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Developmental Biology

Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

Published: January 2, 2016 doi: 10.3791/53692
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University
* These authors contributed equally

Protocol

1. El mantenimiento de auto-renovación en células PIMO

  1. Preparar PIMO medios de cultivo: DMEM / F12, 1X suplemento B27, 25 mg / ml y carbenecillin 20 ng / ml bFGF. Hacer 50 ml de PIMO medios de cultivo utilizando reactivos estériles. Calentar 49 ml de DMEM / F12 en una cónica de 50 ml en un baño de agua a 37 ° C.
    1. Suplemento Descongele 50X B27 y 100 mg / carbenecillin alícuotas de filtro esterilizado ml durante 5 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Descongelar 100 g / ml bFGF alícuota a RT. Añadir 1 ml de 50X B27, 10 l de 100 mg / ml bFGF y 12,5 l de 100 mg / ml carbenecillin en DMEM / F12.
  2. Utilice 3 ml de medio en un 60 mm placa de cultivo tisular de células PIMO cultivo. Añadir medio fresco a los cultivos cada dos días al duplicar el volumen de medios de comunicación. Asegúrese de que la concentración de bFGF no cae por debajo de 5 ng / ml.
    1. Células PIMO cultivo a 37 ° C con 5% de CO 2. Las células Passage después de 5 - 7 días en cultivo que se enumeran en los siguientes pasos. La cultura de transferencia a un 15ml cónica con una punta de pipeta de 10 ml.
  3. Hacer EDTA 1 mM en HBSS mediante la dilución de 0,1 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 en 50 ml de HBSS. Pre-caliente EDTA 1 mM hizo en HBSS en un 37 ° C baño de agua.
  4. Cosecha células por sedimentación por gravedad o centrifugación a 200 xg durante 5 min. a TA. Para sedimentación por gravedad, coloque el cónico de 15 ml que contiene las culturas en el 37 ° C incubadora durante 5 a 10 min. Después de ese tiempo, observan los otospheres recogen en la parte inferior de la cónica 15 ml.
    NOTA: la fuerza centrífuga excesiva puede causar daño celular.
  5. Cuidadosamente aspirado pasado multimedia usando una pipeta 2 ml de aspiración sin alterar el sedimento celular. Añadir 0,5 ml de la solución de pre-calentado 1 mM EDTA HBSS a la celda de pellets. Con una pipeta P1000, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces. Coloque cónica a 37 ° C y se incuba durante <5 min para facilitar la disociación en células individuales.
  6. Agite suavemente la solución de células para determinar si se disocian otospheres. Si no otoesferas de sedimentos para la parte inferior de la cónica, las células se disocian. El tiempo de incubación puede variar.
    NOTA: La prolongada incubación con EDTA puede provocar la muerte celular excesiva.
  7. Retire las células de 37 ° C, añadir 2 ml de medio para neutralizar y diluir el EDTA. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Aspirar diluyó EDTA utilizando una pipeta de 2 ml de aspiración y añadir 5 ml de 1X PBS para lavar las células.
  8. Girar las células hacia abajo a 200 xg durante 5 min a RT y aspirar a cabo 1X PBS usando una pipeta de 2 ml de aspiración. Resuspender las células por medio de una pipeta P1000 en 0,5 ml de medio de cultivo PIMO pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces.
  9. Contar las células utilizando un contador de partículas de microfluidos con los cassettes apropiados 28. Una placa confluente de células PIMO contendrá ~ 6 X10 6 células. Diluir las células 1: 100 en los medios de comunicación y añadir 75 ul de solución de células en el cassette para el conteo. Plate 1 x 10 6 células en una placa de 6 cm en PIMO culture medios de comunicación (~ 1: 10 de dilución). IMOPs Passage cada 5 - 7 días.
    NOTA: Las células que forman grandes otospheres o se adhieren a la parte inferior de la placa de cultivo de tejido va a diferenciar. Las células también se mueren si las culturas son más confluentes.

2. congelación y descongelación células PIMO

  1. Preparar medio de congelación sintética de descongelación y equilibrar la solución a 4 ° C antes de células de congelación.
  2. Recoger las células de un confluente placa de 6 cm de células PIMO. Usar una pipeta de 10 ml y las células de transferencia (~ 6 - 8 x 10 6 células) en un cónica 15 ml.
  3. Cosecha células por sedimentación por gravedad o centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Si los otospheres son pequeñas, las células no se asientan por sedimentación por gravedad. Opcional: Recuento de células utilizando el paso 1.9 para determinar el número de células totales.
  4. Aspirar pasó multimedia usando una pipeta 2 ml de aspiración, dejando el sedimento celular suelta atrás.
  5. Añadir 0,25 ml de medio de congelación sintéticos de volver a suspender ceLLS a una densidad de 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 células / ml. Pipetear suavemente las células con una pipeta P1000. Transferir la suspensión celular a viales criogénicos utilizando una pipeta P1000 con 1 ml filtradas punta.
  6. Colocar los viales en un recipiente de congelación libre de alcohol y coloque el recipiente de congelación a -80 ° C para reducir la temperatura de 1 ° C por minuto hasta que la temperatura alcanza -80 ° C.
  7. Para el almacenamiento a largo plazo de las células, la transferencia de los viales a la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Para descongelar las células para la cultura, equilibre vial criogénico que contiene células congeladas a -80 ° C.
  8. Pre-caliente medios de cultivo PIMO en un 37 ° C baño de agua.
  9. Descongele el vial congelado rápidamente agitando el fondo del vial en un 37 ° C baño de agua. Añadir 1 ml de medios de cultivo pre-calentado PIMO a las células descongeladas una vez que el cristal de hielo pasada desaparece. La transferencia de células en un ml cónica 15 y añadir otros 4 ml de PIMO medios de cultivo
  10. Gira la 15 ml conica durante 5 min. a 200 xg y aspirar los medios gastados. Resuspender las células en 2 ml de medio de cultivo PIMO y células de la placa en una placa de 6 cm. Incubar los cultivos a 37 ° C con 5% de CO 2 para la expansión.

3. Diferenciar las células PIMO en sensorial epitelios

  1. Preparar 50 ml de PIMO medio de diferenciación epitelios sensoriales: DMEM / F12, suplementos 1X B27, 25 mg / ml carbenecillin. Hacer 50 ml de medio de diferenciación PIMO sensorial epitelios. Calentar 49 ml de DMEM / F12 en una cónica de 50 ml en un baño de agua a 37 ° C. Suplemento de B27 Descongelar 50X y 100 mg / ml para carbenecillin alícuotas de 5 min. en un 37 ° C baño de agua. Añadir 1 ml de 50X B27 y 12,5 l de 100 mg / ml carbenecillin en DMEM / F12.
  2. Para cosechar, disociar, resuspender y contar células Repita los pasos 1,4 a 1,9
  3. Plate 1 x 10 6 células en una placa de 6 cm en el Día -3 utilizando PIMO medios de cultivo. En el Día 0, los cultivos de transferencia utilizando una pipeta de 10 ml en un cónica 15 ml. Recoger el otoesferas de sedimentación por gravedad como se indica en el paso 1.6. Aspirar pasó multimedia usando un 2 ml de aspiración pipeta y dejar las otospheres en la parte inferior de la cónica.
  4. Añadir suavemente en 2 ml de medio de diferenciación sensorial epitelios. Transferencia otospheres a un plato de 6 cm utilizando un gran ml pipeta de diámetro 10.
    NOTA: esquila mecánica de duras pipeteo puede disociar las células de los otospheres.
  5. Añadir 2 ml de los medios de comunicación sensorial diferenciación epitelial fresco a culturas cada dos días. Si es necesario, las células pueden ser recogidos por sedimentación por gravedad y los medios reemplazado.
  6. Recoger otospheres en el día 10 mediante la transferencia a un ml cónica 15 y permitiendo que los otospheres que sedimentan como se indica en el paso 1.6.Aspirate los medios de comunicación dedicado al uso de 2 ml de aspiración pipeta y dejan los otospheres sin ser molestados.
  7. Fijar otospheres incubando en 4% de formaldehído en PBS 1X durante 15 min a RT. Retire solución de formaldehído, lavar otospheres con tampón de lavado (1X PBS que contenía 0,1% Triton X-100) antes de incubar en tampón de bloqueo (1X PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y 0.1% de Triton X-100) durante 1 hora.
    1. Reemplazar tampón y se incuba las muestras en tampón de bloqueo con anticuerpo diluido. Se incuba a 4 ° C. Lávese las muestras con 1X PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 sujetos del otosphere a inmunotinción 27. Otospheres transferencia en 1X PBS y otospheres lugar en los medios de montaje sobre un portaobjetos de vidrio usando una pipeta P1000. Ponga un cubreobjetos sobre la muestra y permitir que los medios de montaje se sequen a 4 ° C.
  8. Adquirir imágenes de epifluorescencia utilizando una configuración de microscopio invertido equipado con una cámara CCD de 16 bits y, o bien un aire 20X 0.75 o una NA objetivo de inmersión en aceite 40X 1,3. Recoger fluorescencia de canales de color diferentes utilizando el longitudes de onda que aparece (excitación y emisión): azul (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rojo (562 ± 20 nm / y 625 20 nm ±) e infrarrojo (628 ± 20 nm / 692 ± 20 yNuevo Méjico).

4. Ensayo de EdU Incorporación

  1. En el Día -3, placa 1 x 10 6 células PIMO en un plato de 6 cm. Tres días más tarde en el día 0, cosecha, disociar, resuspender las células y contar por pasos 1,4-1,9 repetir.
  2. Placa de 2,5 x 10 5 células en medios de cultivo PIMO y 5 x10 5 células en medio de diferenciación sensorial epitelios en diferentes pocillos de una placa de 6 pocillos.
  3. Determinar el porcentaje de células en fase S mediante la incorporación EdU en día 3 mediante el uso de un ensayo de incorporación de EdU
    1. Añadir EdU acciones directamente a las culturas PIMO para obtener una concentración final de 1 mM EdU en los medios de cultivo.
    2. Incubar EdU en cultivos PIMO durante 2 horas y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Cosecha, disociar y recoger células repita los pasos 1.4-1.9. Añadir en 4% de formaldehído en PBS 1X durante 15 min. a temperatura ambiente para fijar las células. Cosecha células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Retire solución de formaldehído y properly deseche.
    3. Núcleos de la etiqueta de células con Hoechst y incorporados EdU con el verde de fluorescencia tinte azida de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      NOTA: Todos los lavados se realizan con 1X PBS, BSA al 3% y 0,1% de células Tween 20. Lave con 1X PBS dos veces.
    4. Células de montaje en una diapositiva utilizando antifade reactivo y coloque un vaso 1,5 cubierta sobre la muestra. Adquirir imágenes fluorescentes de células marcadas usando un microscopio de epifluorescencia.

5. Diferenciar neuronas PIMO-Derivado

  1. Hacer 50 ml de medio de diferenciación neuronal: medios Neurobasal, 1X suplemento B27, 2 mM L-glutamina. Botella Deshielo de 50X B27 y 200 mM de L-glutamina en 37 ° C baño de agua durante 5 minutos. Añadir 1 ml de 50X B27 y 0,5 ml de 200 mM de L-glutamina a 48,5 ml de medio Neurobasal.
  2. Escudo mediante la colocación de cubreobjetos redondos de 12 mm de 1,5 cubreobjetos de vidrio en una placa de 10 cm estéril y añadir 70% de EtOH a la placa para esterilizar y limpiar los cubreobjetos.
  3. Agitar suavemente la calarslips para asegurarse de que están cubiertos en etanol. Deja la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los cubreobjetos 3 veces con 1X PBS estéril para lavar el etanol restante. Enjuague el portaobjetos una vez con H 2 0 estéril para lavar restante 1X PBS.
  4. Aspirar el H 2 0 utilizando un 2 ml de aspiración pipeta y dejar que los cubreobjetos seco. Exponga los cubreobjetos a la luz UV en la campana de cultivo de tejidos de 15 min. Tienda cubreobjetos en un ambiente estéril si no se utiliza de inmediato.
  5. Coloque cubreobjetos uno 12 mm redondo en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Agitar suavemente la placa para asegurarse de que los cubreobjetos se acueste en el fondo del pozo.
  6. Descongelar 2 mg / ml de poli-D-lisina solución madre a TA y se diluye a un / ml de concentración de poli-D-lisina 10 mg en 1X PBS. Añadir 0,25 ml de 10 ug / ml de poli-D-lisina a los pocillos. Deja la placa en la incubadora a 37ºC durante 1 hora.
  7. Lavar los pocillos 3 veces con 1X PBS estéril. Descongele 10 mg solución de laminina / ml a temperatura ambiente y diluir a 10 g / ml en 1X PBS. Añadir 0,25 ml de 10 mg / ml de laminina solución de trabajo en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos múltiples. Incubar la placa a 37 ° C incubadora. Aspirar la solución laminina usando una pipeta 2 ml de aspiración.
  8. Lavar el cubreobjetos 3 veces con PBS 1X mediante la adición de 1 ml de PBS 1X con una pipeta P1000 y retirar el PBS 1X por aspiración con una pipeta de 2 ml de aspiración. Deja 1X PBS del último lavado en el pozo hasta que las células están listas para ser plateado. Iniciar la diferenciación neuronal por la cosecha, disociando y contando las células en los pasos células 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 en una placa de 6 cm en el Día -3.
  9. En el Día 0, cosecha, disociar y contar las células mediante la repetición de 1,4 a 1,9. Seed 1 x 10 5 - 1.5 x 10 5 células PIMO en 0,5 ml pre-calentado medio de diferenciación neuronal por pocillo en una placa de 24 pocillos múltiples. Aspirar y añadir precalentado medio de diferenciación neuronal de culturas cada dos días.
  10. Fijar neuronas derivadas de PIMO en formaldehído al 4% durante 15 min. lat RT en el Día 7. Retire solución de formaldehído, lavar neuronas derivadas de PIMO con tampón de lavado (1X PBS que contenía 0,1% Triton X-100) antes de incubar en tampón de bloqueo (1X PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y 0.1% de Triton X-100) durante 1 h.
    1. Reemplazar tampón y se incuba las muestras en tampón de bloqueo con anticuerpo diluido. Se incuba a 4 ° C. Lávese las muestras con 1X PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 células sometidas a inmunotinción 27. Lave el cubreobjetos con PBS 1X antes de colocar en soportes de montaje. Permita que los medios de montaje se sequen a 4 ° C antes de la adquisición de imágenes de epifluorescencia que se enumeran en el paso 3.8.

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Representative Results

bFGF Retiro disminuye la proliferación de células PIMO

Para disminuir la capacidad proliferativa de las células PIMO e iniciar la diferenciación de las células PIMO, bFGF fue retirado de los cultivos. Para confirmar que la retirada del factor de crecimiento disminuye la proliferación, la incorporación EdU fue empleado como un ensayo de proliferación. El porcentaje de células que incorporaba EdU de otospheres cultivadas con medios de cultivo PIMO (que contiene bFGF) y otospheres cultivadas en medios epitelios sensoriales (sin bFGF) se comparó. Culturas Otosphere se pulsaron con el análogo de nucleótido EdU, cosechadas y fija. Nucleótidos Incorporated EdU fueron fluorescente etiquetados con Alexafluor 488 azida utilizando click-química. Las células de otospheres cultivadas en ausencia de bFGF mostraron disminución de incorporación de EdU relación con las células cultivadas con bFGF (Figura 1A-F). A medida que el tamaño of el otosphere aumentó, era cada vez más difícil de visualizar todas las células de la otosphere con un microscopio de epifluorescencia. Para hacer frente a esto, las células fueron disociadas y montadas de modo que puedan ser visualizadas de forma inequívoca en masa. Incluso después de la disociación y la fijación, las células vuelven a agregarse. Para mantener las células en un estado disociado, detergentes que impedían que las células se vuelvan a agregación fueron probados. Tween 20 fue uno de los detergentes que impedían re-agregación de las células. Las células disociadas se lavaron con 0,1% de Tween 20 y se montaron en portaobjetos. Células marcadas fueron entonces EdU visualizaron por microscopía de epifluorescencia (Figura 1G, H). Los resultados representativos de los experimentos individuales (n = 5) mostraron una disminución significativa en el porcentaje de células marcadas EdU de 48% a 19% después de 3 días después de la retirada de bFGF (p <0,005). Estos resultados confirman una caída dramática en el porcentaje de células en fase S y el potencial proliferativo de las células después de PIMOretirada bFGF.

PIMO derivados sensorial epitelios expreso CDKN1B y espectáculo morfológica Cambios

Una cronología de PIMO protocolo de diferenciación epitelios sensoriales se muestra (Figura 2). Otospheres a partir de cultivos proliferativas se disociaron en células individuales y se dejaron recuperar durante 3 días en medios de cultivo PIMO. Este método ayuda a enriquecer para la proliferación de células y selecciona contra las células post-mitóticas en estas culturas de partida. Después de 3 días, otospheres recién formadas se sembraron en medio de diferenciación sensorial epitelios y se dejaron experimentar diferenciación no guiado durante 10 días. Imágenes de campo brillante de cultivos típicos que contienen otospheres en diferentes puntos temporales después de la siembra mostraron una disminución inicial en la talla antes de otospheres comienzan a aumentar de tamaño (Figura 2B-E).

27. Para determinar si la expresión de CDKN1B (p27 KIP) puede ser utilizado como un marcador para la diferenciación, se compararon otospheres a partir de cultivos PIMO epitelios diferenciado proliferativas o sensoriales. Marcadores fluorescentes se visualizaron y capturaron mediante microscopía de epifluorescencia. Imágenes representativas de otospheres de culturas proliferativas mostraron baja expresión de CDKN1B fuera de los núcleos con casi ninguna tinción phalloidin (Figura 3 dC). Otospheres cultivadas en medio de diferenciación sensorial epitelios muestran una mayor expresión de concomitante CDKN1B nuclear con la aparición de etiquetado faloidina en los bordes periféricos de las células (Figura 3 EH). En proliferan otospheres PIMO, Cdh1 (E-cadherin) y phalloidin están débilmente etiquetados (Figura 3 IL). En otospheres PIMO diferenciados, faloidina pronunciada y etiquetado Cdh1 resaltan los cambios morfológicos en los filamentos y las regiones de adhesión célula-célula (Figura 3 MP), similar a los resultados anteriores de 27 de actina. Durante la diferenciación epitelios sensoriales, los cambios morfológicos en los filamentos de actina en paralelo de la aparición de la expresión Cdh1 en sitios de adhesión entre las células. En este protocolo, el aumento en la expresión CDKN1B junto con los cambios en la faloidina y Cdh1 servir como indicadores tempranos de la diferenciación epitelios sensoriales en las células PIMO.

PIMO derivadas neuronas expreso CDKN1B y Tubb3

Un esquema del protocolo de diferenciación neuronal PIMO se muestra (Figura 4A). Al igual que en el protocolo anterior, las células PIMO fueron disociadas y Alguido a la recuperación durante 3 días en medios de cultivo PIMO. Otospheres se recogieron, se disocian en células individuales y se sembraron en poli-D-lisina y laminina cubreobjetos recubiertos. Las células se dejaron diferenciar durante 7 días. Imágenes de campo claro representante en puntos de tiempo muestran cambios morfológicos progresivos a medida que diferenciarse en neuronas derivadas de PIMO (Figura 4B-E). Por Día 7, neuritas largas se pueden ver que se extiende desde los cuerpos celulares (puntas de flecha Figura 4E). Para determinar los cambios en los niveles de expresión de CDKN1B durante la diferenciación neuronal, la proliferación de células PIMO y neuronas derivadas de PIMO se compararon. Otospheres fueron marcadas con anticuerpos Hoechst y CDKN1B. células PIMO de otospheres proliferan tenían pocas células con baja expresión CDKN1B nuclear (Figura 4 FH). Además, las neuronas derivadas de PIMO mostraron un aumento en el número de células con expresión nuclear CDKN1B 7 días después de la diferenciación neuronal (Figura 4IK). Para determinar si las células CDKN1B estaban adoptando un linaje neuronal, se llevó a cabo el etiquetado de neuronas derivadas de PIMO con el marcador neuronal Tubb3. Imágenes representativas de neuronas derivadas de PIMO mostraron co-etiquetado de CDKN1B y Tubb3 (Figura 5 dC). Magnificación y la cuantificación de las neuritas a partir de estas células mostraron un promedio de 1,5 neuritas asociados con cada Tubb3 etiquetados de células (n = 60) (Figura 5 EG). En nuestro protocolo de diferenciación neuronal, inmunotinción con CDKN1B y Tubb3 se puede utilizar como un indicador de la diferenciación en neuronas PIMO derivado bipolar o pseudo-unipolares.

Los niveles de expresión CDKN1B Nuclear Aumentar después de iniciar la diferenciación

Los cambios morfológicos en otospheres muestran cambios cualitativos en las células PIMO que sean sometidos a la diferenciación. Para lograr resultados cuantitativos de la Immuimágenes nofluorescence que denotan eventos de diferenciación temprana, la intensidad de fluorescencia nuclear de CDKN1B a partir de células individuales PIMO proliferante (n = 239) y células PIMO sometidos a la diferenciación epitelios sensoriales (n = 246) se midieron. Para normalizar las señales de fluorescencia CDKN1B de experimentos independientes, se determinó la proporción de CDKN1B Hoechst fluorescencia de las células individuales. Los histogramas de la intensidad de fluorescencia normalizada de CDKN1B de células proliferantes PIMO (negro) y epitelios sensoriales diferenciadores células PIMO (rojo) se representaron (Figura 6A). Se observó un aumento en el número de células que expresan altos CDKN1B como un desplazamiento hacia la derecha del histograma para la diferenciación de epitelios sensoriales (rojo) con respecto al histograma para las células proliferantes PIMO (negro). Para determinar el aumento en el porcentaje de células que expresan CDKN1B, un umbral para unidades de intensidad de fluorescencia normalizada CDKN1B (0.65) se establece (punta de flecha) y el porcentaje de células ABO ve el umbral se determinó. Después de la diferenciación epitelios sensoriales, células PIMO muestran un aumento de 25,3% a 67,1% de las células que expresan CDKN1B (Figura 6B). El mismo análisis cuantitativo se aplicó a neuronas derivadas de PIMO. Al comparar las células PIMO proliferativas (n = 525) y las neuronas PIMO derivado 7 día (n = 583) un desplazamiento hacia la derecha en el histograma asociado con las neuronas PIMO derivado se observó en relación con el histograma para la proliferación de células PIMO (Figura 6C). Determinar el porcentaje de células por encima del umbral reveló un aumento en las células que expresan CDKN1B de 23,5% a 85,5% (Figura 6D). Usando los protocolos descritos, el análisis cuantitativo de la expresión CDKN1B confirmó un aumento en el número de células que regulan al alza durante CDKN1B epitelios sensoriales y la diferenciación neuronal. El aumento del número de células que expresan CDKN1B se pueden utilizar para confirmar la diferenciación de las células PIMO en estos protocolos.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
Figura 1. EdU incorporación como un ensayo para determinar proliferativa Estado de culturas PIMO. PIMO derivado otospheres cultivadas en presencia de bFGF. Los núcleos de las células se marcaron con (A) y Hoechst (B) EdU Alexafluor 488. (C) imagen fusionada de Hoechst y EdU fluorescencia. Otospheres cultivaron 3 días en medios que carecen de bFGF. Las células de las culturas fueron etiquetados con (D) Hoechst y (E) EdU Alexafluor 488. (F) imágenes fusionadas de etiquetado Hoechst y Edu. Imágenes de fluorescencia de Hoechst fusionadas (magenta) y EdU (verde) después de disociar células marcadas otospheres y lavado con 1X PBS que contenía 0,1% de Tween 20. Las células fueron cultivadas a partir de otospheres (G) en presencia de bFGF o (H) ausencia de bFGF. Longitud de la escalabares son 10 micras menos que se indique. (I) por ciento de EdU células a partir de células PIMO cultivadas en presencia o ausencia de bFGF etiquetado. El número de células individuales analizados fue designado dentro de las barras del gráfico de barras de error y se representa como el error estándar de la media (SEM). Los recuentos de células eran de n = 5 experimentos independientes. Prueba t de Student se realizó para determinar la significación estadística. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquema general de sensorial epitelios Diferenciación. (A) Plazo para la diferenciación de las células PIMO en epitelios sensoriales. El gráfico de línea de puntos marca el momento de la disociación celular y cambios de medios de comunicación. (B) de contraste de fases típicaimágenes de otospheres en el Día 0, (c) 3, (D) 7 y (E) 10 durante la diferenciación sin guía epitelios sensoriales. Longitud de barra de escala es de 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Expresión de marcadores indicativos de la detención del ciclo celular y la diferenciación en PIMO derivados sensorial epitelios. Otosphere de células PIMO cultivadas en medios de cultivo PIMO. Los núcleos de las células se marcaron con (A) y el anticuerpo Hoechst (B) CDKN1B. Actina filamentosa se ​​marcó con (C) faloidina. (D) La imagen resultante de la fusión de un otospheres típicos que contienen células PIMO proliferante. Otospheres de células PIMO se cultivaron en epith sensorialelia medios de cultivo durante 10 días. Las células de otopsheres fueron marcados con (E) Hoechst, (F) y CDKN1B (G) faloidina. (H) Imagen Fusionada de otospheres mostrando aumentó CDKN1B y etiquetado faloidina. Otospheres proliferantes se marcaron con (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K) faloidina. (L) La imagen combinada muestra fluorescencia débil de estos marcadores. Otospheres diferenciadas en los epitelios sensoriales también se marcaron con (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) faloidina. (P) La imagen combinada muestra fuerte etiquetado típica Cdh1 y faloidina. Longitud de barras de escala son 10 micras menos que se indique. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Esquema General de Diferenciación Neuronal. (A) Plazo para la diferenciación de las células PIMO en neuronas. Imágenes de contraste de fase de células PIMO sometidos a la diferenciación neuronal en (B) Día 1, (C) 3, (D) 5 y (E) 7. Puntas de flecha apuntan a neuritas. Las imágenes de fluorescencia de las células cultivadas como PIMO otospheres en medios de cultivo PIMO marcados con (F) y Hoechst (G) CDKN1B. (H) Imagen Fusionada de células marcadas con Hoechst y CDKN1B. Imágenes de fluorescencia de células PIMO después de 7 días de cultivo en medio de diferenciación neuronal. Los núcleos de las células se marcaron con (I) y Hoechst (J) CDKN1B. (K) Imagen Fusionada de células marcadas con Hoechst y CDKN1B. Longitud de barras de escala son 10 micras menos que se indique. om / archivos / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Expresión de Marcadores Moleculares indicativa de salida del ciclo celular y neuronal Diferenciación. PIMO células 7 días después de la diferenciación neuronal. Los núcleos fueron etiquetados con (A) anticuerpos Hoechst, (B) Tubb3 (neuronal β-tubulina) para resaltar la morfología celular y los anticuerpos (C) CDKN1B. (D) Imagen combinada con etiquetado de CDKN1B y Tubb3 en celdas individuales. Longitud de barra de escala es de 20 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6. Single Cell cuantitativa de fluorescencia análisis de intensidad de CDKN1B. (A) Intensidad de fluorescencia normalizada de expresión CDKN1B se determinó mediante el cálculo de la relación de CDKN1B y Hoechst intensidad de fluorescencia de las células individuales. La intensidad de fluorescencia normalizada se representó gráficamente en relación con el número de células como un histograma. La intensidad de fluorescencia normalizada de CDKN1B de la proliferación de células PIMO cultivadas en presencia de bFGF (negro) y otospheres PIMO diferenciado en epitelios sensoriales (SE) (rojo) se muestran. Un umbral se fijó en 0,65 unidades normalizadas de intensidad de fluorescencia (punta de flecha) (B) Porcentaje de células que expresan PIMO CDKN1B por encima del valor umbral, la proliferación (negro) y las culturas epitelios sensoriales diferenciados (rojo). (C) Fusionada imagen fluorescente de células epiteliales diferenciadas PIMO sensoriales marcadas con anticuerpos Hoechst y Myo6. (D (E) El porcentaje de células que expresan PIMO CDKN1B proliferen (negro) y cultivos neuronales diferenciar (rojo). Las células individuales utilizados para el análisis se indican en cada gráfico de barras. Los resultados se compilan a partir de diferentes experimentos (n = 3) y las barras de error representan como SEM. Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística. (F) Fusionada imagen fluorescente de bipolar o neuronas PIMO derivados pseudo unipolar marcados con Hoechst y Tubb3. Longitud de barras de escala son 20 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cultivo Celular Embarcaciones Surface Área (cm2) Número de células sembradas para el mantenimiento rutinario Número de células sembradas para sensorial epitelios Diferenciación Número de células sembradas para la diferenciación neuronal Escala relativa Factor de 60 mm Plato Volumen de los medios de comunicación usados ​​(ml)
Placas Multwell
96 0.3 10000 20000 10.000-50.000 0,015 0.1
24 2 90000 180000 100.000-150.000 0,100 0.5
12 4 180000 360000 300,000 0,200 1
6 10 500000 1000000 500,000-750,000 0,500 2
Platos
35 mm 10 500000 1000000 500000 0,500 2
60 mm 20 1000000 2000000 1,000,000-1,500,000 1,000 3
100 mm 60 2500000 5000000 2,500,000- 3000000 3,000 8

Tabla 1. Números de Teléfonos de Mantenimiento de diferenciación de las células PIMO en VarFormatos de Cultura de placas de tejido pagarés.

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Discussion

Monitoreo de Cultivos PIMO

Un protocolo para el mantenimiento de auto-renovación y promoción de la diferenciación de una novela línea celular PIMO se describe y formatos de chapado adicionales se incluyen (Tabla 1). Se observan varios pasos críticos que ayudan con la expansión de la rutina y la diferenciación de las células PIMO. Al igual que en cultivos de células madre pluripotentes, células PIMO teóricamente tienen una vida útil indefinida. Para asegurarse de que las líneas celulares se mantienen adecuadamente, culturas PIMO se monitorizan de forma rutinaria para la viabilidad celular, auto-renovación y diferenciación potencial. Para determinar la viabilidad celular después de la disociación, empleamos tinción con azul tripán. En general, más del 70% de las células son viables después de la disociación. Para supervisar la auto-renovación en células PIMO, inmunotinción con anticuerpos Sox2 c-Myc y se hace. Bajo condiciones de cultivo de proliferación, las células PIMO tienen un tiempo de duplicación de ~ 18 hr. Las alteraciones en la expresión de marcadores de auto-renovación o hacertiempo ubling son indicadores potenciales de auto-renovación alterado. Para monitorizar el potencial de diferenciación de las células PIMO, salida del ciclo celular y la expresión de marcadores de etapa temprana para epiteliales sensoriales o neuronas se utiliza para evaluar el potencial de diferenciación de las células. Si las células PIMO no pasan cualquiera de los criterios descritos anteriormente, sería conveniente poner fin a las culturas.

Las variables que afectan Culturas PIMO

Un paso crítico en el cultivo de células PIMO es mantener una concentración activa de bFGF en las culturas para promover la auto-renovación. bFGF es según se informa altamente lábil a 37 ° C cuando el cultivo de células 29,30. Crecimiento de las culturas puede verse afectada de manera significativa por la diferenciación espontánea debido a la inestabilidad bFGF. En el protocolo actual, medio fresco se suministra constantemente a los cultivos con el fin de mantener los niveles por encima de bFGF 5 ng / ml. La estabilización de los niveles de bFGF usando liberación controlada deglicólico y microesferas de poliéster de ácido láctico podría reducir la frecuencia de cambios de los medios necesarios para mantener niveles estables de bFGF en los medios de comunicación 31. La adición de la constante liberable bFGF reducirá la necesidad de añadir frecuentemente medios de comunicación para mantener los niveles de bFGF en las culturas PIMO.

Otro paso fundamental en el mantenimiento de la viabilidad de las células PIMO es limitar la exposición a los reactivos de disociación y cizallamiento mecánico. En el protocolo actual, la disociación se lleva a cabo por incubación con EDTA 1 mM. Frenar el tiempo de incubación excesivos con EDTA, reduciendo esquila mecánica excesiva causada por pipeteo vigoroso y limitando múltiples etapas de centrifugación cuando pases células PIMO ayudará a aumentar la viabilidad celular. Atención a estos pasos puede mantener con eficacia viabilidad de un gran número de células durante la expansión de las culturas.

Durante el cultivo de rutina de las células PIMO, se probaron varios métodos para disociar las células. Mechanesquila iCal de pipeteado se puede utilizar para disociar otospheres, pero no de manera uniforme o consistentemente producen células individuales. El uso de reactivos disponibles comercialmente para la disociación celular de las células PIMO puede generar eficazmente las células individuales de otospheres, pero estos reactivos afectar a las propiedades adhesivas de las células para reformar otospheres y para adherirse a las superficies tratadas. Con el fin de utilizar reactivos comerciales, se requieren múltiples lavados para eliminar los reactivos de disociación antes de emplear protocolos de diferenciación.

En los protocolos de diferenciación actuales, tanto en condiciones epitelios sensoriales y diferenciación neuronal resultó en la muerte celular que se observó en la forma de células individuales o grupos de células muertas. La muerte celular apoptótica podría ser debido a la falta de diferenciación o supervivencia señales apropiadas durante el cultivo prolongado in vitro. Ambas condiciones de diferenciación contenidas suplemento de B27 para promover la supervivencia de las células. Aunque B27 suplement se ha demostrado para promover la supervivencia de las neuronas del hipocampo primarias 32, puede no ser suficiente para promover la supervivencia de las células PIMO. La adición de compuestos tales como el inhibidor de la roca puede ayudar a mantener y aumentar la supervivencia de las células PIMO durante el cultivo de rutina y en la diferenciación in vitro. Inhibidor de roca ha sido utilizado ampliamente en cultivos de células madre pluripotentes para promover la supervivencia de las células en cultivos libres de suero sin afectar la diferenciación 33. La adición del inhibidor de la ROCA de los medios de cultivo puede ayudar a aumentar la supervivencia celular durante protocolos de diferenciación largos sin afectar el potencial de diferenciación de las células PIMO. El aumento de la supervivencia celular permitirá el desarrollo de protocolos para generar eficientemente un gran número de células ciliadas maduros o NEG.

El aumento de la expresión CDKN1B como un marcador temprano de diferenciación PIMO

Durante el desarrollo coclear temprano, el evento inicial de la célulasalida del ciclo precede a la diferenciación de las células ciliadas, células de apoyo y NEG 34. Mitosis Terminal de progenitores neuronales se extiende en una ola a partir de la base y progresando hacia el vértice de la cóclea 35. En un gradiente opuesto, la mitosis de terminal de progenitores prosensoriales que dan lugar a células ciliadas y células de soporte que avanza desde el ápice a la base de la cóclea 34,36. Aunque la expresión temporal de CDKN1B se correlaciona bien con el estado post-mitótico, es más probable no el único factor que promueve la salida del ciclo celular en la cóclea en desarrollo. En apoyo de esto, CDKN1B animales mutantes todavía pueden desarrollar células ciliadas post-mitóticas 37. En su lugar, CDKN1B se puede utilizar como un indicador temprano para marcar el inicio de la diferenciación. En las culturas de diferenciación PIMO no guiados, un marcador temprano de la diferenciación ayudará en el desarrollo de protocolos para promover primeras etapas de diferenciación antes se pueden observar características morfológicas evidentes. </ p>

Al igual que en el desarrollo ótica, la salida del ciclo inicia la diferenciación y resulta en aumento de los niveles CDKN1B en células PIMO. En células proliferantes PIMO, sólo el bajo nivel de expresión de CDKN1B se puede observar. Otros inhibidores de quinasa dependientes de ciclina tales como Cdkn1a (CIP p21) pueden ser responsables de progresión normal del ciclo celular en células PIMO. Durante epitelios sensoriales y la diferenciación neuronal de las células PIMO, el análisis cuantitativo de células individuales reveló un subconjunto de células con aumento de expresión de CDKN1B en la diferenciación de las culturas PIMO (Figura 6A, C). Expresión de CDKN1B en estas células son una indicación de las células PIMO sometidos a la diferenciación terminal.

Las células PIMO como una plataforma móvil para el estudio de la célula destino Determinación

Dado que las células PIMO pueden pasar de un estado progenitor a diferentes linajes óticas in vitro, pueden ser utilizados para estudiar el destino celular óticadeterminación. En la actualidad, el protocolo descrito utiliza procedimientos de diferenciación no guiados para generar diferentes tipos de células óticas. El sistema PIMO permite la adición de moléculas bioactivas, compuestos y genes definidos que guían células PIMO hacia la célula de pelo madura, de células de apoyo y linajes SGN. Un uso de la plataforma celular PIMO es poner a prueba los factores transcripciones candidatos (TF) que promueven la diferenciación. La expresión de TF clave se puede utilizar para conducir la célula de pelo o la diferenciación neuronal. Expresión de CDKN1B junto con marcadores establecidos o características morfológicas de las células de pelo y NEG se puede utilizar para determinar la contribución de TFS candidatos a los linajes distintos óticas 38,39.

TFS candidatos como Atoh1 son esenciales para el desarrollo de las células del cabello y han sido reutilizados para promover la diferenciación de las células ciliadas de la cóclea dañada 40,41. Introducción de Atoh1 en las células PIMO puede ayudar a promover la diferenciación de las células ciliadas. En el developing cóclea, tanto Ngn1 y NeuroD1 se requieren para la diferenciación SGN adecuada in vivo 42-44. Expresión de Ngn1 o NeuroD1 en células PIMO puede promover SGN diferenciación. Estos experimentos son similares a la generación de células neuronales inducidas (In), donde la expresión de los TFs individualmente o en combinación puede convertir fibroblastos o células madre pluripotentes en neuronas 45-48. Introducción de TFS que se expresan normalmente durante el desarrollo de las células ciliadas o NEG es una buena estrategia para guiar células PIMO hacia la célula de pelo o SGN linaje.

Las condiciones que promueven la diferenciación de un gran número de células y NEG pelo PIMO derivado proporcionarán una plataforma celular robusto para el modelado de la enfermedad, la detección de moléculas pequeñas y las pruebas de toxicología que se puede lograr de forma rápida y efectiva en costo antes de iniciar las pruebas de mano de obra intensiva en roedores . El protocolo descrito presenta un sistema simple y versátil que puede ser utilizado para studying diferenciación progenitora ótica y es susceptible de experimentos a gran escala.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers BioCision BCS-405
Cryogenic Vials (2 ml)  Corning 430654
1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) Electron Microscopy Sciences 72230-01
DMEM/F12 Life Technologies 11320-082
Neurobasal Medium Life Technologies 21103
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 Life Technologies 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025-092
B27 Supplement (50X) Serum Free Life Technologies 17504-044 Stored as 1 ml aliquots
L-Glutamine(200 mM)  Life Technologies 25030-081 Stored as 5 ml aliquots
Natural Mouse Laminin Life Technologies 23017-015 Stored as 1 mg/ml aliquots
Click-iT EdU Alexa Fluor 488  Life Technologies C10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation Media Life Technologies A12542-01
Prolong Gold Antifade Mountant Life Technologies 47743-736 Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Moxi Z Mini Automated Cell Counter Orflo  MXZ001
Moxi Z Cassette Type S Orflo  MXC002
Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) Peprotech 450-33 Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots
Poly-D-Lysine Sigma P7886 Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher Scientific BP2648-1 Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots
5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811D
10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130188
Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130184 
Tissue Culture Treated 6 cm Dish Thermo Fisher Scientific 130181 
EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm Thermo Fisher Scientific SLGV033RS
TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip USA Scientific 1120-3810
TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip USA Scientific 1120-1810
TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl  filter tip USA Scientific 1120-8810
TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip USA Scientific 1126-7810
15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1475-0511
50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1500-1211

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Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).

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