientific SLGV033RS
TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip USA Scientific 1120-3810
TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip USA Scientific 1120-1810
TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl  filter tip USA Scientific 1120-8810
TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip USA Scientific 1126-7810
15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1475-0511
50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1500-1211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12, (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26, (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12, (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235, (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16, (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30, (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490, (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141, (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10, (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091, (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272, (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68, (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21, (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (8), a008409 (2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8, (7), e69314 (2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32, (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138, (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9, (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434, (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30, (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4, (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24, (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8, (2), e56289 (2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234, (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133, (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126, (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137, (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284, (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11, (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128, (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14, (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1, (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18, (1), 25-35 (2015).
بدء التمايز في الخلايا متعددة القدرات مخلد أذني السلف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).More

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter