Protocol
1. Behoud van Self-vernieuwing in IMOP Cellen
- Bereid iMOP cultuur media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin en 20 ng / ml bFGF. Maak 50 ml iMOP voedingsbodems met steriele reagentia. Warmen 49 ml DMEM / F12 in een 50 ml conische in een 37 ° C waterbad.
- Ontdooi 50X B27 supplement en filter gesteriliseerd 100 mg / ml carbenecillin porties gedurende 5 min in een 37 ° C waterbad. Ontdooien 100 ug / ml bFGF portie bij kamertemperatuur. Voeg 1 ml 50X B27, 10 pi 100 pg / ml bFGF en 12,5 pl van 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12.
- Gebruik 3 ml medium in een 60 mm weefselkweekplaat te kweken iMOP cellen. Voeg vers medium aan culturen om de andere dag verdubbeling van de omvang van de media. Zorg ervoor dat de concentratie van bFGF niet beneden 5 ng / ml.
- Culture iMOP cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 Passage cellen na 5-7 dagen kweek zoals aangegeven in de onderstaande stappen. Transfer cultuur aan een 15ml conische met behulp van een 10 ml pipet tip.
- Voeg 1 mM EDTA in HBSS door verdunning van 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS. Pre-warm 1 mM EDTA in HBSS in een 37 ° C waterbad.
- Oogst cellen door zwaartekracht sedimentatie of centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 min. bij kamertemperatuur. Zwaartekracht sedimentatie, plaats de 15 ml conische met de culturen in de 37 ° C incubator voor 5-10 min. Na die tijd acht de otospheres verzamelen op de bodem van de 15 ml conische.
OPMERKING: Overmatig middelpuntvliedende kracht kan celschade veroorzaken. - Zorgvuldig aspireren bracht media met een pipet 2 ml aspireren zonder de celpellet. Voeg 0,5 ml voorverwarmd 1 mM EDTA HBSS oplossing pellet cel. Met behulp van een pipet P1000, voorzichtig pipet op en neer 2-3 keer. Plaats conisch bij 37 ° C en incubeer gedurende <5 min tot dissociatie in afzonderlijke cellen vergemakkelijkt.
- Wervelen voorzichtig de cel oplossing om te bepalen of otospheres worden gescheiden. Als er geen otobollen sediment op de bodem van de conische worden de cellen gedissocieerd. De incubatietijd kan variëren.
OPMERKING: Langdurige incubatie met EDTA leidt tot overmatige celdood. - Verwijder cellen van 37 ° C, voeg 2 ml van de media om te neutraliseren en verdun de EDTA. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren out verdunde EDTA met een pipet 2 ml opzuigen en voeg 5 ml 1X PBS aan de cellen te wassen.
- Spin cellen neer op 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuigen uit 1X PBS met een pipet 2 ml opzuigen. Resuspendeer de cellen met behulp van een P1000 pipet 0,5 ml iMOP kweekmedium door zachtjes en neer te pipetteren 2 - 3 keer.
- Tellen cellen met behulp van een microfluïdische deeltje teller met de juiste cassettes 28. Een samenvloeiing plaat van iMOP cellen ~ 6 X10 bevatten 6 cellen. Verdun de cellen 1: 100 in media en voeg 75 ul celoplossing in de cassette voor het tellen. Plaat 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel in iMOP Culture media (~ 1: 10 verdunning). Passage iMOPs elke 5-7 dagen.
OPMERKING: Cellen die grote otospheres vorm of in de onderkant van de weefselkweekschaal zullen differentiëren. Cellen zullen ook sterven als de culturen zijn meer dan confluent.
2. invriezen en ontdooien IMOP Cellen
- Bereid synthetisch invriesmedium door ontdooien en equilibreren van de oplossing tot 4 ° C voor het invriezen cellen.
- Verzamel cellen uit confluente 6 cm schaaltje iMOP cellen. Gebruik een pipet 10 ml en overdracht cellen (~ 6 - 8 x 10 6 cellen) in een 15 ml conische.
- Oogst cellen door zwaartekracht sedimentatie of centrifugeren bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Als de otospheres klein zijn, zullen de cellen niet te regelen door de zwaartekracht sedimentatie. Optioneel: Tellen cellen met behulp van stap 1,9 tot totale aantal cellen te bepalen.
- Zuig bracht media met behulp van een 2 ml opzuigen pipet terwijl de losse cel pellet achter.
- Voeg 0,25 ml van synthetische bevriezing media ce mengenlls bij een dichtheid van 5 x 10 ~ 5 om 3 x 10 6 cellen / ml. Voorzichtig pipet cellen met een P1000 pipet. Breng de celsuspensie om cryogene flesjes met een P1000 pipet met 1 ml gefilterd tip.
- Plaats de flacons in een alcoholvrije bevriezing container en zet de container invriezen bij -80 ° C tot de temperatuur 1 ° C per minuut te verlagen tot de temperatuur bereikt -80 ° C.
- Voor langdurige opslag van cellen dragen de flesjes de dampfase van vloeibare stikstof opslagtank. Te ontdooien cellen voor cultuur, evenwicht cryogene flacon met bevroren cellen bij -80 ° C.
- Pre-warm iMOP cultuur media in een 37 ° C waterbad.
- Ontdooi de bevroren flacon snel door zwenken van de bodem van de flacon in een 37 ° C waterbad. Voeg 1 ml voorverwarmde iMOP cultuur media om ontdooide cellen eenmaal de laatste ijskristal verdwijnt. Overdracht cellen in een 15 ml conische en voeg een extra 4 ml iMOP cultuur media
- Spin de co 15 mlnische gedurende 5 min. bij 200 xg en zuig het verbruikte media. Resuspendeer de cellen in 2 ml kweekmedium iMOP en plaat cellen in een 6 cm schaaltje. Incubeer kweken bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende expansie.
3. Differentiatie IMOP cellen in Sensory epitheel
- Bereid 50 ml iMOP sensorische epitheel differentiatie media: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin. Maak 50 ml iMOP sensorische epitheel differentiatie media. Warmen 49 ml DMEM / F12 in een 50 ml conische in een 37 ° C waterbad. Dooi 50X B27 supplement en 100 mg / ml carbenecillin monsters gedurende 5 min. in een 37 ° C waterbad. Voeg 1 ml 50X B27 en 12,5 pl van 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12.
- Om te oogsten, distantiëren, resuspendeer en te tellen cellen herhaal stappen 1,4-1,9
- Plaat 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel op dag -3 behulp iMOP cultuur media. Op dag 0, overdracht kweken met een pipet 10 ml in een 15 ml conische. Verzamel de otobollen door zwaartekracht sedimentatie zoals vermeld in stap 1,6. Aspireren out bracht media met een pipet 2 ml opzuigen en laat de otospheres aan de onderzijde van de conische.
- Add zachtjes in 2 ml van de zintuiglijke epitheel differentiatie media. Transfer otospheres een 6 cm schaaltje met een grote diameter 10 ml pipet.
OPMERKING: Mechanische scheren van harde pipetteren kunnen cellen distantiëren van de otospheres. - Voeg 2 ml vers sensorische epitheel differentiatie media culturen om de andere dag. Eventueel kunnen de cellen worden verzameld door zwaartekracht sedimentatie en media vervangen.
- Verzamel otospheres op dag 10 door de overdracht aan een 15 ml conische en waardoor de otospheres om sediment, zoals vermeld in stap 1.6.Aspirate de media bracht met een 2 ml opzuigen pipet en laat de otospheres ongestoord.
- Fix otospheres door incubatie in 4% formaldehyde in 1X PBS gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Verwijderen formaldehyde-oplossing, wassen otospheres met wasbuffer (1X PBS met 0,1% Triton-100) vóór incuberen in blokkerende buffer (1X PBS dat 10% normaal geit serum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur.
- Vervang de buffer en incubeer monsters in het blokkeren van buffer met verdunde antilichaam. Incubeer bij 4 ° C. Spoelmonsters met 1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100 onder de otosphere aan immunokleuring 27. Transfer otospheres in 1X PBS en plaats otospheres in montage media op een glasplaatje met een P1000 pipet. Doe een dekglaasje over het monster en laat fixeermiddelen drogen bij 4 ° C.
- Verwerven epifluorescentie beelden met behulp van een omgekeerde microscoop setup uitgerust met een 16 bit CCD-camera en hetzij een 20X 0,75 lucht of een 40x 1,3 NA olie-immersie objectief. Verzamel fluorescentie van verschillende kleur kanalen met de vermelde (excitatie en emissie) golflengten: blauw (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), groen (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rood (562 ± 20nm / en 625 ± 20nm) en infrarood (628 ± 20nm / en 692 ± 20nm).
4. Het testen van EDU Incorporation
- Op dag -3, plaat 1 x 10 6 iMOP cellen in een 6 cm schaaltje. Drie dagen later op dag 0, oogst, dissociëren, resuspendeer tellen cellen door stap 1,4-1,9.
- Plaat 2,5 x 10 5 cellen in iMOP cultuur media en 5 x10 5 cellen in de sensorische epitheel differentiatie media in verschillende putjes van een 6 goed gerecht.
- Bepaal het percentage cellen in S-fase van Edu opname op dag 3 met een EDU incorporatie assay
- Voeg EDU stock direct naar iMOP kweken tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM EDU verkrijgen in het kweekmedium.
- Incubeer edu in iMOP culturen 2 uur en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. Oogst, scheiden en het verzamelen van cellen herhaal stappen 1,4-1,9. In de 4% formaldehyde in 1X PBS gedurende 15 min. bij RT om cellen te repareren. Oogst de cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen formaldehyde-oplossing en properly beschikken.
- Etiket kernen van cellen met Hoechst en opgenomen Edu met groene fluorescentie kleurstof-azide volgens het protocol van de fabrikant.
Opmerking: Alle wassingen worden uitgevoerd met 1X PBS, 3% BSA en 0,1% Tween 20. Was de cellen tweemaal met 1X PBS. - Mount cellen op een dia met antifade reagens en plaats een 1,5 deksel glas over het monster. Acquire fluorescentiebeelden van gelabelde cellen met behulp van een epifluorescentie microscopie.
5. Differentiatie-IMOP Afgeleid Neuronen
- Maak 50 ml van neuronale differentiatie media: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-glutamine. Ontdooi fles 50X B27 en 200 mM L-glutamine bij 37 ° C waterbad gedurende 5 min. Voeg 1 ml 50X B27 en 0,5 ml 200 mM L-glutamine tot 48,5 ml Neurobasal medium.
- Coat dekglaasje door het plaatsen van 12 mm rond 1,5 dekglaasjes in een steriele 10 cm plaat en voeg 70% EtOH om de plaat te steriliseren en reinigen van de dekglaasjes.
- Voorzichtig schudden de baairslips te zorgen dat ze worden behandeld in ethanol. Laat de plaat gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Spoel de dekglaasjes 3 keer met steriele 1X PBS te spoelen de resterende ethanol. Spoel de dekglaasje eenmaal met steriele H 2 0 te spoelen resterende 1X PBS.
- Zuig het H 2 0 met een pipet 2 ml opzuigen en laat de dekglaasjes drogen. Maak de dekglaasjes aan UV-licht in de weefselkweek kap voor 15 min. Bewaren coverslips in een steriele omgeving als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.
- Plaats een 12 mm rond dekglaasje in elk putje van een 24 goed gerecht. Schud voorzichtig plaat zodat de dekglaasjes plat op de bodem van de put.
- Ontdooien 2 mg / ml poly-D-lysine voorraadoplossing bij kamertemperatuur en verdun tot een 10 ug / ml poly-D-lysine-concentratie in 1X PBS. Voeg 0,25 ml van 10 ug / ml poly-D-lysine aan de putjes. Laat de plaat in de 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Was de putjes 3 keer met steriel 1X PBS. Dooi 10 mg / ml laminine voorraad oplossing bij kamertemperatuur en verdund tot 10 ug / ml in 1X PBS. Voeg 0,25 ml van 10 ug / ml laminine werkoplossing in een enkel putje van een 24 meerdere putjes. Incubeer de plaat bij 37 ° C incubator. Zuigen de laminine oplossing om met een 2 ml opzuigen pipet.
- Was het dekglaasje 3 keer met 1X PBS door toevoegen van 1 ml 1X PBS met een P1000 pipet en de 1X PBS verwijderd door opzuigen met een pipet 2 ml opzuigen. Vertrekken 1X PBS van de laatste wasbeurt in het goed totdat cellen zijn klaar om te worden verzilverd. Initiëren neuronale differentiatie door het oogsten, dissociatie en het tellen van cellen in stappen 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 cellen in een 6 cm schotel op dag -3.
- Op dag 0, oogsten, dissociëren en tel cellen door het herhalen van 1,4-1,9. Zaad 1 x 10 5-1,5 x 10 5 iMOP cellen in 0,5 ml voorverwarmde neuronale differentiatie media per putje in een 24 multi-well schotel. Aspireren en voeg voorverwarmd neuronale differentiatie media culturen om de andere dag.
- Fix iMOP afgeleide neuronen in 4% formaldehyde gedurende 15 min. eent RT op dag 7. Verwijder formaldehyde oplossing, wassen iMOP-afgeleide neuronen met wasbuffer (1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100) vóór incuberen in blokkerende buffer (1X PBS dat 10% normaal geit serum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur.
- Vervang de buffer en incubeer monsters in het blokkeren van buffer met verdunde antilichaam. Incubeer bij 4 ° C. Spoelmonsters met 1 x PBS bevattende 0,1% Triton X-100 onderworpen cellen immunokleuring 27. Was de dekglaasje met 1X PBS voordat u op de montage media. Laat de fixeermiddelen gedroogd bij 4 ° C voor het verkrijgen epifluorescentie beelden als genoemd in stap 3,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
bFGF Intrekking Verlaagt Proliferatie in IMOP Cellen
Om het proliferatieve vermogen van cellen iMOP verminderen en leiden iMOP differentiatie van cellen, werd bFGF uit de kweken genomen. Om te bevestigen dat groeifactor terugtrekking vermindert proliferatie, werd Edu incorporatie werkzaam als proliferatietest. Het percentage cellen die EDE overgenomen uit otospheres gekweekt met iMOP kweekmedia (bevattende bFGF) en otospheres gekweekt in sensorische epitheel media (zonder bFGF) werd vergeleken. Otosphere culturen werden gepulseerd met de nucleotide analoge Edu, geoogst en gefixeerd. Incorporated edu nucleotiden werden fluorescent gelabeld met AlexaFluor 488 azide met behulp van click-chemie. Cellen van otospheres gekweekt in afwezigheid van bFGF vertoonden verminderde opname van EDE ten opzichte van cellen gekweekt met bFGF (Figuur 1A-F). Aangezien de grootte of de otosphere verhoogd, was steeds moeilijker om alle cellen van het otosphere met epifluorescerende microscoop zichtbaar. Om dit aan te pakken, werden de cellen gedissocieerd en gemonteerd dat deze ondubbelzinnig kan worden gevisualiseerd en massa. Zelfs na dissociatie en fixatie werden de cellen opnieuw geaggregeerd. Om de cellen in een gedissocieerde toestand te houden, werden wasmiddelen die de cellen van re-aggregerend voorkomen getest. Tween 20 werd één van de detergentia die re-aggregatie van de cellen voorkomen. Gedissocieerde cellen werden gewassen met 0,1% Tween 20 en gemonteerd op objectglaasjes. Edu gelabelde cellen werden vervolgens gevisualiseerd door epifluorescentie microscopie (figuur 1 G, H). Representatieve resultaten uit afzonderlijke experimenten (n = 5) vertoonden een significante daling van het percentage EDE gemerkte cellen van 48% tot 19% na 3 dagen na terugtrekking bFGF (p <0,005). Deze resultaten bevestigen een dramatische daling van het percentage S-fase cellen en proliferatieve vermogen van cellen na iMOPbFGF terugtrekking.
-IMOP afgeleid Sensory epitheel Express Cdkn1b en tonen morfologische veranderingen
Een chronologie van iMOP sensorische epitheel differentiatie protocol wordt getoond (Figuur 2A). Otospheres van proliferatieve kweken werd gescheiden in afzonderlijke cellen en toegestaan om te herstellen voor 3 dagen in iMOP cultuur media. Deze methode helpt verrijken voor delende cellen en selecteert tegen post-mitotische cellen in deze uitgangspunten culturen. Na 3 dagen werden nieuw gevormde otospheres uitgezaaid in sensorische epitheel differentiatie media en liet ongeleide differentiatie ondergaan gedurende 10 dagen. Helderveld beelden van typische kweken die otospheres op verschillende tijdstippen na enten vertoonden een aanvankelijke afname in grootte voordat otospheres start steeds groter (Figuur 2B-E).
27 te markeren. Om te bepalen of expressie van Cdkn1b (p27 KIP) kan worden gebruikt als een merker voor differentiatie werden otospheres van proliferatief of sensorische epitheel gedifferentieerd iMOP kweken vergeleken. Fluorescerende markers werden gevisualiseerd en gevangen genomen door epifluorescentie microscopie. Representatieve beelden van otospheres van proliferatieve culturen toonde lage expressie van Cdkn1b buiten de kernen met bijna geen phalloidin kleuring (figuur 3 AD). Otospheres gekweekt in sensorische epitheel differentiatie media weergegeven verhoogde expressie van nucleaire Cdkn1b gelijktijdig met het verschijnen van phalloidin etikettering in de perifere randen van cellen (figuur 3 EH). In delende iMOP otospheres, Cdh1 (E-cadherin) en phalloidin zijn zwak gelabeld (Figuur 3 IL). In gedifferentieerde iMOP otospheres, uitgesproken phalloidin en Cdh1 labeling benadrukken de morfologische veranderingen in actine filamenten en gebieden van adhesie van cellen (figuur 3 MP), vergelijkbaar met vorige resultaten 27. Tijdens sensorische epitheel differentiatie, de morfologische veranderingen in actine filamenten parallel het verschijnen van Cdh1 expressie in adhesieplaatsen tussen cellen. In dit protocol, de toename Cdkn1b expressie samen met de veranderingen in phalloidin en Cdh1 dienen als vroege indicatoren van sensorische epitheel differentiatie iMOP cellen.
-IMOP afgeleid Neuronen Express Cdkn1b en Tubb3
Een schema van iMOP neuronale differentiatie protocol wordt getoond (Figuur 4A). Vergelijkbaar met de hiervoor genoemde protocol, werden iMOP cellen los en algevolgd om het herstel voor 3 dagen in iMOP cultuur media. Otospheres werden geoogst, gedissocieerd in enkele cellen en gezaaid op poly-D-lysine en laminine gecoate dekglaasjes. Men liet de cellen te differentiëren 7 dagen. Representatieve heldere veld beelden op tijdstippen weergegeven progressieve morfologische veranderingen zoals ze gedifferentieerd in iMOP afgeleide neuronen (figuur 4B-E). Op dag 7, kan lange neurieten worden gezien die zich uitstrekt van de cel lichaam (Figuur 4E pijlpunten). Om de veranderingen in de expressie van Cdkn1b bepalen tijdens neuronale differentiatie, prolifererende iMOP cellen en iMOP afgeleide neuronen werden vergeleken. Otospheres werden gelabeld met Hoechst en Cdkn1b antilichamen. iMOP cellen uit prolifererende otospheres had weinig cellen met lage nucleaire Cdkn1b expressie (Figuur 4 FH). Bovendien iMOP-afgeleide neuronen vertoonden een toename van het aantal cellen met expressie Cdkn1b kern 7 dagen na neuronale differentiatie (Figuur 4IK). Om te bepalen of de Cdkn1b cellen werden de aanneming van een neuronale afkomst, etikettering van iMOP-afgeleide neuronen van de neuronale marker Tubb3 werd gedaan. Representatieve beelden van iMOP-afgeleide neuronen toonde co-etikettering van Cdkn1b en Tubb3 (Figuur 5 AD). Vergroting en kwantificering van neurieten uit deze cellen vertoonden gemiddeld 1,5 neurieten geassocieerd met elk Tubb3 gemerkte cellen (n = 60) (figuur 5 EG). In onze neuronale differentiatie protocol immunokleuring met Cdkn1b en Tubb3 kan worden gebruikt als een indicator van differentiatie in pseudo-bipolaire of unipolaire-iMOP afgeleide neuronen.
Nucleaire Cdkn1b Expression verhogen na Initiëren Differentiatie
De morfologische veranderingen in otospheres tonen kwalitatieve veranderingen in iMOP cellen als ze differentiatie ondergaan. Kwantitatieve resultaten van de IMMU bereikennofluorescence beelden aan te geven vroege differentiatie gebeurtenissen, nucleaire fluorescentie-intensiteit van Cdkn1b van individuele prolifererende iMOP cellen (n = 239) en iMOP cellen ondergaan sensorische epitheel differentiatie (n = 246) werden gemeten. Om Cdkn1b fluorescentiesignalen van onafhankelijke experimenten te normaliseren, de verhouding Cdkn1b aan Hoechst fluorescentie van afzonderlijke cellen werd bepaald. Histogrammen van de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van Cdkn1b van prolifererende iMOP cellen (zwart) en sensorische epitheel iMOP differentiërende cellen (rood) werden uitgezet (figuur 6A). Een toename van het aantal hoge Cdkn1b expressie brengende cellen waargenomen als een verschuiving naar rechts van het histogram voor de sensorische epitheel differentiatie (rood) ten opzichte van het histogram van prolifererende iMOP cellen (zwart). Om de toename van het percentage cellen die Cdkn1b een drempel voor Cdkn1b genormaliseerde fluorescentie-intensiteit eenheden (0,65) vast is ingesteld (pijlpunt) en het percentage cellen abo ve de drempel werd bepaald. Na sensorische epitheel differentiatie weergegeven iMOP cellen een toename van 25,3% tot 67,1% van de cellen die Cdkn1b (figuur 6B). Dezelfde kwantitatieve analyse werd toegepast op iMOP afgeleide neuronen. Bij het vergelijken iMOP proliferatieve cellen (n = 525) en 7-dagen iMOP afgeleide neuronen (n = 583) een verschuiving naar rechts in het histogram geassocieerd met iMOP afgeleide neuronen waargenomen ten opzichte van het histogram van prolifererende iMOP cellen (Figuur 6C). Het bepalen van het percentage cellen boven de drempel onthulde een toename Cdkn1b expressie brengen van 23,5% tot 85,5% (figuur 6D). Met behulp van de beschreven protocollen kwantitatieve analyse van Cdkn1b expressie bevestigde een toename van het aantal cellen die Cdkn1b opwaarts reguleren tijdens sensorisch epitheel en neuronale differentiatie. De verhoogde aantallen Cdkn1b expressie brengende cellen kan worden gebruikt om differentiatie van iMOP cellen in deze protocollen bevestigen.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1. edu Incorporatie als een test om proliferatieve State bepalen van IMOP Cultures. IMOP afkomstige otospheres gekweekt in de aanwezigheid van bFGF. Kernen van cellen werden gelabeld met (A) en Hoechst (B) Samengevoegd beeld van Hoechst en Edu fluorescentie Edu AlexaFluor 488. (C). Otospheres gekweekt 3 dagen in de media ontbreekt bFGF. De cellen uit kweken werden gemerkt met (D) en Hoechst (E) EDU AlexaFluor 488. (F) Samengevoegde beelden van Hoechst en EDU labeling. Samengevoegd fluorescentiebeelden van Hoechst (magenta) en EDU (groen) gelabelde cellen na dissociatie otospheres en wassen met 1 x PBS bevattende 0,1% Tween 20. De cellen waren afkomstig otospheres gekweekt (G) in aanwezigheid van bFGF of (H) afwezigheid van bFGF. Lengte van de schaalbars 10 pm, tenzij. (I) Percentage EDU gelabelde cellen uit iMOP cellen gekweekt in aanwezigheid of afwezigheid van bFGF. Het aantal individuele cellen geanalyseerd werd aangeduid in de grafiek en de fout bars werden afgeschilderd als standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Celtellingen werden uit n = 5 onafhankelijke experimenten. De t-toets werd gedaan om statistische significantie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Algemene Schematische van Sensory epitheel Differentiatie. (A) Timeline voor differentiëren iMOP cellen in sensorische epitheel. De lijngrafiek geeft de tijd van de cel dissociatie en media verandert. (B) Typisch fasecontrastafbeeldingen otospheres op dag 0, (C) 3, (D) en 7 (E) gedurende 10 ongeleide sensorische epitheel differentiatie. Lengte van de schaal bar is 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Expressie van merkers Indicatieve van de celcyclus en de differentiatie in IMOP afgeleid Sensory epitheel. Otosphere van iMOP cellen gekweekt in iMOP cultuur media. Kernen van cellen werden gemerkt met (A) en Hoechst (B) Cdkn1b antilichaam. Filamenteus actine werd gemerkt met (C) phalloidin. (D) De gefuseerde beeld van een typische otospheres met prolifererende iMOP cellen. Otospheres van iMOP cellen werden gekweekt in sensorische epithelia voedingsbodems voor 10 dagen. Cellen van otopsheres zijn gemarkeerd met (E) Hoechst, (F) Cdkn1b en (G) phalloidin. (H) Samengevoegd beeld van otospheres met een toename van Cdkn1b en phalloidin etikettering. Prolifererende otospheres werden gemerkt met (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K) phalloidin. (L) De gefuseerde afbeelding toont een zwakke fluorescentie van deze markers. Otospheres gedifferentieerd in sensorische epitheel werden gemerkt met (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) phalloidin. (P) De gefuseerde afbeelding toont typische sterke Cdh1 en phalloidin etikettering. Lengte van de schaal bars zijn 10 micrometer tenzij anders aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Algemeen Schematische van neuronale differentiatie. (A) Timeline voor differentiëren iMOP cellen in neuronen. Fasecontrastbeelden van iMOP cellen die neuronale differentiatie bij (B) Dag 1, (C) 3, (D) en 5 (E) 7. Pijlpunten wijzen naar neurieten. Fluorescentie beelden van iMOP cellen gekweekt zoals otospheres in iMOP kweekmedium gelabeld met (F) en Hoechst (G) Cdkn1b. (H) Samengevoegd beeld van de cellen gelabeld met Hoechst en Cdkn1b. Fluorescentie beelden van iMOP cellen na 7 dagen van de cultuur in neuronale differentiatie media. Kernen van cellen werden gemerkt met (I) en Hoechst (J) Cdkn1b. (K) Samengevoegd beeld van de cellen gelabeld met Hoechst en Cdkn1b. Lengte van de schaal bars zijn 10 micrometer tenzij anders vermeld. OM / files / ftp_upload / 53.692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Expressie van moleculaire merkers Indicatieve van celcyclus Exit en neuronale differentiatie. IMOP cellen 7 dagen na neuronale differentiatie. Kernen werden gemerkt met (A) Hoechst, (B) Tubb3 (neuronaal β-tubuline) antilichamen tegen cellulaire morfologie en (C) Cdkn1b antilichamen te markeren. (D) samengevoegde afbeelding met de etikettering van Cdkn1b en Tubb3 in individuele cellen. Lengte van de schaal bar is 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OAD / 53.692 / 53692fig6.jpg "/>
Figuur 6. Single Cell Quantitative Fluorescence Intensity Analyse van Cdkn1b. (A) De genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van Cdkn1b expressie werd bepaald door de verhouding van Cdkn1b en Hoechst fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen. De genormaliseerde fluorescentie-intensiteit werd uitgezet ten opzichte van het aantal cellen als een histogram. Genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van Cdkn1b van prolifererende iMOP cellen gekweekt in de aanwezigheid van bFGF (zwart) en iMOP otospheres gedifferentieerd in sensorische epitheel (SE) (rood) getoond. Een drempel werd vastgesteld op 0,65 genormaliseerde fluorescentie-intensiteit eenheden (pijlpunt) (B) Percentage iMOP cellen die Cdkn1b boven de drempelwaarde van prolifererende (zwart) en sensorische epitheel gedifferentieerde culturen (rood). (C) Samengevoegd fluorescerende beeld van de sensorische epitheel gedifferentieerde iMOP cellen gelabeld met Hoechst en Myo6 antilichamen. (D (E) Percentage iMOP cellen die Cdkn1b uit prolifererende (zwart) en neuronale differentiatie culturen (rood). Afzonderlijke cellen voor analyse werden aangeduid in elke staafgrafiek. Resultaten werden samengesteld uit verschillende experimenten (n = 3) en foutbalken afgebeeld als SEM. De Student t-test werd gebruikt om de statistische significantie te bepalen. (F) Samengevoegd fluorescerende beeld van een bipolaire of pseudo-unipolaire-iMOP afgeleide neuronen gelabeld met Hoechst en Tubb3. Lengte van de schaal bars zijn 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celkweekvat | Suce Area (cm 2) | Aantal cellen uitgezet voor routineonderhoud | Aantal cellen gezaaid voor Sensory epitheel differentiatie | Aantal cellen gezaaid voor neuronale differentiatie | Scaling Factor Ten opzichte van 60 mm Dish | Volume van de gebruikte media (ml) | |
| Multwell Platen | |||||||
| 96 | 0.3 | 10.000 | 20.000 | 10,000-50,000 | 0,015 | 0.1 | |
| 24 | 2 | 90.000 | 180.000 | 100.000-150.000 | 0.100 | 0.5 | |
| 12 | 4 | 180.000 | 360.000 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500,000-750,000 | 0.500 | 2 | |
| Borden | |||||||
| 35 mm | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500.000 | 0.500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1.000.000 | 2.000.000 | 1,000,000-1,500,000 | 1,000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2.500.000 | 5.000.000 | 2,500,000- 3.000.000 | 3,000 | 8 | |
Tabel 1. aantal cellen voor het onderhoud van Differentiatie van IMOP Cellen in Various Tissue Culture Plate Formats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monitoring IMOP Cultures
Een protocol voor het handhaven zelfvernieuwing en differentiatie bevorderen van een nieuw iMOP cellijn wordt beschreven en aanvullende plating formaten worden opgenomen (tabel 1). Verschillende kritische stappen die helpen met routine expansie en differentiatie van iMOP cellen worden genoteerd. Vergelijkbaar met pluripotente stamcellen culturen, iMOP cellen hebben in theorie een onbeperkte levensduur. Opdat cellijnen goed worden onderhouden, zijn iMOP kweken routinematig gecontroleerd op levensvatbaarheid van cellen, zelfvernieuwing en differentiatie potentieel. Levensvatbaarheid van de cellen te bepalen na dissociatie, hanteren we trypaanblauw vlekken. In het algemeen meer dan 70% van de cellen levensvatbaar na dissociatie. Toezicht te houden op zelf-vernieuwing in iMOP cellen, immunokleuring met c-Myc en Sox2 antistoffen wordt gedaan. Onder proliferatieve kweekomstandigheden, iMOP cellen hebben een verdubbeling tijd van ~ 18 uur. Veranderingen in de expressie van zelf-vernieuwing markers of doenubling tijd zijn potentiële indicatoren van veranderde zelf-vernieuwing. Om de differentiatie potentieel van iMOP cellen celcyclus verlaten en expressie van beginnende markers voor sensorische epitheel of neuronen monitoren worden gebruikt om de differentiatie potentieel van de cellen te evalueren. Als iMOP cellen niet één van de hierboven beschreven criteria passen, verdient het aanbeveling om de kweken te beëindigen.
Variabelen die IMOP Cultures Affect
Een kritische stap in kweken iMOP cellen een actieve concentratie van bFGF in de kweken handhaven zelfvernieuwing bevorderen. bFGF is naar verluidt zeer labiel bij 37 ° C bij het kweken van cellen 29,30. Groei van kweken kan aanzienlijk worden beïnvloed door spontane differentiatie vanwege bFGF instabiliteit. In het huidige protocol wordt vers medium continu toegevoerd aan de kweken om bFGF niveaus boven 5 ng / ml te handhaven. Stabilisatie van bFGF niveaus met behulp van gecontroleerde afgifte vanglycolzuur en melkzuur polyester microbolletjes kan de frequentie van de media veranderingen die nodig zijn om stabiele niveaus van bFGF te handhaven in de media 31 te verminderen. Toevoeging van de gestaag vrijgeefbare bFGF zal de behoefte om regelmatig media aan bFGF niveaus in iMOP culturen te handhaven verminderen.
Een andere belangrijke stap bij het handhaven van de levensvatbaarheid van cellen iMOP is om blootstelling aan dissociatie reagentia en mechanische afschuiving beperken. In het huidige protocol is dissociatie bewerkstelligd door incubatie met 1 mM EDTA. Het terugdringen van overmatig incubatietijd met EDTA, waardoor overmatige mechanische afschuiving veroorzaakt door krachtig pipetteren en het beperken van meerdere centrifugeren stappen bij passage iMOP cellen zal helpen verhogen levensvatbaarheid van de cellen. Aandacht voor deze stappen kan effectief levensvatbaarheid van grote aantallen cellen handhaven tijdens expansie van culturen.
Tijdens de routine cultuur van iMOP cellen, werden verschillende methoden voor het dissociëren van de cellen getest. Mechanical scheren van pipetteren kan worden gebruikt om otospheres dissociëren, maar niet uniform en consistent produceren enkele cellen. Gebruik van commercieel beschikbare reagentia voor cellulaire dissociatie van iMOP cellen effectief kan genereren enkele cellen van otospheres, maar deze reagentia invloed hebben op de hechting van cellen om otospheres hervormen en zich te houden aan behandelde oppervlakken. Om commerciële reagentia te gebruiken, werden meerdere wasbeurten nodig om de dissociatie reagentia te verwijderen voordat het gebruik van differentiatie protocollen.
In de huidige differentiatie protocollen zowel sensorische epitheel en neuronale differentiatie omstandigheden resulteerde in celdood die werd waargenomen in de vorm van afzonderlijke cellen of klompjes dode cellen. Apoptotische celdood kan vanwege het gebrek aan geschikte differentiatie of overleving signalen tijdens de langdurige kweek in vitro. Beide differentiatie voorwaarden B27 aanvulling op overleving van cellen te bevorderen. Hoewel B27 supplement is aangetoond dat overleving van primaire hippocampale neuronen 32 te bevorderen, mogelijk niet voldoende voor het bevorderen van overleving van iMOP cellen. Toevoeging van verbindingen zoals ROCK inhibitor kan helpen handhaven en verhogen overleving van iMOP cellen tijdens routine cultuur in vitro differentiatie. ROCK inhibitor is uitgebreid gebruikt in pluripotente stamcel cultures overleving van cellen in serumvrije culturen zonder dat onderscheid 33. Toevoeging van ROCK inhibitor aan het kweekmedium kan helpen om celoverleving gedurende lange differentiatie protocollen zonder dat het differentiatievermogen van iMOP cellen. Verhoogde overleving van de cel zal de ontwikkeling van protocollen toestaan om efficiënt genereren van grote aantallen rijpe haarcellen of Sgns.
Toegenomen Cdkn1b Expression als een vroege marker van IMOP Differentiatie
Tijdens de vroege ontwikkeling van cochleaire de initiële gebeurtenis van de celcyclus exit voorafgaat differentiatie van haarcellen, het ondersteunen van cellen en Sgns 34. Terminal mitose van neuronale voorlopercellen verspreidt in een golf vanuit de basis en geleidelijk apex van het slakkenhuis 35. In een tegengestelde helling, terminal mitose van prosensory voorlopers die aanleiding geven tot haarcellen en steuncellen vordert vanaf de apex naar de basis van het slakkenhuis 34,36. Hoewel de temporale expressie van Cdkn1b goed correleert met de post-mitotische toestand is waarschijnlijk niet de enige factor die celcyclus exit in ontwikkelingslanden cochlea bevordert. Ter ondersteuning van deze, kan Cdkn1b gemuteerde dieren nog te ontwikkelen post-mitotische haarcellen 37. In plaats daarvan kan Cdkn1b worden gebruikt als een vroege indicator om het begin van differentiatie markeren. In ongeleide iMOP differentiatie culturen, zal een vroege merker voor differentiatie helpen bij het ontwikkelen protocols vroege stadia van differentiatie bevorderen voor de hand liggende morfologische kenmerken kunnen worden waargenomen. </ p>
Soortgelijke otic ontwikkeling cyclus exit initieert differentiatie en resulteert in verhoogde niveaus in iMOP Cdkn1b cellen. In delende cellen iMOP, kan alleen lage niveau van expressie van Cdkn1b worden waargenomen. Andere cycline afhankelijke kinase-remmers, zoals Cdkn1a (p21 CIP) verantwoordelijk kunnen zijn voor de normale voortgang van de celcyclus in iMOP cellen. Tijdens sensorische epitheel en neuronale differentiatie van cellen iMOP eencellige kwantitatieve analyse bleek een subset van cellen met expressie van Cdkn1b toename in differentiëren iMOP kweken (figuur 6A, C). Expressie van Cdkn1b in deze cellen een indicatie iMOP cellen die terminale differentiatie.
IMOP Cellen als een mobiele platform voor het bestuderen van de Cel Fate Bepaling
Aangezien iMOP cellen kunnen overgang van een progenitor staat om verschillende otic lijnen in vitro, kunnen zij worden gebruikt om otic lot van de cel te bestuderenbepaling. Momenteel, beschreven protocol ongeleide differentiatie procedures otic verschillende celtypen te genereren. Het iMOP systeem maakt toevoeging van bioactieve moleculen, verbindingen en bepaalde genen die iMOP cellen begeleiden naar de rijpe haarcel, ondersteunende cellen en SGN lineages. Eén gebruik van iMOP mobiele platform is om te testen voor de kandidaat transcripties factoren (TF) die differentiatie bevorderen. Expressie van TF sleutel kan worden gebruikt om het haar cel of neuronale differentiatie rijden. Expressie van Cdkn1b samen met gevestigde markers of morfologische kenmerken van haarcellen en Sgns kan worden gebruikt om de bijdrage van kandidaat TFS afzonderlijke otic lineages 38,39 bepaalt.
Kandidaat TFs zoals Atoh1 zijn essentieel voor haar cel ontwikkeling en zijn hergebruikt om haar celdifferentiatie te bevorderen in de beschadigde cochlea 40,41. Introductie van Atoh1 in iMOP cellen kunnen helpen bevorderen haar celdifferentiatie. In het developing slakkenhuis, zowel Ngn1 en NeuroD1 zijn vereist voor de juiste SGN differentiatie in vivo 42-44. Expressie van Ngn1 of NeuroD1 in iMOP cellen kunnen SGN differentiatie promoten. Deze experimenten zijn vergelijkbaar genereren geïnduceerde neuronale cellen (iN), waarbij expressie van het TF afzonderlijk of in combinatie fibroblasten of pluripotente stamcellen kunnen omzetten in neuronen 45-48. Introductie van TF's die normaal worden uitgedrukt tijdens de ontwikkeling van de haarcellen of Sgns is een goede strategie voor de begeleiding van iMOP cellen in de richting van het haar cel of SGN afstamming.
Omstandigheden die differentiatie van een groot aantal-iMOP afgeleide haarcellen en Sgns bevorderen vormen een solide mobiele platform ziektemodel, klein molecuul screening en toxicologische tests die snel kunnen worden uitgevoerd en kosteneffectief voor arbeidsintensieve testen bij knaagdieren worden geïnitieerd bieden . De beschreven protocol wordt een eenvoudig en veelzijdig systeem dat kan worden gebruikt voor studying otic voorlopercellen differentiatie en vatbaar is voor grootschalige experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
- Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
- Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
- Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
- Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
- Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
- Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
- Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
- Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
- Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314 (2013).
- Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
- Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
- Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
- Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
- Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
- Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
- Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289 (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
- Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
- Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
- Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
- Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
- Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).
